改进的脂褐质模型及高度极化人视网膜色素上皮培养中外节吞噬能力的定量分析

摘要

本方案描述了一种在高度分化且具有极性的体外人视网膜色素上皮（RPE）细胞培养体系中建立脂褐质累积模型的方法，以及一种改进的外节段（OS）吞噬检测法，用于评估RPE细胞对外节段的总体摄取与降解能力。这些方法克服了以往脂褐质模型和经典脉冲-追踪外节段吞噬检测法的局限性。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）每日吞噬感光细胞外节段，导致细胞内一种称为脂褐素的老年色素积累。脂褐素的毒性在斯塔加特病（Stargardt's disease）中已有明确证据，该病是最常见的遗传性视网膜变性疾病；但在年龄相关性黄斑变性（AMD）中的毒性作用则存在更多争议，而AMD是发达国家不可逆失明的首要原因。在人类中确定脂褐素的毒性一直较为困难，且斯塔加特病的动物模型表现出的毒性有限。因此， 体外 模拟人类视网膜色素上皮（RPE）的模型 在体 需要进一步研究以更好地理解脂褐素的生成、清除及其毒性。迄今为止，大多数细胞培养中的脂褐素模型均基于细胞系，或仅向视网膜色素上皮（RPE）提供复杂脂褐素混合物中的单一组分，而非整个光感受器外节段的碎片/末端结构，这限制了模型的生理完整性和代表性。本文所述方法通过反复喂养经紫外光处理的光感受器外节段碎片，使其被RPE摄取，从而在高度分化的原代人胚胎视网膜色素上皮（hfRPE）及诱导性多能干细胞（iPSC）来源的RPE中诱导产生类似脂褐素的不可消化自荧光物质（称为不可消化自荧光物质，UAM），实现UAM的累积 通过 吞噬作用。UAM 模拟脂褐素的关键方式及其差异 体内 还讨论了伴随类脂褐素积累的模型，并介绍了用于区分UAM颗粒广泛自发荧光光谱与同时进行的抗体染色的成像方法。最后，为评估UAM对RPE吞噬能力的影响，提出了一种量化外节片段/尖端摄取与降解的新方法。该方法称为“总消耗能力”（Total Consumptive Capacity），可克服经典外节“脉冲-追踪”实验在评估RPE吞噬能力时可能存在的误读问题。本文介绍的模型与技术可用于研究脂褐素的生成与清除通路及其潜在毒性。

引言

视网膜色素上皮（RPE）为外层的光感受器提供关键支持，包括每日摄取和降解光感受器外节顶端或碎片（在本方案中，缩写OS代表外节顶端或碎片，而非完整的外节结构）。这种在有丝分裂后RPE中的每日摄取最终会超出吞噬溶酶体的处理能力，导致不可消化的、自发荧光的细胞内物质——即脂褐素——的积聚。有趣的是，多项研究还表明，RPE中的脂褐素可在无外节吞噬的情况下发生积聚^1,2。脂褐素包含多种成分，其中包括源自视觉循环视黄醛的交联加合物，在80岁以上人群中，其体积可占RPE细胞总体积的近20%³。

脂褐素是否具有毒性一直存在激烈争论。Stargardt病是一种常染色体隐性遗传的感光细胞和视网膜色素上皮（RPE）变性疾病，由ABCA4基因突变引起，导致感光细胞外节中视觉循环视黄醛类物质的异常处理。视黄醛类物质的异常处理会引起异常交联并形成双视黄醛类物质，包括双视黄醛化合物N-视黄基亚-N-视黄基乙醇胺（A2E）。已有研究证明A2E具有多种毒性机制^4,5。脂褐素在临床成像过程中会产生眼底自发荧光信号，Stargardt病患者及相应的动物模型在视网膜变性发生之前即表现出增强的眼底自发荧光，提示脂褐素水平与毒性之间存在相关性^6,7。然而，随着年龄增长，脂褐素在所有正常人体内都会积累，却并未引发RPE变性。此外，在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，RPE变性仅发生于老年患者，而疾病早期和中期患者的自发荧光信号反而低于同龄健康人群⁸。这些临床发现已在组织学水平上得到证实^9,10。

关于视网膜色素上皮（RPE）脂褐素积聚的动物模型，对于脂褐素毒性的研究仍存在一些不确定性。在色素性背景下，ABCA4基因敲除小鼠并未表现出视网膜变性，但在白化病背景或暴露于蓝光条件下则会出现视网膜变性^11,12。此外，通过ABCA4基因敲除所导致的脂褐素毒性可能不同于自然衰老过程中缓慢积聚的脂褐素，后者在年龄相关性黄斑变性（AMD）中可见¹³。

