改进的脂褐质模型及高度极化人视网膜色素上皮培养中外节吞噬能力的定量分析

摘要

本方案描述了一种在高度分化且具有极性的体外人视网膜色素上皮（RPE）细胞培养体系中建立脂褐质累积模型的方法，以及一种改进的外节段（OS）吞噬检测法，用于评估RPE细胞对外节段的总体摄取与降解能力。这些方法克服了以往脂褐质模型和经典脉冲-追踪外节段吞噬检测法的局限性。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）每日吞噬感光细胞外节段，导致细胞内一种称为脂褐素的老年色素积累。脂褐素的毒性在斯塔加特病（Stargardt's disease）中已有明确证据，该病是最常见的遗传性视网膜变性疾病；但在年龄相关性黄斑变性（AMD）中的毒性作用则存在更多争议，而AMD是发达国家不可逆失明的首要原因。在人类中确定脂褐素的毒性一直较为困难，且斯塔加特病的动物模型表现出的毒性有限。因此， 体外 模拟人类视网膜色素上皮（RPE）的模型 在体 需要进一步研究以更好地理解脂褐素的生成、清除及其毒性。迄今为止，大多数细胞培养中的脂褐素模型均基于细胞系，或仅向视网膜色素上皮（RPE）提供复杂脂褐素混合物中的单一组分，而非整个光感受器外节段的碎片/末端结构，这限制了模型的生理完整性和代表性。本文所述方法通过反复喂养经紫外光处理的光感受器外节段碎片，使其被RPE摄取，从而在高度分化的原代人胚胎视网膜色素上皮（hfRPE）及诱导性多能干细胞（iPSC）来源的RPE中诱导产生类似脂褐素的不可消化自荧光物质（称为不可消化自荧光物质，UAM），实现UAM的累积 通过 吞噬作用。UAM 模拟脂褐素的关键方式及其差异 体内 还讨论了伴随类脂褐素积累的模型，并介绍了用于区分UAM颗粒广泛自发荧光光谱与同时进行的抗体染色的成像方法。最后，为评估UAM对RPE吞噬能力的影响，提出了一种量化外节片段/尖端摄取与降解的新方法。该方法称为“总消耗能力”（Total Consumptive Capacity），可克服经典外节“脉冲-追踪”实验在评估RPE吞噬能力时可能存在的误读问题。本文介绍的模型与技术可用于研究脂褐素的生成与清除通路及其潜在毒性。

引言

视网膜色素上皮（RPE）为外层的光感受器提供关键支持，包括每日摄取和降解光感受器外节顶端或碎片（在本方案中，缩写OS代表外节顶端或碎片，而非完整的外节结构）。这种在有丝分裂后RPE中的每日摄取最终会超出吞噬溶酶体的处理能力，导致不可消化的、自发荧光的细胞内物质——即脂褐素——的积聚。有趣的是，多项研究还表明，RPE中的脂褐素可在无外节吞噬的情况下发生积聚^1,2。脂褐素包含多种成分，其中包括源自视觉循环视黄醛的交联加合物，在80岁以上人群中，其体积可占RPE细胞总体积的近20%³。

脂褐素是否具有毒性一直存在激烈争论。Stargardt病是一种常染色体隐性遗传的感光细胞和视网膜色素上皮（RPE）变性疾病，由ABCA4基因突变引起，导致感光细胞外节中视觉循环视黄醛类物质的异常处理。视黄醛类物质的异常处理会引起异常交联并形成双视黄醛类物质，包括双视黄醛化合物N-视黄基亚-N-视黄基乙醇胺（A2E）。已有研究证明A2E具有多种毒性机制^4,5。脂褐素在临床成像过程中会产生眼底自发荧光信号，Stargardt病患者及相应的动物模型在视网膜变性发生之前即表现出增强的眼底自发荧光，提示脂褐素水平与毒性之间存在相关....

方案

本方案涉及人类组织的获取与使用，已通过密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）的审查与批准。

1. 光氧化外节尖端及碎片的制备

注意：购买的暗适应牛视网膜在冰上运输（见材料表）。根据先前发表的方案²³，从这些视网膜中纯化了外节（OS）。

1. 使用紫外灯进行外节段交联
   1. 将聚四氟乙烯涂层载玻片浸入（参见 材料表在生物安全柜中，将载玻片完全浸入70%乙醇中10分钟以灭菌。随后将载玻片置于无菌的100 mm细胞培养皿中自然晾干。
   2. 将每张载玻片放入一个新的100 mm细胞培养皿中，向每个矩形区域加入200 µL含血清的细胞培养基（使用当前RPE培养所常规使用的任何培养基），然后使用手持式254 nm紫外灯（参见 材料表将培养皿（100 mm，无盖）置于灯泡正对载玻片的位置，照射20分钟。本研究中所用的培养基及其组分的具体产品编号此前已有发表。^{22, 23}该培养基称为 "RPE 培养基" 在整个方案中。
      注意：培养基的紫外处理可阻断玻璃表面，防止后续步骤中OS黏附....

