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方法文章

离体 基于OCT的多模态成像技术用于年龄相关性黄斑变性的人类供体眼研究

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DOI：

10.3791/65240

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2023年5月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

实验室检测可利用基于光学相干断层扫描（OCT）的年龄相关性黄斑变性（AMD）多模态纵向成像的预后价值。在组织切片前，对患有和不患有AMD的人类供体眼球分别进行OCT、彩色成像、近红外反射扫描激光检眼镜以及两种激发波长下的自发荧光成像。

摘要

从基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床影像中学习到的年龄相关性黄斑变性（AMD）进展序列，可为实验室研究结果提供额外的预后价值。在本研究中， 离体 OCT 和 MMI 在人眼供体视网膜组织切片前应用于眼球。眼球取自年龄 ≥80 岁的非糖尿病白人供体，死亡至保存时间（DtoP）≤6 小时。眼球在原地获取后，使用 18 mm 环钻进行划痕以方便角膜移除，并浸入缓冲的 4% 多聚甲醛中。在移除前节结构后，使用解剖显微镜和单反相机，通过透射、反射及闪光照明在三种放大倍数下获取彩色眼底图像。眼球被置于定制设计的腔室内的缓冲液中，腔室配备 60 屈光度透镜。随后使用谱域 OCT（30° 黄斑立方体扫描，30 µm 间距，平均次数 = 25）、近红外反射、488 nm 自发荧光和 787 nm 自发荧光进行成像。年龄相关性黄斑变性（AMD）眼球显示视网膜色素上皮（RPE）改变，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs），伴或不伴有新生血管，且无其他病因证据。2016 年 6 月至 2017 年 9 月期间，共获取 94 只右眼和 90 只左眼（DtoP：3.9 ± 1.0 小时）。在 184 只眼球中，40.2% 存在 AMD，包括早期或中期（22.8%）、萎缩型（7.6%）和新生血管型（9.8%）AMD，39.7% 黄斑区无明显异常。通过 OCT 鉴定出玻璃膜疣、SDDs、高反射灶、萎缩区域和纤维血管瘢痕。观察到的伪影包括组织混浊、脱离（杆锥层、视网膜、RPE、脉络膜）、中心凹囊样改变、RPE 波浪状形态以及机械性损伤。为指导冷冻切片，OCT 体积数据用于定位中心凹和视盘解剖标志以及特定病理改变。 离体 体积通过以下方式进行了配准 体内 通过选择眼动追踪的参考函数来确定体积。 离体 病理表现的可见度 体内 取决于保存质量。在16个月内，通过临床MMI方法获取并分期了75例处于AMD各阶段的快速DtoP供体眼。

引言

在光学相干断层扫描（OCT）指导下，采用抗VEGF疗法管理新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）已有十五年，这为这一常见致盲病因的进展顺序和微观结构提供了新的认识。其中一项重要认识是，AMD是一种涉及神经感觉视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜的三维疾病。通过对临床试验患者以及接受治疗患者的对侧眼进行OCT成像，现已认识到超出彩色眼底摄影（数十年来的临床标准）所见的多种病理特征。这些特征包括视网膜内新生血管（3型黄斑新生血管1，曾称为血管样增生）、视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs，亦称网状假性玻璃膜疣）2、RPE命运的多种演变途径3,4，以及在萎缩区域中显著胶质化的Müller细胞5,6。

缺乏黄斑（细胞和动物）的模型系统可重现这种复杂疾病的某些方面7,8,9。进一步减轻年龄相关性黄斑变性（AMD）负担的成功可能源于在人眼中发现并探索其原发性病理，理解黄斑独特的细胞组成，随后将其转化至模型系统中。本报告描述了一个学术研究实验室与眼库之间长达三十年的合作。本文所述组织表征方法的目标有两个：1）通过显微镜揭示眼底外观及成像信号来源的基础，从而推动诊断技术的发展；2）对AMD样本进行分类，以用于靶向（免疫组织化学）和非靶向分子发现技术（成像质谱，IMS，以及空间转录组学），同时保留仅含视锥细胞的中央凹及富含视杆细胞的旁中央凹和周边中央凹区域。此类研究可加速向临床光学相干断层扫描（OCT）的转化，后者可通过眼动追踪实现病程序列的观察和纵向随访。该技术旨在监测治疗效果，利用视网膜血管将一次门诊检查的扫描图像与下一次门诊的扫描图像进行配准。将眼动追踪OCT与实验室中通过破坏性技术获得的结果关联起来，可为分子发现提供新的预后价值。

