改进脂褐素模型和高极化人视网膜色素上皮培养物中外段吞噬能力的定量

Summary

该协议描述了高度分化和极化的人视网膜色素上皮（RPE）培养物中的脂褐素积累模型和改进的外段（OS）吞噬测定，以检测RPE的总OS消耗/降解能力。这些方法克服了以前的脂褐素模型和经典的脉搏追逐外段吞噬测定的局限性。

Abstract

视网膜色素上皮（RPE）对感光器外段的日常吞噬作用有助于细胞内衰老色素（称为脂褐素）的积累。脂褐素的毒性在斯塔加特病（最常见的遗传性视网膜变性）中已得到充分证实，但在年龄相关性黄斑变性（AMD）中更具争议性，AMD是发达国家不可逆失明的主要原因。确定人类脂褐素的毒性一直很困难，斯塔加特的动物模型毒性有限。因此，需要模拟人类体内RPE的体外模型来更好地了解脂褐素的产生，清除和毒性。迄今为止，大多数细胞培养脂褐素模型都在细胞系中，或者涉及向RPE喂食复杂脂褐素混合物的单一组分，而不是整个感光器外段的片段/尖端，从而产生更完整和生理性的脂褐素模型。这里描述的是一种诱导脂褐素样物质（称为不可消化自发荧光材料，或UAM）在高度分化的原代人产前RPE（hfRPE）和诱导多能干细胞（iPSC）衍生RPE中积累的方法。UAM通过重复喂食由RPE通过吞噬作用吸收的紫外线处理的OS片段在培养物中积累。还讨论了UAM在体内与脂褐素近似和不同的关键方法。在这种脂褐素样积累模型的同时，介绍了用于区分UAM颗粒的宽自发荧光光谱与并发抗体染色的成像方法。最后，为了评估UAM对RPE吞噬能力的影响，引入了一种量化外段片段/尖端摄取和分解的新方法。该方法被称为"总消耗容量"，克服了经典外段"脉冲追逐"测定中固有的RPE吞噬能力的潜在误解。这里介绍的模型和技术可用于研究脂褐素的生成和清除途径以及推定的毒性。

Introduction

视网膜色素上皮（RPE）为上覆的光感受器提供关键支持，包括感光器外段尖端或片段的日常摄取和降解（在整个协议中，缩写OS代表OS尖端或片段，而不是整个外段）。这种对有丝分裂后RPE的每日摄取最终使吞噬溶酶体容量过载，并导致难以消化的自发荧光细胞内物质（称为脂褐素）的积聚。有趣的是，一些研究还表明，RPE脂褐素可以在没有OS吞噬作用的情况下积累^1，2。脂褐素具有许多成分，包括源自视觉周期类视黄醇的交联加合物，对于80岁以上的人来说，可以占据RPE细胞体积的近20%³。

脂褐素是否有毒一直备受争议。斯塔加特病是光感受器和RPE的常染色体隐性变性，其中ABCA4的突变触发了光感受器外段内含有的视觉周期类视黄醇的不当处理。不正确的类视黄醇加工会导致异常交联和双类视黄醇物种的形成，包括双类视黄醇 N-视黄亚基亚基-N-视黄基乙醇胺 （A2E）。研究表明A2E毒性的多种机制^4，5。脂褐素有助于临床成像期间眼底自发荧光信号，Stargardt 的患者和动物模型均在视网膜变性前显示眼底自发荧光增加，表明脂褐素水平与毒性之间存在相关性^6，7。然而，随着年龄的增长，脂褐素会在所有人体内积累而不会引发RPE变性。此外，在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，RPE变性仅发生在老年患者中，具有早期和中期形式的疾病的患者比年龄匹配的非^{患病人类具有}更少的眼底自发荧光信号8。这些临床发现已在组织学水平上得到验证^9，10。

RPE脂褐素积累的动物模型也对脂褐素的毒性留下了一些模糊性。ABCA4敲除小鼠在色素背景上不显示视网膜变性，而在白化背景或暴露于蓝光^11，12时则显示视网膜变性。此外，通过ABCA4敲除产生的脂褐素的毒性可能与自然衰老时发生的更缓慢积累的脂褐素不同，如AMD¹³所示。