结果

图 1Ai 展示了OS光氧化的实验装置。聚四氟乙烯涂层载玻片可在每个开放矩形区域中加载较大量的OS溶液，且不会扩散至载玻片的其他区域。载有OS的载玻片置于无盖的无菌培养皿中，紫外灯按图 1Aii 所示位置置于载玻片上方。或者，也可将载玻片放入紫外交联仪中，如图 1Aiii 所示。光氧化处理后，通过显微镜和流式细胞术检测，OS的自发荧光显著增强（图 1B）。光氧化后蛋白质交联的程度可通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE进行评估，表现为优势蛋白条带（单体视紫红质）转化为高阶聚集体并出现弥散条带（图 1C）。比较手持式紫外灯（图 1Aii）与紫外交联仪（图 1Aiii）的处理效果表明，手持式紫外灯产生的OxOS其自发荧光水平与紫外.......

讨论

尽管RPE脂褐素已被研究数十年，但其毒性仍存在争议^2,9,16,42鉴于动物模型中关于脂褐素毒性的不确定性¹¹, 体外 使用人视网膜色素上皮（RPE）的模型具有重要价值。多种 体外 已有文献描述过脂褐素累积模型，但均未同时采用外节段喂养和高度成熟分化的人视网膜色素上皮（RPE）培养体系。这种组合代表了一种理想的模型，因为外节段喂养可重现脂褐素累积的方法 体内 且高度成熟的人类RPE培养物最能模拟RPE功能行为 体内有趣的是，在使用高度分化的hfRPE培养物时发现，即使经过反复喂养，常规的OS暴露仍不足以诱导产生类脂褐素物质。¹⁶因此，本方案通过可控的方式对感光细胞外节段进行光氧化（OxOS），从而加速脂褐素的积累过程。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	Corning	#353003	其他品牌也可使用
24孔Transwell小室	Corning	#3470
抗LC3抗体	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 稀释
抗视紫红质抗体 1D4	Abcam	#5417	1:1000 稀释。表位位于C端。
抗视紫红质抗体 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	Western blot使用1:5000稀释，免疫染色使用1:1000稀释。表位位于N端。
自发荧光淬灭剂	Biotium	#23007	TrueBlack 脂褐素自发荧光淬灭剂
自发荧光淬灭剂	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
胆固醇酯酶	Life Technologies	来自A12216试剂盒
共聚焦显微镜	Leica	Leica Stellaris SP8 配备FALCON模块
暗适应牛视网膜	W. L. Lawson Company	暗适应牛视网膜（预解剖）	联系方式： https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
菲林	Sigma-Aldrich	F4767
流式细胞仪	Thermo Fisher	Attune NxT
流式细胞仪分析软件	BD	FlowJo
手持式紫外灯	Analytik Jena US	UVGL-55
人MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
人纯化Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli上样缓冲液	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH检测	Promega	J2380	LDH-Glo 细胞毒性检测试剂盒
封片剂	Invitrogen	P36930	Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂
尼罗红	Sigma-Aldrich	#72485
聚四氟乙烯涂层载玻片	Tekdon	定制	定制规格：PTFE掩膜具有以下"开窗" —   3个玻璃矩形区域，每个尺寸为17 mm × 9 mm，方向为17 mm边距离载玻片顶部和底部各4 mm（假设标准显微镜载玻片尺寸为25 mm × 75 mm）。每个矩形区域之间以及与载玻片边缘的距离至少为6 mm。将PTFE掩膜打印在单面磨砂玻璃载玻片上，以便标记载玻片。
蛋白酶抑制剂	Cell Signaling Technology	#5872
蛋白定量检测试剂盒	Bio-Rad	#5000122 RC DC蛋白定量检测试剂盒
TEER电极	World Precision Instruments	STX3
跨上皮电阻（TEER）测量仪	World Precision Instruments	EVOM3
紫外交联仪	Analytik Jena US	UVP CL-1000