1993年，该研究实验室在胶片上拍摄了死后眼底的彩色照片10这一工作受到福斯（Foos）及其同事对人眼周边视网膜出色的显微摄影与组织学研究的启发11,12,13 以及Sarks等人对年龄相关性黄斑变性的广泛临床病理学相关性研究14,15自2009年起， 离体 采用以谱域光学相干断层扫描为核心的多模态成像（MMI）。这一转变受到其他研究者类似工作的启发16,17 尤其是由于意识到萨克斯所描述的大量超微结构在临床中能够以三维形式随时间动态呈现18,19目标是在合理的时间范围内获取附有黄斑的眼球，以开展视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜细胞水平表型的高统计效能研究。旨在超越以往的研究局限 "每只眼" 统计学 "按病变类型" 受以下因素影响的标准 "易损斑块" 心血管疾病相关概念20,21.

本报告中的实验方案基于对近400对供体眼球的处理经验，这些眼球通过多个渠道收集。2011年至2014年间，建立了年龄相关性黄斑变性（AMD）组织病理学的Project MACULA网站，其中包含了来自142例存档样本的视网膜层厚度数据和注释信息。这些眼球于1996年至2012年间使用戊二醛-多聚甲醛固定液保存，用于高分辨率环氧树脂组织学和电子显微镜检查。所有眼球在接收时均拍摄了彩色眼底图像，并在组织学处理前重新进行了光学相干断层扫描（OCT）成像。采用最初为视神经研究设计的眼球固定装置22 ，以黄斑中心凹为中心，获取直径为8 mm的全层组织穿孔样本。穿过黄斑中心凹及上方2 mm位置的OCT B扫描图像（与相应层次的组织学切片对应）以及彩色眼底照片均上传至该网站。OCT扫描平面的选择依据是黄斑下区域AMD病理改变的显著性23 ，以及黄斑上方视杆细胞丰富区域中沉着物（SDDs）的明显表现24,25。

自2013年起，生前接受过OCT锚定多模式成像（MMI）的眼球可用于直接进行临床病理学对照研究。大多数供体（10名中的7名）来自视网膜专科转诊诊所（作者：K.B.F.），该诊所为有意在去世后捐献眼球用于科研的患者提供生前预嘱登记服务。眼球由当地眼库采集并保存，随后转移至实验室，并以与Project MACULA眼球相同的方式进行处理。生前的临床OCT图像数据可直接在实验室读取，从而将生前观察到的病理特征与显微镜下所见特征精确对应26。

自2014年起，开始前瞻性采集眼组织，通过筛查无临床病史但于限定时间内（6小时）保存的供体眼球中的年龄相关性黄斑变性（AMD）。为此，对眼球固定装置进行了改进，以容纳完整的眼球，从而减少了此前使用8 mm打孔器时切缘周围发生脱离的风险。眼球采用4%缓冲甲醛固定液进行固定，用于免疫组织化学分析，并于次日转移至1%固定液中长期保存。在2016至2017年（疫情前时期），共采集了来自90名供体的184只眼球。本报告中的统计数据和图像均来源于该系列样本。在大流行期间（2020年封锁及后续阶段），针对转录组学和成像质谱（IMS）合作项目的前瞻性采集工作以较慢节奏持续进行，基本沿用2014年的方法。

目前已有其他用于供体眼球评估的方法。明尼苏达分级系统（Minnesota Grading System, MGS）27,28 基于年龄相关性眼病研究（AREDS）的彩色眼底照相临床分类系统29。该方法的局限性包括将萎缩型和新生血管型年龄相关性黄斑变性（AMD）合并为“晚期AMD”一个阶段"late AMD"。此外，MGS要求在对视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜进行摄影记录前，先去除神经感觉视网膜。此步骤会导致视锥视杆细胞外节沉积物（SDDs）不同程度地移位30,31 ，并破坏外层视网膜与其支持系统之间的空间对应关系。因此，试图将视网膜的代谢需求及信号传导与RPE-脉络膜的病理变化相联系的研究可能受到阻碍。犹他系统（Utah System）采用离体（ex vivo）彩色摄影和光学相干断层扫描（OCT）技术，将用于解剖的眼球划分为不同区域，以进行RNA和蛋白质提取32。尽管该方法优于全眼杯组织提取，但其针对AMD进展最高风险区域的取材范围仅为直径3 mm，而这一区域仅占以黄斑中心凹为中心、直径6 mm的圆形组织切片面积的25%33,34 。因此，能够以黄斑中心凹为参照定位病变位置的技术（例如用于免疫组织化学分析的连续切片）更具优势。

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方案

伯明翰阿拉巴马大学的机构审查委员会批准了本实验室研究，该研究遵循优良实验室规范以及生物安全二级/二级以上标准。所有美国眼库均符合2006年《统一解剖赠与法案》和美国食品药品监督管理局的规定。大多数美国眼库（包括Advancing Sight Network）均符合美国眼库协会的医学标准。