脂褐素积累的体外模型为研究脂褐素积累对RPE健康的影响提供了一种替代方案。这种模型允许操纵脂褐素成分，从喂养单个类视黄醇成分到喂养OS，并允许在人类而不是动物RPE中进行研究。在过去的几十年中，已经开发了多种方法来模拟培养中的RPE脂褐素。与其他小组一起，Boulton博士的小组每天通过4至7个来自4至85岁¹⁴岁供体的人类原代RPE细胞喂食牛OS长达三个月。或者，自噬的抑制也导致脂褐素在第3至7代原代人RPE培养物中积累¹⁵。然而，在高度分化的传代1代原代人产前RPE（hfRPE）培养物中，亚致死性溶酶体抑制未能诱导脂褐素，即使每天重复添加^OS16。

作为一种更还原的方法，其他人将单一脂褐素成分喂入培养物中，尤其是双类维生素A2E^4，17。这些研究很有价值，因为它们定义了单个脂褐素成分的潜在直接毒性机制，例如涉及溶酶体胆固醇和神经酰胺稳态¹⁸。同时，关于A2E¹⁹的毒性存在争议，将其直接喂给细胞绕过脂褐素积累的典型途径，这涉及光感受器OS的吞噬作用。为了将脂褐素的所有成分输送到RPE培养物中，Boulton和Marshall从人眼中纯化了脂褐素，并将其喂入传代4至7来自胎儿和老年人类供体的人类原代RPE培养物²⁰。虽然具有创新性，但该方法代表了重复实验的有限脂褐素来源。

虽然在许多系统中重复喂食 OS 到 RPE 培养物会产生脂褐素，但在高度分化的原代 RPE 培养物中却无法做到这一点¹⁶。光氧化OS诱导交联反应，如在体内脂褐素形成过程中自然发生的双类视黄醇形成。这可以加速RPE培养系统中脂褐素样颗粒的形成，即使是那些高度分化且抗脂褐素积累的颗粒¹⁶。在这里，介绍了一种诱导脂褐素样颗粒在高度分化的hfRPE和人iPSC-RPE中积累的方法，该方法根据Wihlmark发表的方案²¹进行了修改。该方法的优点是使用与体内脂褐素发生相同的来源（光感受器OS）和途径（吞噬溶酶体OS摄取）诱导脂褐素样颗粒。此外，它是在高度分化并在多项研究中验证的人类 RPE 培养物上进行的，以在体内复制人类 RPE ²²，^23，24。 这些脂褐素样颗粒被称为难消化的自发荧光材料（UAM），并在该协议中提供了将UAM与体内脂褐素进行比较的数据和讨论。 除了在高度分化的人类RPE中构建和评估UAM培养物的方法外，还介绍了一种评估RPE OS吞噬作用的更新方法。已经介绍了多种用于定量OS吞噬作用的优秀脉冲追踪方法，包括蛋白质印迹、免疫细胞化学和FACS²⁵，^26，27。然而，在OS脉冲追逐的早期，导致OS摄取不良的条件可以与促进内部OS快速退化的条件混为一谈。此处介绍的方法测量 RPE 完全消耗/降级的引入操作系统的总量（"总消耗容量"），有助于消除这种歧义。预计利用这些方案对脂褐素毒性的见解，包括使用"总消耗容量"方法对OS吞噬速率的影响，将用于阐明脂褐素在体内的毒性。