体外脂褐素积聚模型为研究脂褐素积聚对视网膜色素上皮（RPE）健康的影响提供了替代方法。此类模型允许调控脂褐素的组分，从添加单一的视黄醇类成分到添加外节段（OS），并可在人源而非动物源的RPE中进行研究。在过去几十年中，已发展出多种在培养体系中模拟RPE脂褐素积聚的方法。除其他研究团队外，Boulton博士的研究组曾将牛的外节段每日添加至来自4至85岁供体的第4至7代人原代RPE细胞中，持续长达三个月¹⁴。另一种方法是通过抑制自噬，也可在第3至7代人原代RPE培养物中诱导脂褐素积聚¹⁵。然而，在高度分化的第1代人原代产前RPE（hfRPE）培养物中，即使每日重复添加外节段，亚致死性的溶酶体抑制也无法诱导脂褐素的形成¹⁶。

作为一种更为还原论的方法，其他研究者已将单一的脂褐素组分喂养给细胞培养物，尤其是双视黄醇类物质A2E^4,17。此类研究的价值在于明确了单个脂褐素组分潜在的直接毒性机制，例如溶酶体胆固醇和神经酰胺稳态的破坏¹⁸。与此同时，关于A2E的毒性仍存在争议¹⁹，而直接将A2E施加于细胞会绕过脂褐素积累的典型途径，即视网膜感光细胞外节段的吞噬作用。为了向视网膜色素上皮（RPE）细胞培养物递送脂褐素的全部组分，Boulton和Marshall从人眼组织中纯化了脂褐素，并将其添加至来源于胎儿和老年供体的人原代RPE细胞培养物（第4至第7代）中²⁰。尽管该方法具有创新性，但其提供的脂褐素来源有限，难以满足重复实验的需求。

尽管在多种体系中反复用OS喂养RPE培养物可产生脂褐素，但在高度分化的原代RPE培养物中却无法实现这一效果¹⁶光氧化的OS会诱导产生类似双视黄素类物质交联反应，这类反应在脂褐素形成过程中自然发生 体内这可能会加速视网膜色素上皮（RPE）培养系统中类脂褐素颗粒的形成，即使是在高度分化且对脂褐素积聚具有抵抗性的培养系统中。¹⁶在此，介绍一种改良自Wihlmark已发表方案的方法，用于诱导高度分化的hfRPE和人iPSC-RPE中类脂褐素颗粒的积累²¹该方法的优势在于，能够利用与脂褐素形成过程中相同的来源（光感受器外节）和途径（吞噬溶酶体对外节的摄取），诱导产生类似脂褐素的颗粒 体内此外，该实验在人视网膜色素上皮（RPE）培养细胞上进行，这些细胞具有高度分化特性，并已在多项研究中被验证可有效模拟人类RPE。 体内^22,23,24. 这些类脂褐素颗粒被称为不可消化的自体荧光物质（UAM），本方案中提供了将UAM与之比较的数据和讨论 体内 脂褐素. 除了介绍构建和评估含有UAM的人类高度分化RPE细胞培养物的方法外，还提出了一种更新的评估RPE外节段（OS）吞噬作用的方法。已有多种优秀的脉冲-追踪方法被用于定量测定OS吞噬作用，包括蛋白质印迹（Western blotting）、免疫细胞化学和流式细胞术（FACS）。^25,26,27然而，在OS脉冲-追踪实验的早期阶段，导致OS摄取不良的条件可能与促进已内化OS快速降解的条件相混淆。本文所述方法可测量由RPE完全消耗/降解的引入OS总量。"总消耗能力"），有助于消除这一模糊性。预计利用这些方案获得的关于脂褐素毒性的见解，包括利用OS吞噬率评估其影响，将有助于推进相关研究。 "总消耗能力" 方法将用于阐明脂褐素的毒性 体内

方案

本方案涉及人类组织的获取与使用，已通过密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）的审查与批准。