材料表 列出了所需的耗材和设备。补充材料1 概述了组织解剖、彩色眼底摄影以及基于光学相干断层扫描（OCT）的微血管成像（MMI）。补充材料2 提供了基于OCT的MMI的详细信息。

1. 组织采集的标准

  1. 为了在未记录信息的供体筛选中最大化获得年龄相关性黄斑变性（AMD）眼睛的产量，应设定以下可接受供体的标准：年龄 ≥80 岁、白人、非糖尿病患者，且死亡至保存时间（DtoP）≤6 小时。
    注：DtoP 定义为死亡时间与眼球被放入所提供的保存液之间的时间间隔，保存操作可在医院或实验室进行。

2. 保存液及其他准备工作（实验室）

  1. 从20%储备液（购买）配制4%磷酸盐缓冲多聚甲醛。取200 mL 20%多聚甲醛（稀释倍数为5）加入800 mL 0.1 M Sorenson磷酸盐缓冲液中，制备1 L溶液。必要时检测并调节pH至7.2。4 ˚C保存。
  2. 将30 mL 4% 磷酸盐缓冲多聚甲醛加入40 mL样品瓶中。
  3. 在眼库中，将贴有标签的40 mL防腐剂容器作为储备，以便随时在任何一天取用组织。
  4. 用于保存眼球的1%多聚甲醛溶液，需从4%溶液稀释制备。取250 mL 4%多聚甲醛（稀释倍数为4），加入750 mL 0.1 M Sorenson磷酸盐缓冲液，定容至1 L。必要时检测并调节pH值。4 ˚C保存。
    1. 将500 mL蒸馏水与500 mL Sorenson's磷酸盐缓冲液（0.2 M，pH 7.2）混合，配制1 L的0.1 M Sorenson's磷酸盐缓冲液溶液。
    2. 使用1 N盐酸或1 N氢氧化钠逐滴调节pH。4 ˚C保存。
  5. 制作一个用于在解剖过程中稳定眼球的支架。将加热至液态的牙科蜡倒入培养皿中。当蜡稍冷却后，用一个较大的钢珠在其表面压出半球形凹痕，然后将培养皿冷冻，以便取出钢珠。

3. 眼库方法

  1. 为确保研究用组织的快速获取，需迅速回收所有组织，包括拟用于移植的组织。
  2. 依法在死亡后1小时内接收死亡转介，并使用随组织流转的转介序号对每位供体进行追踪。
  3. 为发现具有潜在临床资料的病例，在研究用供体风险评估访谈中，应询问与年龄相关性黄斑变性（AMD）及眼病相关的特异性问题。
  4. 为尽量缩短运输时间，在较小地理范围内（即城市及邻近郊区县）现场回收完整眼球（而非仅回收用于移植的角膜）。
  5. 前往死者所在医院病房进行组织获取时，应携带两瓶固定液（含缓冲液的4%多聚甲醛），而非等待遗体转移至太平间后再进行操作。
  6. 在获取组织前及过程中，需与研究人员保持沟通，确认样本交付方式与时间安排。
  7. 在医院现场获取眼球，采用一致的操作方法打开眼球，并将打开后的眼球浸入固定液中（图1）。
    1. 使用止血钳夹住纱布套固定已摘除的供体眼球。
    2. 为便于完整取下带有2 mm宽巩膜边缘的角膜，使用直径为18 mm的角膜环钻在眼球表面划痕标记。
    3. 沿已划好的环形线，使用带弯曲尖端的弹簧剪进行剪切，以分离带有巩膜边缘的角膜，同时用止血钳夹住的纱布稳定眼球。
    4. 将角膜从巩膜上抬起，暴露虹膜和睫状体。
    5. 为促进固定液渗入玻璃体腔，在虹膜上距瞳孔边缘垂直方向剪开一个2 mm长的切口。将眼球放入含有30 mL固定液的标本瓶中，置于4 °C环境中，并在湿冰上运送至实验室。
  8. 通过电子方式将去标识化的供体信息从眼库传输至研究实验室数据库。
    注：该数据库保存转介编号、眼库组织编号和实验室ID编号以用于追踪，以及其他相关信息。