Protocol

涉及获取和使用人体组织的本协议已由密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）审查和批准。

1.光氧化外段尖端和碎片的制备

注意:深色适应的牛视网膜是在冰上购买和运输的（见 材料表）。从这些视网膜中，按照先前发布的方案²³纯化OS。

1. 外段与紫外灯交联
   1. 将聚四氟乙烯涂层载玻片（参见 材料表）完全浸入70%乙醇中，在生物安全柜中10分钟以对载玻片进行灭菌。让载玻片在无菌的100mm细胞培养皿中风干。
   2. 将每张载玻片放入一个新的 100 mm 细胞培养皿中，并将 200 μL 含血清的细胞培养基（通常用于手头的 RPE 培养物的任何培养基）加入每个矩形中，然后将手持式 254 nm 紫外光（参见 材料表）放在 100 mm 细胞培养皿（无盖）上，灯泡直接面向载玻片， 并曝光20分钟。专门用于本研究的培养基和培养基组件的具体产品编号已于^{先前发布22，23}。该介质在整个协议中称为"RPE 介质"。
      注:介质的紫外线处理会阻挡玻璃表面，并防止操作系统在后续步骤中粘连。
   3. 在37°C（ 手持或通过水 浴）解冻OS的冷冻等分试样。所需的操作系统数量取决于应用程序。通常，载玻片上每个矩形最多可处理 500 μL 的 2 x 10⁸ OS/mL。
   4. 解冻后，在室温下以2400 x g 旋转OS5分钟。立即使用移液管而不是真空吸出生物安全柜中的上清液，以防止沉淀意外丢失。
   5. 用无菌PBS轻轻重悬沉淀。
      注意:跟踪重新悬浮的体积和预期的浓度。例如，用 500 μL PBS 从 1 x 10 8 OS/mL 的 1 mL 管中重悬沉淀可产生 2 x 10⁸ OS/mL。聚四氟乙烯包被的载玻片上每个矩形的最大体积和浓度为 500 μL 的 2 x 10⁸ OS/mL。
   6. 从载玻片中吸出培养基，并在载玻片的每个矩形上放置多达 500 μL 的 2 x 10⁸ OS/mL PBS 溶液。将手持式紫外线放在细胞培养皿（无盖）上，灯泡直接面向操作系统。 将OS溶液暴露在254 nm光下40分钟。
      注意:在40分钟的曝光期间，用毛巾或吸收垫盖住紫外线灯和盘子，关闭生物安全柜窗扇，然后关闭鼓风机。这将防止发生任何显着的蒸发。如果研究人员无法获得本协议中使用的紫外灯，则有两种选择可确保实现适当量的交联。第一种是遵循步骤1.2中概述的定量紫外线暴露，要么使用步骤1.2中概述的设备，要么使用可以提供与1.2中所述设备相同的定量辐射暴露的其他设备。另一种选择是将OS暴露在紫外线照射下一段时间，以诱导 图1C所示的考马斯染色剂上的交联程度。
   7. 将处理过的OS PBS溶液收集在无菌微量离心管中，用200-500μLPBS（2-3x）重新洗涤涂层载玻片的矩形，并在微量离心管中收集每次洗涤。完成后，在组织培养室显微镜下观察载玻片，以确认几乎所有OS都已从载玻片中移除。
   8. 在室温下以 2400 x g 离心 OS PBS 溶液 5 分钟，用移液器在生物安全柜中吸出 PBS，并重悬于将用于 RPE 培养的 500 μL 标准培养基中（例如 - 第 1.1.2 节中定义的"RPE 培养基"）。重悬体积可以根据所需的光氧化OS（OxOS）浓度进行调整。
   9. 将 10 μL 悬浮液放入新的微量离心管中，用更多细胞培养基稀释 50-100 倍，并用血细胞计数器计数 OS。
   10. 根据OS计数，将OxOS悬浮液稀释至最终原液浓度。为了在24孔Transwell（表面积为0.33 cm 2;参见材料表）中补料高度成熟的RPE培养物，建议最终培养基浓度为² x 10⁷ OS/mL。
       1. 为此，将 OxOS 以 5.6 x 107 OS/mL 浓度将 OxOS 分配到 25 μL 等分试样中，悬浮在标准 RPE 培养基中。解冻 25 μL 等分试样后，将整个等分试样与 45 μL 标准 RPE 培养基混合，每次 OxOS Transwell 补料的最终培养基体积为 70 μL，OS 浓度为 2 x 10⁷ OS/mL。
   11. 在等分OxOS之前，添加吞噬作用桥接配体（蛋白S和MFG-E8，参见 材料表），以促进OS摄取和脂褐素积累。24孔Transwell中桥接配体的工作浓度对于人纯化的蛋白S为4μg/mL，对于人重组MFG-E8为1.5μg/mL。因此，对于 5.6 x 10⁷ OS/mL 的 25 μL 等分试样 OxOS，蛋白 S 的储备浓度为 11.2 μg/mL，MFG-E8 的储备浓度为 4.2 μg/mL。
       注意:桥接配体浓度针对24孔Transwell上的hfRPE培养物进行了优化，每0.33cm² 孔的细胞计数约为320，000个细胞。配体浓度可能需要针对其他RPE类型和细胞密度进行调整，因为存在超过吞噬受体可用性的配体可能会矛盾地阻断OS摄取²⁸。
   12. 将等分试样快速冷冻在液氮中。
       注:多次冻融对操作系统完整性非常不利。