1. 光氧化外节尖端及碎片的制备

注意：购买的暗适应牛视网膜在冰上运输（见材料表）。根据先前发表的方案²³，从这些视网膜中纯化了外节（OS）。

1. 使用紫外灯进行外节段交联
   1. 将聚四氟乙烯涂层载玻片浸入（参见 材料表在生物安全柜中，将载玻片完全浸入70%乙醇中10分钟以灭菌。随后将载玻片置于无菌的100 mm细胞培养皿中自然晾干。
   2. 将每张载玻片放入一个新的100 mm细胞培养皿中，向每个矩形区域加入200 µL含血清的细胞培养基（使用当前RPE培养所常规使用的任何培养基），然后使用手持式254 nm紫外灯（参见 材料表将培养皿（100 mm，无盖）置于灯泡正对载玻片的位置，照射20分钟。本研究中所用的培养基及其组分的具体产品编号此前已有发表。^{22, 23}该培养基称为 "RPE 培养基" 在整个方案中。
      注意：培养基的紫外处理可阻断玻璃表面，防止后续步骤中OS黏附。
   3. 在37 °C下解冻OS的冷冻分装样品（用手或 通过 水浴）。所需氧化应激（OS）试剂的用量取决于具体应用。通常情况下，可处理多达500 µL的2 x 10⁸ 载玻片上每个矩形区域的OS/mL。
   4. 解冻后，以2400 x g离心OS g 室温孵育5分钟。立即在生物安全柜中使用移液器吸取上清液，避免使用真空抽吸，以防意外丢失沉淀。
   5. 用无菌 PBS 轻柔重悬沉淀。
      注意：记录重悬的体积和预期浓度。例如，将1 mL试管（含1 × 10⁶细胞）中的细胞沉淀重悬⁸ OS/mL 加入 500 µL PBS 可得到 2 x 10⁸ OS/mL。在聚四氟乙烯涂层载玻片的每个矩形区域上，最大体积和浓度为 500 µL 的 2 x 10⁸ OS/mL
   6. 吸弃载玻片上的培养基，加入最多 500 µL 的 2 x 10⁸ 在载玻片的每个矩形区域上加入 OS/mL PBS 溶液。将手持式紫外灯置于细胞培养皿（无盖）上方，使灯泡正对 OS。用 254 nm 紫外光照射 OS 溶液 40 分钟。
      注意：在40分钟照射期间，用毛巾或吸水垫覆盖紫外灯和培养皿，关闭生物安全柜的窗板，并关闭风机。这将防止发生明显的蒸发。如果研究人员无法获得本方案中使用的紫外灯，可采用以下两种替代方法以确保达到适当的交联程度。第一种方法是按照步骤1.2中所述的定量紫外照射条件进行操作，可使用步骤1.2中所述设备，或其他能够提供与步骤1.2所述设备相同定量辐射暴露的装置。另一种替代方法是将OS暴露于紫外照射一定时间，以达到考马斯亮蓝染色中所见的交联程度 图1C.
   7. 收集经处理的OS PBS溶液至无菌微量离心管中，用200–500 µL PBS对包被载玻片的矩形区域重新冲洗2–3次，每次冲洗液均收集至同一微量离心管中。操作完成后，在组织培养室显微镜下观察载玻片，以确认几乎所有OS细胞已被去除。
   8. 以 2400 x g 离心 OS PBS 溶液 g 在室温下孵育5分钟，于生物安全柜中用移液器吸除PBS，并重悬于500 µL将用于RPE培养的标准培养基中（例如— "RPE 培养基" 根据1.1.2节定义。重悬体积可根据所需的光氧化牛血清白蛋白（OxOS）浓度进行调整。
   9. 将10 µL悬浮液转移至新的微量离心管中，用更多细胞培养基稀释50-100倍，并使用血细胞计数板对OS细胞进行计数。
   10. 根据 OS 数量，将 OxOS 悬液稀释至最终储存浓度。用于喂养 24 孔 Transwell 中高度成熟的 RPE 培养物（表面积为 0.33 cm²）²；参见 材料表)，最终培养基浓度为 2 x 10⁷ 建议使用 OS/mL。
       1. 为实现此目的，将氧化的视网膜外节段（OxOS）以5.6 × 10⁷ OS/mL的浓度分装至25 µL的等份中，悬浮于标准的视网膜色素上皮（RPE）培养基中。解冻一份25 µL的等份后，将其全部与45 µL标准RPE培养基混合，最终培养基体积为70 µL，视网膜外节段浓度为2 × 10⁷ OS/mL。⁷ 每次 OxOS Transwell 喂养的 OS/mL
   11. 在分装OxOS之前，加入吞噬作用桥接配体（Protein S和MFG-E8，参见 材料表），促进OS的摄取和脂褐素的积累。在24孔Transwell中，桥接配体的工作浓度为人纯化Protein S 4 µg/mL和人重组MFG-E8 1.5 µg/mL。因此，对于25 µL体积、浓度为5.6 x 10⁶⁷ OS/mL，Protein S 的储存浓度为 11.2 µg/mL，MFG-E8 的储存浓度为 4.2 µg/mL。
       注意：桥连配体的浓度是针对24孔Transwell上培养的hfRPE细胞进行优化的，每0.33 cm²约含有320,000个细胞。² 此外，对于其他类型的RPE细胞和细胞密度，可能需要调整配体浓度，因为当配体浓度超过吞噬受体的可利用量时，反而可能抑制外节段的摄取。²⁸.
   12. 在液氮中速冻等分试样。
       注意：反复冻融对OS的完整性极为不利。
2. 使用紫外交联仪进行外节段交联
   注意：执行步骤 1.1，但以下步骤分别替代步骤 1.1.2 和 1.1.6：