4. 离体眼底彩色摄影的 ex vivo 组织制备

  1. 使用两台体视显微镜，一台用于解剖，另一台用于彩色眼底摄影。
    注意：为通过透射照明观察色素改变，应使用暗视野显微镜底座。
  2. 去除前节残余组织（虹膜和晶状体）。为在解剖过程中稳定眼球，将其置于盛有石蜡的培养皿中（补充材料1，幻灯片7-8）。为防止睫状体及附着的视网膜塌陷进入玻璃体腔，应尽量减少对附着于睫状体的厚层玻璃体环（玻璃体基部）的扰动。
  3. 标记上方极点以确定方位。将眼球角膜面向下放置于培养皿中。找到上直肌和上斜肌的肌腱止点。使用木制涂药棒，沿前至后方向（即垂直于上直肌肌腱止点）轻轻涂抹标记墨水，形成一条约10 mm长的直线。
  4. 摄影前，用冷的Sorensen磷酸盐缓冲液充满眼底。
  5. 将一颗1 mm的红宝石珠插入眼底，作为每幅图像中的内部比例尺27。
  6. 使用配备环形闪光灯的体视显微镜连接单反相机拍摄彩色图像。在三种标准放大倍数下，分别采用透射照明、落射照明和闪光照明，获取用于突出特定区域的图像（补充材料1，幻灯片11）：1）从眼底至赤道部；2）后极部（血管弓、视神经乳头、黄斑中心凹）；3）黄斑部（黄斑区）内的中心凹。

5. 离体 ex vivo 眼底彩色摄影的准备工作

  1. 打开相机和显示器。插入遥控快门，并释放高清多媒体接口（HDMI）相机/电视（TV）监视器和显示电缆中的执行器。
  2. 将相机设置为手动 ISO 模式，并将反光镜锁定在升起位置（锁定以减少振动）。
    注意：请参考所用相机制造商的用户手册了解具体设置。通过相机显示屏学习直方图和曝光读数相关的过曝/欠曝设置。
  3. 设置两个光源，每个光源配备两条相互垂直的柔性导光管，从显微镜载物台的四个基本方向提供照明（补充材料 1，第 10 页）。
  4. 打开落射照明光源至最大功率。
    注意：在载物台周围使用黑色毛毡遮光罩有助于限制光线/闪光散射，对拍摄者有利，但并非必需。
  5. 在解剖显微镜下，使用镊子将眼球后极插入装有缓冲液的 30 mL 石英坩埚中。让组织沉至底部。在眼球与坩埚壁之间插入支撑物（如组织海绵），以防止移动。将 1 mm 的红宝石珠插入后极。
    注意：珠子可能会落入视神经杯中。
  6. 小心地将盛有眼球的坩埚放置在体视显微镜载物台上，通过显微镜目镜观察眼内视网膜后极。使用最低放大倍数，通过识别 12 点钟位置的组织标记、视神经乳头（ONH）以及位于 ONH 下方 5° 的黄斑来定位眼球。旋转眼球，使黄斑位于通过 ONH 的水平线下方 5° 处。
    注意：若为右眼，通过显微镜目镜观察时，ONH 位于黄斑右侧；若为左眼，则 ONH 位于黄斑左侧。
  7. 开启相机连接的远程监视器进行观察。确保显微镜的光路分光滑块已设置为通过摄影端口观察，而非通过目镜端口。根据光路和反射镜路径情况，可能需要将组织在载物台上旋转 180˚ 以获得正确的方向。