2. 使用UV交联剂装置进行外段交联
   注意:执行步骤 1.1，但以下步骤除外，它们分别替换步骤 1.1.2 和 1.1.6:
   1. （替换步骤 1.1.2）将每张载玻片放入一个新的 100 mm 细胞培养皿中，并向每个矩形中加入 200 μL 含血清的细胞培养基（例如"RPE 培养基"或任何其他替代品），然后将载玻片放入紫外交联剂装置中（参见 材料表），用 254 nm 紫外线以 3-6 J/cm² 的辐射曝光处理，以阻挡玻璃表面并防止 OS 粘连在后续步骤中。
   2. （替换步骤 1.1.6）从载玻片中吸出培养基，并将多达 500 μL 的 2 x 10⁸ OS/mL 置于载玻片的每个矩形的无菌 PBS 中。将载玻片放入紫外交联剂装置中，根据需要设置处理辐射曝光（3-9 J / cm²），并在254nm处处理。
      注意:可以通过滴定3-9 J / cm² 之间的辐射暴露来仔细确定所需的辐射暴露，直到达到自发荧光的程度，并且实现蛋白质交联（ 如图1B 和 图1C所示）。
      注意:在生物安全柜外处理OS可能会导致污染。将OS暴露于UV交联器装置后，用无菌移液器吸头收集OS，转移到无菌微量离心管中，并在生物安全罩中处理所有进一步的步骤。
3. 氧化OS的表征
   1. 通过成像量化自发荧光发射光谱
      1. 将来自未处理的OS和OxOS的20-50 μL储备溶液放入两个单独的微量离心管中。在室温下以2400× g 离心5分钟，将沉淀重悬于缓冲（例如PBS）4%多聚甲醛中，并在室温下固定15分钟。
      2. 固定后，如上所述向下旋转，用PBS x 2洗涤（两次洗涤之间旋转），然后重悬于少于30μL的PBS中。
      3. 将几微升重悬液放在显微镜载玻片上，加入安装介质（见 材料表），最后加入盖玻片。
      4. 在共聚焦显微镜上成像OxOS（见 材料表）。
         注意:OxOS自发荧光可以被很宽范围的激光波长激发，但通常采用405 nm或488 nm激光线。发射范围同样广泛，但典型的GFP/FITC激发/发射滤光片设置足以观察自发荧光。
      5. 要测量OxOS发射光谱，请在共聚焦显微镜上使用λ扫描。典型的 λ 扫描设置包括 405 nm 或 488 nm 激发，以及检测从激光激发线红移 10 nm 一直到大约 800 nm 的发射，λ 步长为 10 nm。每个显微镜系统都有自己的关于如何使用λ模式的说明，读者需要参考手册以了解其特定的共聚焦。
   2. 作为替代方案，通过流式细胞术定量自发荧光。
      1. 在微量离心管中旋转 2 x 10 7 未处理的 OS，并分别旋转 2 x 10⁷ OxOS，并重悬于 1 mL PBS 中。
         注意:如果在解冻后直接进行流式细胞术，则不需要固定。
      2. 将未经处理的OS和OxOS样品加载到流式细胞仪上（参见 材料表）。将前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 调整为 FSC-SSC 散点图中可接受的散射。使用PBS作为对照，以排除任何污染的小颗粒。请注意，操作系统比单元小得多。
      3. 使用流式细胞仪的标准FITC通道进行自体荧光定量。至少计算 10，000 个事件。使用 FITC直方图的脉冲面积值来表示荧光强度。
         注意:对于本研究，所有数据均按照制造商的说明使用流式细胞仪分析软件（见 材料表）进行分析。
   3. 评估 OxOS 中的交联程度
      1. 在微量离心管中旋转 2 x 10 7 未处理的 OS，并分别旋转 2 x 10⁷ OxOS。除去上清液，通过加入1.2x Laemmli样品缓冲液（足以覆盖;参见材料表）直接裂解沉淀。涡旋，在室温下保持30分钟，在室温下以等于或大于12000×g旋转10分钟，并收集上清液。
         注意:评估 OxOS 中的蛋白质交联程度可以了解紫外线处理的充分性。在未经处理的OS和OxOS之间进行比较，当主导考马斯染色的单体视紫红质条带（图1C，箭头）刚刚可察觉，出现更高阶的聚集体和凝胶顶部的蛋白质涂片时，就会发生充分的交联。
         注意:使用样品缓冲液裂解OS时，请勿随后加热裂解液，因为这会触发视紫红质聚集。还要避免冷却裂解的操作系统，直到准备好存储，因为这会沉淀 SDS。未使用的裂解物可以保存在-20°C。 如果重新洗，请确保裂解物在使用前在室温下完全解冻。
      2. 使用耐受高SDS和还原剂浓度的蛋白质测定法定量蛋白质浓度²⁹。有关适当蛋白质测定试剂的建议，请参阅 材料表 ，并遵循这些试剂的制造商协议。
      3. 使用标准三甘氨酸SDS缓冲液，在4%-15%梯度凝胶上通过SDS-PAGE电泳³⁰ 运行未经处理的OS和OxOS样品。凝胶在80V下运行，直到样品进入堆栈，然后在室温下以120V运行50-60分钟。
      4. 使用标准方案³¹用考马斯蓝染色凝胶。考马斯染色将证明紫外线处理诱导的交联的充分性。