   1. （替代步骤1.1.2）将每张载玻片放入一个新的100 mm细胞培养皿中，并加入200 µL含血清的细胞培养基（例如 -"RPE 培养基" 或任何其他替代物）放入每个矩形区域，然后将载玻片置于紫外交联仪中（参见 材料表），在3-6 J/cm²的辐射剂量下用254 nm紫外线处理² 以封闭玻璃表面，防止在后续步骤中发生OS粘连。
   2. （替代步骤 1.1.6）吸去切片上的培养基，加入最多 500 µL 的 2 x 10⁸ 将OS/mL加入无菌PBS中，分别滴加到载玻片的每个矩形区域。将载玻片放入紫外交联仪中，根据需要设置辐射曝光剂量（3–9 J/cm²）。²），并在254 nm下照射处理。
      注意：所需的辐射能量密度可通过在 3-9 J/cm 之间滴定辐射能量密度来精确确定² 直到自体荧光程度和蛋白质交联（如在 图1B 和 图1C达到。
      警告：在生物安全柜外操作OS可能导致污染。在OS暴露于紫外交联仪设备后，须使用无菌移液器吸头收集OS，转移至无菌微量离心管中，并在后续所有步骤中于生物安全柜内操作。
3. 氧化型OS的表征
   1. 通过成像定量自体荧光发射光谱
      1. 将未处理的OS和OxOS储存液各20–50 µL分别加入两个独立的微量离心管中。以2400 x g 室温孵育5分钟，将沉淀重悬于缓冲液（如PBS）配制的4%多聚甲醛中，室温固定15分钟。
      2. 固定后，同上离心，用 PBS 洗涤 2 次（每次洗涤之间均需离心），然后重悬于少于 30 µL 的 PBS 中。
      3. 取少量重悬液置于显微镜载玻片上，加入封片介质（参见 材料表），最后加盖盖玻片。
      4. 在共聚焦显微镜上进行图像OxOS（参见 材料表).
         注意：OxOS 的自发荧光可被较宽范围的激光波长激发，但通常使用 405 nm 或 488 nm 激光线。其发射光谱同样较宽，但使用典型的 GFP/FITC 激发/发射滤光片组合即可观察到自发荧光。
      5. 为测量OxOS的发射光谱，使用共聚焦显微镜的λ扫描模式。典型的λ扫描设置包括采用405 nm或488 nm激发，检测从激光激发波长起红移10 nm开始至约800 nm范围内的发射光信号，λ步长为10 nm。每种显微镜系统均有其特定的λ模式操作方法，使用者需参考所用共聚焦显微镜的仪器手册。
   2. 作为替代方法，可通过流式细胞术定量自体荧光。
      1. 离心 2 × 10⁷ 未经处理的OS以及单独的2 x 10⁷ 在微量离心管中加入OxOS，用1 mL PBS重悬。
         注意：如果在解冻后直接进行流式细胞术，则无需固定。
      2. 将未经处理的OS和OxOS样本上样至流式细胞仪（参见 材料表). 调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），使FSC-SSC散点图中的信号分布达到可接受的范围。使用PBS作为空白对照，以排除任何污染性微小颗粒的干扰。注意，外泌体（OS）的尺寸明显小于细胞。
      3. 使用流式细胞仪的标准FITC通道进行自发荧光定量。至少采集10,000个事件。采用FITC直方图的脉冲面积值表示荧光强度。
         注意：本研究中所有数据均使用流式细胞仪分析软件进行分析（参见 材料表），按照制造商的说明进行操作。
   3. 评估 OxOS 中的交联程度
      1. 离心 2 × 10⁷ 未经处理的OS以及单独的2 x 10⁷ 在微量离心管中进行OxOS。去除上清液后，直接加入1.2倍体积的Laemmli样品缓冲液（足以覆盖沉淀）裂解沉淀，参见 材料表）。涡旋混匀，在室温下放置30分钟，于室温以不低于12000 × g离心。 g 10 分钟后，收集上清液。
         注意：通过评估OxOS中蛋白质交联的程度，可判断紫外线处理是否充分。将未经处理的OS与OxOS进行比较，当考马斯亮蓝染色中以单体视紫红质条带为主时，表明交联充分图1C，箭头）刚好可见，同时出现高阶聚集体以及在凝胶顶部的蛋白质弥散条带。
         ​警告：使用上样缓冲液裂解外节段（OS）时，后续切勿加热裂解液，以免引发视紫红质聚集。裂解后的外节段在准备储存前也应避免冷却，以防十二烷基硫酸钠（SDS）析出。未使用的裂解液可保存于 -20 °C。若需再次解冻，务必在室温下完全解冻后方可使用。
      2. 使用对高浓度SDS和还原剂具有耐受性的蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度²⁹请参见 材料表 有关合适的蛋白质检测试剂的建议，以及这些试剂的使用请遵循制造商的说明书。
      3. 通过SDS-PAGE电泳分析未经处理的OS和OxOS样品³⁰ 在4%-15%的梯度凝胶上，使用标准的Tris-甘氨酸SDS缓冲液进行电泳。初始以80 V电压运行，直至样品进入分离胶，随后在室温下以120 V电压继续电泳50-60分钟。
      4. 使用标准方案用考马斯亮蓝染色凝胶³¹考马斯亮蓝染色将显示紫外线处理诱导的交联是否充分。