6. 使用以下方法进行图像采集 离体 彩色眼底摄影

  1. 打开落射照明，调节放大倍数，使整个18 mm的环钻切口占据整个视野。增加放大倍数，以便能够聚焦到黄斑凹底部。然后将放大倍数调回之前的设置。
  2. 调节ISO设置至1,600–3,000范围内，使相机测光表的曝光时间处于中间范围。
  3. 按下遥控快门触发按钮。注意听反光镜是否锁定在抬起位置。再次按下触发按钮进行曝光。
  4. 在显示器上观察图像，预设的元数据显示红、绿、蓝（RGB）通道及用于正确曝光的彩色直方图。若曝光合适，则继续操作；否则删除图像，重新评估参数并重新成像。
  5. 关闭用于落射照明的鹅颈灯以突出显示玻璃膜疣，打开闪光灯，设置曝光时间为1/4 s，相机快门速度为1/250 s，ISO为100–320。将闪光灯速度设为默认值，或在相机初始设置期间进行调整。获取图像，并检查直方图以确认曝光是否恰当。
  6. 关闭闪光灯，打开透射光源。将ISO重置为高于5,000，并确保曝光时间不低于1/30 s，以避免摄影系统可能产生的振动。获取图像，并检查直方图以确认曝光是否恰当。
  7. 增加放大倍数，使视盘（ONH）和黄斑均位于视野内。打开落射照明灯。将ISO范围设为1,600–3,000。确保曝光时间处于相机的合适曝光范围中心区域。
  8. 关闭落射照明灯，打开闪光灯，设置曝光时间为1/4 s，预设相机快门速度为1/250 s，ISO设为400–800。获取图像，并检查直方图以确认曝光是否恰当。
  9. 关闭闪光灯，使用暗场底座打开透射照明。将ISO重置为高于5,000。确保曝光时间不低于1/30 s，以避免摄影系统可能产生的振动。获取图像，并检查直方图是否正常。
  10. 关闭透射照明，再次打开落射照明灯。
  11. 将放大倍数调至步骤6.7中使用的倍数。如有需要，重新对焦。
  12. 将ISO调高至3,000–6,000范围内，并调整曝光时间，使其处于相机合适的曝光范围内。获取图像。
    注意：此时视野中可能不再显示红宝石微珠。若如此，需在该放大倍数下单独拍摄微珠图像以作参考。
  13. 关闭落射照明灯。打开闪光灯，设置曝光时间为1/4 s，相机快门速度为1/250 s。将闪光灯速度设为默认值，或在相机初始设置期间进行更改，并将ISO设为500–1,000。获取图像。检查直方图以确认曝光是否恰当。
  14. 关闭闪光灯，打开透射照明灯。将ISO重置为高于8,000，以使用更灵敏的图像传感器实现更快的曝光时间。确保曝光时间不低于1/30 s，以避免摄影系统可能产生的振动。获取图像。
  15. 将图像从相机导出至计算机。在将样本从显微镜载物台上移除前，先审阅图像，以防部分图像需要重新拍摄。

离体 ex vivo OCT与扫描激光检眼镜（SLO）图像采集概述

  1. 对于谱域光学相干断层扫描（OCT），将眼球置于磷酸盐缓冲液中，并放入带有60屈光度透镜腔室的定制眼支架内35。将眼支架安装到临床OCT成像设备的支架上，并固定在患者前额应放置的位置。OCT设备会自动在每幅图像中插入比例尺。
  2. 同时，使用同一设备并在眼球仍置于支架中的情况下，利用扫描激光检眼镜（SLO）对眼球进行成像，成像模式包括近红外反射（NIR，由内置软件用作定位图像）、488 nm激发的视网膜自发荧光（FAF）以及无红光反射（RF）。
    注意：该设备中787 nm激发的FAF仅偶尔适用，因为分光镜会降低到达SLO的光透过率。因此，需使用另一台设备获取787 nm FAF图像（见下一点）。
  3. 另取一台能良好显示该成像模式的设备，在眼球仍置于眼支架中的情况下，单独进行787 nm FAF成像，以检测视网膜色素上皮（RPE）的异常36 。

8. 图像采集方案 离体 OCT/SLO（见补充材料2中的幻灯片）

  1. 用组织标记染料标示上直肌。打开激光（蓝色箭头， 补充材料 2第1页
  2. 参考第2页 补充材料 2将OCT设备的头部定位，先相对于基座沿两个轴移动整个装置（绿色箭头），然后顺时针/逆时针（cw/ccw，蓝色箭头）旋转操纵杆以调节高度（y）。通过旋转旋钮（橙色箭头）进行对焦，此时黑色杠杆应置于R位置（*）。最后拧紧手拧螺钉（紫色箭头）以固定装置。
  3. 将眼球放入 holder 中，并使用垫片从后部进行固定（补充材料 1，第13页）。施加尽可能小的压力，以避免压凹巩膜。将组织标记朝上，以定位上直肌。
    注意：眼 holder 前端到 OCT 设备的近似距离为 25 mm。
  4. 打开OCT设备的专用可视化与分析软件。左侧栏将显示患者列表。以内部编码编号索引的眼部供体为 "患者。" 参考制造商提供的用户手册。
  5. 选择 新患者 图标。根据需要填写患者数据信息。选择 好的. 为单眼使用逻辑有序的编号系统，例如 YYYYNNNL,R_年龄性别。例如，可表示为 2017016R_97F。
  6. 在下一个窗口中继续输入数据后，按 好的从下拉菜单中选择操作员和研究项目。
    注意：输入的信息将出现在可导出的元数据中。
  7. 观看空白屏幕后，触摸黄色按钮以开始图像采集。
  8. 按压 红外光谱 + 光学相干断层扫描 （近红外反射成像 + 光学相干断层扫描）。启动激光以获取眼底的实时SLO图像和OCT B扫描图像。
    1. 根据视盘（ONH）和黄斑确定正确的眼球解剖位置，并使用木制涂药棒调整眼架中的眼球位置。在控制面板上，旋转黑色圆形按钮以调节强度。
    2. 按同一按钮以平均 9-100 帧（红色箭头；9 帧已足够，100 帧图像更平滑）。若设备方向正确，眼底应处于对焦状态，OCT B 扫描图像应出现在显示屏的上三分之一区域补充材料 2，第9页，双红色箭头）。
    3. 在眼底图像上，使用光标移动蓝线以居中黄斑（补充材料 2，第9页，白色箭头）。按压 获取.
      注意：其他默认按钮为 视网膜, EDI（关闭），以及 线扫描.
  9. 按压 射频 + 光学相干断层扫描 进行下一次采集前，重新检查位置，以确保图像未发生移动或质量下降。按下黑色按钮进行平均化处理。按下 获取.
  10. 将用于自发荧光成像的内部滤光片切换至 488 nm 和 787 nm 激发波长（补充材料 2，第10页）。
    注意：显示的是切换后立方体的位置。
  11. 选择 自发荧光 模式。重新检查对齐。按下 获取.
  12. 对于疑似RPE中断和萎缩的病例，选择 吲哚菁绿血管造影 （吲哚菁绿血管造影）以检测787 nm自发荧光。重新检查眼位，然后按压 获取.
    注意：由于内部立方体衰减了光束，此模式下眼底图像通常不可见。
  13. 将内部滤光块切换回 R 用于红外和无红成像的体积采集。
    注意：切换后立方体的位置见第13页 补充材料 2.
  14. 为了获取OCT图像体积数据，选择 红外 以及体积设定。匹配第14页上的所有设置。 补充材料 2 通过控制模块上的相应按钮进行切换（黄斑30°立方体扫描，30 µm间距，平均次数根据实验需求设定）。
  15. 注意，近红外反射眼底图像上覆盖有蓝色的B扫描线。在右侧窗口的上三分之一处重新检查OCT位置。按下 获取 在 控制模块，等待5分钟以完成体积扫描。成像采集完成后，选择 退出图像将被保存（红色箭头）。
    注意：蓝色线条标示了前一视图中所示距离的范围，单位为微米。扫描图像从底部（下部）开始编号，依次向上。请注意红线的进展。
  16. 让计算机处理所获取的图像，图像将显示在屏幕上（补充材料 2，第16页）。
  17. 在对同一供体的对侧眼进行成像时，不要改变固定支架在双眼之间的位置。如果先成像左眼，结果将显示在OD（右眼）列中。右键单击以选择所有图像，然后选择 交换OS/OD图像将移至 OS 列。
  18. 按压 选择 > 窗口 > 数据库屏幕默认显示第6个面板，并在右侧栏中添加供体眼球的图像补充材料 2，第18页）。在下拉菜单中右键点击患者，选择 批次，并导出 E2E 文件。
  19. 浏览至桌面上为文件传输创建的预设文件夹。选择 好的该文件夹包含需复制到外接硬盘并存档的E2E文件。
  20. 将带支架的眼球移至扫描激光检眼镜处，该设备主要用于787 nm自发荧光检测。
    注意：图像的采集与存档请参考制造商的用户指南。
  21. 打开计算机和激光器。
  22. 选择 新患者 根据需要填写患者信息。
  23. 为保持眼部数据表一致，请按 好的。当C曲线保持不变时，按压 继续.
  24. 选择 研究 模式，并在需要时输入密码。保持C曲线为7.7 mm。按下 好的.
  25. 选择 继续 验证C曲线。选择黄色指示器以启动摄像头。
  26. 选择 R 位置。对齐并调整地球仪的方向。选择 红外 模式下进行聚焦和定向，操作如上所述。
  27. 通过相对于底座在两个轴向上移动整个装置来调整摄像头头部的方向（补充材料 2，第28页，绿色箭头）然后升高装置的高度（y方向，蓝色箭头）。通过旋转旋钮（橙色箭头）来聚焦图像。黑色杠杆位于R位置（*）。当头部到位后，旋转拇指螺钉（紫色箭头）以固定装置。
  28. 请注意，屏幕显示内容如第29页所示 补充材料 2.
  29. 将选择旋钮从 R 到 A选择 吲哚菁绿血管造影 （实现787 nm自发荧光）采用蓝色激发光，100%强度，30°视野，单相成像。
    注意：与染料吲哚菁绿类似，黑色素可被波长787 nm的光激发。
  30. 请注意，屏幕显示内容如第31页所示 补充材料 2. 按下黑色圆盘进行取平均，然后选择 获取.
  31. 选择 窗口 > 数据库选择 导入 SLO 设备的 E2E 文件；这些文件存储在外部硬盘驱动器上，并上传至桌面。
  32. 选择 开放. 检查标记是否为默认设置，并选择 好的.
  33. 请注意，患者现在有两个标签页：一个显示从SLO获取的图像（蓝色箭头），另一个标签页显示从OCT设备获取的图像（红色箭头）补充材料 2，第34页。
  34. 右键单击 786 nm（ICGA）图像，将图片导出并保存到桌面，文件命名为 SLO 786。
  35. 为保存786 nm自发荧光SLO图像，选择患者后右键单击，将图像导出为RAW文件（适用于.vol文件），并保存至桌面文件夹中。
  36. 从OCT设备导出图像以传输至归档计算机时，需进行复制/粘贴操作 RAWEXPORT 到一个标记为的文件夹 RAW.