2. 在RPE培养物中构建类脂褐素颗粒（UAM）

1. OxOS 喂养：剂量、频率及吞噬作用桥接配体
   注意：喂养操作在第1代人iPSC-RPE或hfRPE培养物上进行，这些培养物按照Bharti实验室（针对iPSC-RPE）所述方案培养³² 或我们此前概述的 hfRPE 方案，该方案改编自 Sheldon Miller 实验室的方法^22,23所有以下计算均基于向一个24孔Transwell（6.5 mm直径，0.33 cm²）中添加OxOS或OS² 生长区域）。
   1. 解冻 25 µL 的 5.6 x 10⁷ 在37 °C下将OxOS/mL与45 µL细胞培养基混合，得到终体积为70 µL的溶液。
      注意：在步骤1中制备的OxOS分装样品将含有吞噬作用桥接配体MFG-E8和Protein S。然而，如果在冷冻前未将这些配体添加至分装样品中，则可在本步骤中补加，确保配体在终末培养基中的终浓度为Protein S 4 µg/mL、MFG-E8 1.5 µg/mL。如步骤1.1.11所述，针对其他类型的RPE细胞或不同细胞密度，桥接配体的浓度可能需要调整。
   2. 从Transwell中移除顶端培养基，并加入70 µL的2 × 10⁷ 将含吞噬桥接配体的 OxOS/mL 加入上室。24 小时后移除并更换为新的 OxOS 培养液。在工作日每天进行换液，周末跳过，持续至完成 20 次喂养（约 1 个月）。每周更换 2–3 次基底外侧培养基（400–550 µL）。
   3. 完成20次喂养后，恢复对该孔的常规培养基更换。
      注意：需要进行数次额外的培养基更换才能将RPE顶面粘附的OxOS完全洗脱，因此含UAM的培养物必须在OxOS喂养结束后至少1-2周方可开展实验。
      注意：通过氧化外节（OxOS）喂养诱导UAM积聚时，设置适当的对照组至关重要。由于每日更换培养基可能影响RPE的生物学特性，建议设置以下对照孔：对照1：在工作日每日更换培养基，更换次数与OxOS处理组相同。对照2：在工作日每日向RPE喂养未经处理的外节（OS），喂养浓度和体积与OxOS喂养相同，喂养次数也与OxOS处理组一致。
2. 通过跨上皮电阻（TEER）和细胞死亡检测监测富含类脂褐素颗粒的培养物的健康状况
   注意：在进行氧化应激（OxOS）喂养期间及之后，可通过评估视网膜色素上皮（RPE）细胞紧密连接完整性和细胞死亡情况来检测RPE培养物的健康状态。已有研究证实，通过测量跨上皮电阻（TEER）来评估紧密连接完整性，是反映细胞总体健康状况的敏感指标。³³更传统的细胞死亡非侵入性标志物，例如乳酸脱氢酶（LDH）的释放，也可被采用。
   1. 进行 TEER 测量
      注意：跨上皮电阻（TEER）使用跨上皮电阻仪和TEER电极进行检测，通常遵循制造商的说明（参见 材料表).
      1. 为对TEER电极进行灭菌，使用浸有70%乙醇的任务擦拭纸清洁电极，然后将电极探头尖端浸入70%乙醇中10分钟。
      2. 让电极完全干燥，然后将其浸入无菌培养基中。
      3. 将探针从无菌培养基中取出，然后将TEER电极的两个探针分别插入培养于Transwell中的细胞层的顶端室和基底外侧室；较长的探针尖端插入基底外侧室。
         注意：在缺乏练习的情况下，TEER电极很容易刮擦到顶室底部，从而破坏融合的视网膜色素上皮（RPE）单层，导致TEER读数发生显著变化。因此，建议初学者在正式实验前先在非关键性的Transwell上进行练习。此外，每次检测完一批RPE培养物后，实验人员应在标准组织培养显微镜下检查RPE单层是否受到刮擦。
      4. 当顶端和基底外侧探针在Transwell中就位后，按下 读取 按下仪表上的按钮或踩下脚踏开关以记录TEER值。在不同培养板或细胞组之间，使用无菌培养基清洗电极探头。若感染风险较高，应在各培养板之间重新灭菌。
      5. 通过测量仪读取电阻值，减去无细胞但含有培养基的空白Transwell的电阻值（对于0.33 cm²的24孔Transwell，通常为100–110 Ω），计算TEER。² 表面积），然后乘以Transwell的表面积。
         注意：TEER 值必须按细胞表面积进行标准化后报告。健康 hfRPE 培养的典型值范围为 350–1100 Ωcm²TEER 值随温度降低而升高。因此，当将培养物从 37 °C 培养箱转移至室温操作台时，TEER 值在整块板上往往会升高。为避免此类变异，可选择迅速操作（如有经验），或等待 10–15 分钟，使板的温度与室温达到平衡。
   2. 进行LDH释放实验
      注意：细胞死亡过程中乳酸脱氢酶（LDH）会释放到细胞培养上清液中，可使用标准试剂盒进行检测（参见 材料表).
      1. 在细胞孵育24小时后，收集细胞上清液，并用标准培养基按1:100比例稀释。
      2. 通过向24孔Transwell中对照细胞的100 µL顶侧培养基加入2 µL 10% Triton X-100，诱导乳酸脱氢酶（LDH）的完全释放，这对于标准化步骤2.2.2.1中所有数值至关重要。将Triton与细胞上清液混合物在37 °C孵育15分钟后，混匀已裂解细胞上方的培养基并收集，用于测定最大可能的LDH释放量。
      3. 收集上清液后，按照试剂盒制造商的标准操作说明进行检测，使用试剂盒的缓冲液孵育30分钟后测定发光信号。
         注意：所有LDH值均已相对于LDH总释放量进行归一化处理。
3. 脂褐素样颗粒光谱与成分的表征
   1. 获取自体荧光定量与光谱数据
      1. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定含 UAM 的培养物 15 分钟，随后用 PBS 洗涤 5 次。
      2. 在顶端室中保留少量 PBS，然后将 Transwell 小室倒置。在解剖显微镜下，用剃刀片从 Transwell 上切割半透膜，切割时作用力施加于膜与 Transwell 的连接处。
         注意：切割位置应始终与Transwell小室边缘保持一致距离，因为若切割位置不一致，Transwell膜容易发生变形和皱褶。
      3. 一旦剪下Transwell小室膜，立即用镊子将其放置在显微镜载玻片上，注意避免触碰带有细胞的部分。用擦拭纸吸去多余的PBS，注意不要接触细胞。加入封片剂并盖上盖玻片。务必记录清楚Transwell膜的哪一侧 "正面向上" 在覆盖Transwell时
      4. 使用与步骤1.3.1.4和步骤1.3.1.5相同的设置和程序获取自发荧光强度和光谱。
         注意：在对UAM进行成像时，一个重要的混杂因素是OxOS具有自发荧光，并且在OxOS喂养结束后，常常会附着于RPE顶端表面数天，甚至数周。因此，在定量UAM时，必须采用一种方法以确保所检测到的自发荧光来源于UAM而非残留的OxOS。最简便的方法是使用视紫红质抗体对脂褐素培养物进行共染色。例如，可使用抗视紫红质抗体4D2（1:1000稀释），并结合标准的PFA固定免疫细胞化学实验方案。³⁴二抗应选择远红染料标记的抗体（例如激发波长最大值接近647 nm），因为UAM和OxOS的自发荧光在此波长范围内最弱。随后可依次在两个通道中采集共聚焦图像：一个通道使用405 nm激光激发UAM和OxOS的自发荧光，收集415 nm至550 nm的发射光；另一个通道则采用标准的远红染料成像参数，用于检测残留的视紫红质信号，该信号指示未被消化的OxOS。图像采集完成后，可在ImageJ等软件中将视紫红质通道用作减影掩模，以去除黏附残留OxOS所产生的自发荧光，从而仅保留UAM的自发荧光信号用于定量分析。
         警告：即使未发生光氧化的外节段（OS）也存在一定程度的自发荧光，且即使经过严格洗涤，仍会有一些OS和氧化型外节段（OxOS）黏附在视网膜色素上皮（RPE）表面。因此，若不按照上述注释中的建议，利用视紫红质免疫染色生成减影掩模，则无法准确量化在喂养OxOS或标准OS的培养物中UAM的自发荧光水平。
   2. 同时检测脂褐素样颗粒与其他免疫荧光标记物
      注意：如步骤 2.3.1 中所述，脂褐素的广泛自发荧光光谱限制了荧光共染色的选择。可考虑采用以下方法以促进共染色。
      1. 使用远红荧光染料。脂褐素的自发荧光在近红外区域较弱。因此，利用远红染料对目标抗原进行荧光检测，并结合共聚焦显微镜通道设置的精细调整，通常可区分自发荧光与共染荧光。
      2. 利用脂褐素的长荧光发射尾部特性。
         注意：由于脂褐素具有非常宽的荧光发射光谱，通常可在较短波长（如405 nm激光）激发，并在光谱的橙/红区域（如585–635 nm）仍能检测到其发射信号。这种独特的激发与发射波长组合通常可根据其他共染荧光染料进行调整。
         1. 使用激发峰位于约488 nm、发射光检测范围为500–530 nm的荧光染料检测目标抗原。另设置一个自发荧光检测通道，激发波长为405 nm，发射光检测范围为585–635 nm。该第二通道仅检测UAM，而第一通道将同时检测目标抗原和脂褐素。
         2. 使用 ImageJ 等免费软件，将第二个仅含 UAM 的通道用作减法掩模，从第一个通道（包含抗原信号和 UAM 信号）中去除 UAM 信号。
      3. 利用光谱解混。大多数现代共聚焦显微镜均配备光谱解混功能。该方法允许分别采集仅含自发荧光物质（UAM）的样本光谱，以及仅含目标共染荧光染料的样本光谱。随后对同时含有UAM和共染荧光染料的实验样本进行成像，并采用线性解混方法计算信号中来自自发荧光与共染荧光各自所占的百分比。
         注意：大多数现代共聚焦显微镜均提供光谱解混的综合指南。
      4. 利用荧光寿命成像。尽管UAM与目标共染荧光染料的发射光谱可能相似，但它们的荧光寿命很可能存在显著差异。通常情况下，UAM的荧光寿命比大多数特异性荧光染料更短。若具备可进行寿命成像的共聚焦显微镜，可通过设定荧光信号门控，选择性检测长于典型脂褐素荧光寿命的信号。
         注意：通常情况下，将荧光寿命门控设置为长于 2 ns 的信号可大幅减少 UAM 污染，但并不能完全消除该信号。
      5. 使用自发荧光抑制剂。传统上，在进行特异性免疫荧光染色前，常采用苏丹黑来淬灭自发荧光³⁵市面上有多种商用自发荧光淬灭产品声称比苏丹黑的效果更优，这些产品在文中均有详细说明。 材料表自发荧光淬灭当然会破坏对脂褐素的检测能力。
   3. 确定类脂褐素颗粒的组成
      1. 评估中性脂质
         1. 在室温下用4%多聚甲醛固定含UAM的RPE孔和对照孔（喂养未经处理的OS），持续15分钟，随后用PBS洗涤5次。
         2. 使用含3% BSA的PBS溶液配制10 µg/mL Nile Red或3.33 µg/mL Bodipy 493/503，在室温下对中性脂质染色1小时，随后用PBS洗涤5分钟，重复3次。
         3. 按照步骤2.3.1.2和2.3.1.3所述剪切并安装Transwell，然后进行成像。通常，成像时使用以下激发和发射波长范围：Nile Red——激发543 nm，发射620–700 nm；Bodipy 493/503——激发488 nm，发射500–550 nm。
      2. 测定酯化与非酯化胆固醇
         1. 参照步骤 2.3.3.1.1
         2. Filipin 是一种荧光染料，可识别游离胆固醇，但不能识别酯化胆固醇³⁶因此，为了检测UAM中总胆固醇（游离胆固醇和酯化胆固醇）的含量，首先需用胆固醇酯酶预处理样品，将酯化胆固醇转化为游离胆固醇。用20 U/mL胆固醇酯酶溶于0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.2）中处理细胞（参见 材料表在37 °C下孵育3.5小时，随后用PBS洗涤，每次5分钟，共3次。
         3. 用 50 µg/mL 的 filipin 染色（参见 材料表在室温下用 PBS 孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。样品需避光覆盖保存，因为 filipin 易发生光漂白。
            注意：如果仅需定量游离胆固醇，可省略步骤 2.3.3.2.2 中的胆固醇酯酶处理。若需定量酯化胆固醇，可通过样品中总胆固醇与游离胆固醇的差值计算得出。
         4. 按照步骤 2.3.1.2 和 2.3.1.3 剪下并安装 Transwell，然后进行成像。
            ​注意：成像 filipin 时，其光漂白速度非常快。需尽量降低激发光的强度和照射时间，并需意识到即使通过目镜观察样本，也可能发生一定程度的光漂白。因此，进行成像时应做到：（1）使用 filipin 通道以外的荧光通道寻找合适的成像区域；（2）在宽场显微镜而非共聚焦显微镜上对 filipin 进行成像（以减少光照强度）；（3）避免对同一区域进行重复成像。通常情况下，filipin 成像应使用以下激发和发射波长带：ex 380 nm，em 480 nm。