9. 成像评估

  1. 为每位供体按实验室编号依次建立文件夹，每个供体文件夹下再按眼别建立子文件夹，并将图像（彩色照片、.vol 文件、SLO 图像）归入相应文件夹。
  2. 在数据库中记录组织印象（质量、病理情况），以生成标准化报告。
  3. 使用实验室内部开发的 ImageJ 插件查看导出的 OCT 体积数据。
    1. 确定黄斑中心凹中心，可通过中心凹凹陷的中心、外层视网膜带向内隆起的位置或最薄点来识别。大多数情况下这些位置重合，但并非总是如此，这取决于中心凹的保存状况、个体差异以及是否存在病理改变。
    2. 在上方周边黄斑区（上方方向 2 mm 或 67 个 B 扫描处，即扫描编号递增方向）选取一个标准扫描。
    3. 保存整个体积数据的 .tif 堆栈文件，以便将来快速查阅。
    4. 从第 1 个扫描（下方）开始，完整浏览整个 OCT 体积数据，并记录观察到特征所在的扫描编号。
    5. 除黄斑区外，还需检查视盘周围区域。
      注：老年眼中的视盘周围脉络膜视网膜萎缩常伴有特征性的基底膜沉积物和新生血管形成。该区域在近视眼、青光眼以及衰老和年龄相关性黄斑变性（AMD）中均为色素改变的常见部位37。
  4. 检查彩色眼底照片，并尽可能将所见发现与 OCT 所见进行关联。
    注：通常情况下，大多数病变首先通过 OCT 更容易识别。但彩色照片可提供 SLO 范围以外区域的广视野图像，有助于观察脉络膜色素沉着（包括色素痣）、血红素沉积、硬性渗出的存在，以及新生血管性 AMD 中的黑色素。黄斑区的深色色素可能来源于前节松散的黑素体，应使用移液器轻轻用缓冲液冲洗去除。
  5. 检查 SLO 图像，并尽可能将所见发现与 OCT 所见进行关联。
  6. 在病理报告中保存黄斑及周边黄斑的标准 B 扫描、具有显著病理改变或其他特征的额外 B 扫描，以及 SLO 图像。
  7. 将眼球按以下类别进行分类：无特殊发现、可疑、早期-中期 AMD、萎缩性 AMD、新生血管性 AMD、其他、未知、不可分级、未记录。"可疑"用于判断改变是否严重到足以归入其他类别的不确定情况。"不可分级"适用于缺乏有效 OCT 扫描的眼球，例如视网膜严重脱离者。"未记录"适用于接收后立即处理而未进行摄影的眼球。
  8. 采用以下标准诊断 AMD：存在严重的视网膜色素上皮（RPE）改变，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDD），无论是否存在新生血管化迹象（如液体积聚或纤维化），且排除其他病因（此标准根据 Curcio 等人10 更新，以纳入 SDD 的情况）。
    注：最终诊断需经组织病理学分析确认。

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结果

表1 显示在2016至2017年间，来自94名非糖尿病白人供体的184只眼睛 >80岁。平均死亡至保存时间间隔为3.9小时（范围：2.0–6.4小时）。在回顾的184只眼球中，75只（40.2%）确诊为年龄相关性黄斑变性（AMD）。所识别的分类如下：无明显异常（39.7%）、可疑（11.4%）、早期-中期AMD（22.8%）、萎缩型（7.6%）、新生血管型（9.8%）、其他（8.7%）以及未知/未记录/不可分级（<1%). 图2, 图3, 图4，以及 图5 显示多尺度、多模态 离体 对本系列中保存极为完好的眼球进行成像。这些眼球的评估由一位专注于视网膜疾病的眼科医生（J.A.K.）协作完成。尽管某些眼球在个别特征上显示更清晰，但这些病例因整体质量高而被选中。