3. 评估类脂褐素颗粒对RPE吞噬作用的影响：总消耗能力

注意：通过以下仅使用外节段（OS）脉冲的方案测量OS吞噬作用的原理详见代表性结果部分。该方法称为"总消耗能力"，可避免传统OS脉冲-追踪吞噬实验中可能出现的吞噬效率解释上的歧义。实验在24孔Transwell板中进行，每孔加入含4 × 10⁶ OS/mL的50 µL培养基。

1. 计算实验所需的孔数，然后解冻适量的常规外节段（OS），在室温下以 2400 × g 离心 5 分钟，重悬于标准 RPE 细胞培养基中，使其浓度为 4 × 10⁶ OS/mL。添加衔接配体以促进吞噬作用速率。
   注意：加入培养基中供细胞摄取的衔接配体终浓度为 Protein S 4 µg/mL 和 MFG-E8 1.5 µg/mL。如步骤 1.1.11 所述，对于其他类型的 RPE 或不同细胞密度，衔接配体的浓度可能需要调整。
2. 移除顶侧培养基，加入 50 µL 浓度为 4 × 10⁶ OS/mL 的外节段悬液，最好含有适当浓度的衔接配体。
3. 在加入外节段后的不同时间点（例如：0 h、1 h、4 h 和 24 h），向每孔加入 16.67 µL 含蛋白酶抑制剂的 4× Laemmli 上样缓冲液，以裂解细胞及上方含有外节段的上清液。使用 P-200 移液器轻轻刮擦 Transwell 膜表面，注意避免刺破膜或使膜从 Transwell 上脱落，并将细胞上清液与细胞裂解液合并收集。涡旋混匀后离心，室温放置 30 分钟以确保充分变性。
   警告：尽管使用上样缓冲液裂解外节段，但后续不得加热裂解液，因为加热可能引起视紫红质聚集。此外，在准备储存前应避免冷却裂解后的外节段，否则会导致蛋白质沉淀。未使用的裂解液应于 -20 °C 冻存，使用前确保完全解冻。
4. 采用与步骤 1.3.3 相同的条件进行 SDS-PAGE 电泳，每孔上样等体积的裂解液。应使用 GAPDH、β-actin 或其他管家蛋白作为内参以校正细胞数量，因为吞噬速率依赖于细胞数量。
5. 使用针对视紫红质 N 末端或 C 末端的抗体进行 Western 印迹检测。采用标准 Western 印迹条件，抗体稀释比例见材料表。
   注意：在主视紫红质条带下方会出现多个视紫红质片段。这些片段代表部分降解的视紫红质，该过程始于吞噬体与溶酶体融合之前^32,33。与对照组 RPE 相比，若负载 UAM 的 RPE 中视紫红质片段数量增加，可能提示吞噬溶酶体功能存在下游缺陷，涉及吞噬体-溶酶体融合、溶酶体酸化和/或降解酶功能异常^16,34,35。

结果

OS 光氧化的实验装置如图 1Ai所示。聚四氟乙烯涂层载玻片可在每个开放矩形区域中加载大量 OS 溶液，且不会扩散至载玻片其他区域。载有 OS 的载玻片置于无盖的无菌培养皿中，并将紫外灯置于载玻片上方，如图 1Aii所示。或者，也可将载玻片放入紫外交联仪中，如图 1Aiii所示。光氧化处理后，通过显微镜和流式细胞术检测，OS 的自发荧光显著增强（图 1B）。光氧化后蛋白质交联的程度可通过考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 进行评估，表现为优势蛋白条带（单体视紫红质）转化为高阶聚集体并出现弥散条带（图 1C）。比较手持式紫外灯（图 1Aii）与紫外交联仪（图 1Aiii）的处理效果表明，手持式紫外灯产生的 OxOS 其自发荧光...

讨论

尽管RPE脂褐素已被研究数十年，但其毒性仍存在争议^2,9,16,42鉴于动物模型中关于脂褐素毒性的不确定性¹¹, 体外 使用人视网膜色素上皮（RPE）的模型具有重要价值。多种 体外 已有文献描述过脂褐素累积模型，但均未同时采用外节段喂养和高度成熟分化的人视网膜色素上皮（RPE）培养体系。这种组合代表了一种理想的模型，因为外节段喂养可重现脂褐素累积的方法 体内 且高度成熟的人类RPE培养物最能模拟RPE功能行为 体内有趣的是，在使用高度分化的hfRPE培养物时发现，即使经过反复喂养，常规的OS暴露仍不足以诱导产生类脂褐素物质。¹⁶因此，本方案通过可控的方式对感光细胞外节段进行光氧化（OxOS），从而加速脂褐素的积累过程。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	Corning	#353003	其他品牌也可使用
24孔Transwell小室	Corning	#3470
抗LC3抗体	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 稀释
抗视紫红质抗体 1D4	Abcam	#5417	1:1000 稀释。表位位于C端。
抗视紫红质抗体 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	Western blot使用1:5000稀释，免疫染色使用1:1000稀释。表位位于N端。
自发荧光淬灭剂	Biotium	#23007	TrueBlack 脂褐素自发荧光淬灭剂
自发荧光淬灭剂	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
胆固醇酯酶	Life Technologies	来自A12216试剂盒
共聚焦显微镜	Leica	Leica Stellaris SP8 配备FALCON模块
暗适应牛视网膜	W. L. Lawson Company	暗适应牛视网膜（预解剖）	联系方式： https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
菲林	Sigma-Aldrich	F4767
流式细胞仪	Thermo Fisher	Attune NxT
流式细胞仪分析软件	BD	FlowJo
手持式紫外灯	Analytik Jena US	UVGL-55
人MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
人纯化Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli上样缓冲液	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH检测	Promega	J2380	LDH-Glo 细胞毒性检测试剂盒
封片剂	Invitrogen	P36930	Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂
尼罗红	Sigma-Aldrich	#72485
聚四氟乙烯涂层载玻片	Tekdon	定制	定制规格：PTFE掩膜具有以下"开窗" —   3个玻璃矩形区域，每个尺寸为17 mm × 9 mm，方向为17 mm边距离载玻片顶部和底部各4 mm（假设标准显微镜载玻片尺寸为25 mm × 75 mm）。每个矩形区域之间以及与载玻片边缘的距离至少为6 mm。将PTFE掩膜打印在单面磨砂玻璃载玻片上，以便标记载玻片。
蛋白酶抑制剂	Cell Signaling Technology	#5872
蛋白定量检测试剂盒	Bio-Rad	#5000122 RC DC蛋白定量检测试剂盒
TEER电极	World Precision Instruments	STX3
跨上皮电阻（TEER）测量仪	World Precision Instruments	EVOM3
紫外交联仪	Analytik Jena US	UVP CL-1000