如上所述

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讨论

在新冠疫情前的16个月期间，采用基于人群的筛查方法，成功获取了75例患有年龄相关性黄斑变性（AMD）的供体眼球。所有样本均在较短的死亡至摘取时间（DtoP）内获取，并通过光学相干断层扫描（OCT）锚定的宏观-微观-影像学（MMI）分期方法进行分期。年龄标准（>80岁）超出了用于可移植角膜的组织回收通常所考虑的年龄范围。尽管供体年龄较大，但根据我们的标准，仍获得了涵盖年龄相关性黄斑变性（AMD）各个阶段的眼组织。许多视网膜色素上皮（RPE）表型在所有AMD阶段中均常见，而部分表型则特异存在于新生血管性AMD中3,46直接比较 离体 和 体内 成像（图7）证实了短的D到P时间是一个关键因素，此外还需要专家的操作处理（图1），在生成 离体 足以进行高级别诊断分类的外视网膜图像，其中部分样本适用于成像与组织学之间的直接对照分析

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披露

C.A.C. 获得海德堡工程公司的研究资助，并担任艾佩利西斯、安斯泰来、勃林格殷格翰、Character Bioscience 和 Osanni 的顾问。T.A. 获得诺华公司的研究资助，并担任罗氏、诺华、拜耳、尼德克和艾佩利西斯的顾问。K.B.F. 担任基因泰克、蔡司、海德堡工程、艾尔建、拜耳和诺华的顾问。

致谢

我们感谢 Heidelberg Engineering 提供仪器以及原始眼 holder 的设计，感谢 Richard F. Spaide 医学博士引入基于光学相干断层扫描的多模态成像技术，感谢 Christopher Girkin 医学博士协助使用临床成像设备，以及感谢 David Fisher 提供图 1。人类供体眼球的获取研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 R01EY06019（C.A.C.）、P30 EY003039（Pittler）、R01EY015520（Smith）、R01EY027948（C.A.C., T.A.）、R01EY030192（Li）、R01EY031209（Stambolian）和 U54EY032442（Spraggins）、IZKF Würzburg（N-304, T.A.）、阿拉巴马州 EyeSight 基金会、国际视网膜研究基金会（C.A.C.）、Arnold 和 Mabel Beckman 黄斑变性研究倡议（C.A.C.）以及防盲研究基金会 AMD Catalyst（Schey）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
烧杯，250 mLFisher# 02-540K
瓶子，1 L，Pyrex Fisher# 10-462-719用于保存剂的储存
本生灯或热源Eisco# 17-12-818用于熔化石蜡
数码相机Nikon D7200D7200
计算机及存储设备AppleiMac Pro；14 TB 外置硬盘图像存储
保温容器Fisher# 02-591-45用于湿冰
容器，每位供体2个，40 mLFisherSameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86用于保存剂
石英坩埚，30 mLFisher# 08-072D用于眼球摄影时固定眼球
量筒，250 mLFisher# 08-549G
消毒清洁用品  https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
带透镜和安装支架的眼球固定装置联系 J. Messingerjeffreymessinger@uabmc.edu基于海德堡工程公司原始设计的定制改装
面部防护口罩Fisher# 19-910-667
Harmon Fix 镊子Roboz # RS-8247
显微有齿镊Roboz # RS-5232
组织镊Roboz# RS-5172
玻璃培养皿，KimaxFisher# 23064
钻石纹手套Fisher# MF-300
GenPro 防护服Fisher# 19-166-116
图像编辑软件AdobePhotoshop 2021，Creative Suite
KimWipes 纸巾Fisher# 06-666
灯，三头蛇形管Schott Imaging# A20800
体视显微镜NikonSMZ 1000用于解剖
体视显微镜Olympus SZX9用于眼底彩色摄影
多聚甲醛，20% EMS# 15713-S用于保存剂；稀释后储存
pH 计Fisher # 01-913-806
磷酸盐缓冲液，Sorenson's，0.2 M，pH 7.2’ EMS# 11600-10
环形闪光灯B & H Photo VideoSigma EM-140 DG 
红宝石珠，直径1 mmMeller Optics# MRB10MD
3M 防护眼镜Fisher# 19-070-940
扫描激光检眼镜Heidelberg EngineeringHRA2
弹簧弯剪Roboz# RS-5681
锐器盒Fisher# 1482763
快门线，遥控NikonMC-DC2
谱域 OCT 设备Heidelberg EngineeringSpectralis HRA&OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
不锈钢钢珠，直径25.4 mmMcMaster-Carr# 9529K31
组织标记染料，黑色Cancer Diagnostics Inc# 0727-1
组织切片刀片Thomas Scientific# 6767C18
环钻，直径18 mmStratis Healthcare# 6718L
电视监视器（HDMI）及数码相机连接线B&H Photo VideoBH # COHD18G6PROB用于实时观察和远程相机显示功能
粉红色牙科石蜡EMS # 72670
木制涂药棒Puritan# 807-12

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