2. 在 RPE 培养物中构建脂褐素样颗粒 （UAM）

1. OxOS 喂养:数量、频率和吞噬作用桥接配体
   注意:在第1代时，在人iPSC-RPE或hfRPE培养物上发生喂养，根据Bharti实验室（用于iPSC-RPE）³² 或我们之前概述的hfRPE方案（改编自Sheldon Miller实验室^22，23）概述的方案生长。以下所有计算均基于将 OxOS 或 OS 喂入一个 24 孔 Transwell（直径 6.5 mm，0.33 cm² 生长区域）。
   1. 在 37 °C 下解冻 25 μL 的 5.6 x 10⁷ OxOS/mL，并将 45 μL 细胞培养基加入 OxOS 等分试样中，最终体积为 70 μL。
      注意:在步骤1中制备的OxOS等分试样将包含吞噬作用桥接配体MFG-E8和蛋白S。但是，如果在冷冻之前未将这些配体添加到等分试样中，则可以在此步骤中添加它们，以确保待补料细胞培养基中配体的最终浓度对于蛋白质S为4μg/ mL，对于MFG-E8为1.5μg/ mL。如步骤1.1.11中所述，对于其他RPE类型或细胞密度，可能需要改变桥接配体的浓度。
   2. 从Transwell中取出顶端培养基，并向顶端室中加入70 μL的2 x 10⁷ OxOS/mL，并带有吞噬作用桥接配体。24小时后，取出并更换新的OxOS喂食。每天在工作日喂食，跳过周末，直到完成 20 次喂食（~1 个月）。每周更换基底外侧细胞培养基（400-550μL）2-3次。
   3. 完成20次进水后，恢复井的正常介质更换。
      注意:需要更换几次额外的培养基才能从RPE顶端表面洗掉粘稠的OxOS，因此必须在OxOS喂养结束后至少1-2周对含有UAM的培养物进行实验。
      注意:通过 OxOS 馈送对 UAM 积聚进行适当控制非常重要。由于每日培养基变化会影响 RPE 生物学，因此建议使用以下对照孔: 对照 1:在工作日每天更换培养基，喂食次数与 OxOS 处理组相同。对照 2:在工作日每天以与 OxOS 喂养相同的浓度和体积喂食未经处理的 OS，喂食次数相同。
2. 通过经上皮电阻 （TEER） 和细胞死亡测定监测富含脂褐素样颗粒的培养物的健康状况
   注意:在 OxOS 喂养期间和之后，可以通过评估 RPE 紧密连接完整性和细胞死亡来测量 RPE 培养物的健康状况。先前已经表明，通过测量经上皮电阻（TEER）来评估紧密连接完整性是一般细胞健康的敏感标志^物33。也可以使用更传统的非侵入性细胞死亡标志物，例如乳酸脱氢酶（LDH）的释放。
   1. 执行 TEER
      注意:TEER 使用经式上皮电阻 （TEER） 计和 TEER 电极进行测试，通常遵循制造商的说明（参见 材料表）。
      1. 要对TEER电极进行消毒，请使用浸泡在70%乙醇中的任务刮水器清洁电极，然后将电极探针的尖端浸入70%乙醇中10分钟。
      2. 让电极完全干燥，然后将电极浸入无菌介质中。
      3. 从无菌培养基中取出探针，并将TEER电极的两个探针插入培养的Transwell的顶端和基底外侧室中;较长的探头尖端适合基底外侧腔室。
         注意:无需练习即可用TEER电极刮擦顶端室的底部很容易，并且随着汇合的RPE单层被破坏，这种刮擦将显着改变TEER读数。因此，建议初学者在测试实验性RPE培养物之前，先在不重要的Transwell上练习。此外，在测试每块RPE培养板后，实验者应在标准组织培养显微镜下检查RPE单层是否有任何刮擦。
      4. 一旦顶端和基底外侧探头在Transwell中就位，按下 读取 按钮或踩在仪表的脚踏开关上以记录TEER。在板或细胞组之间，用无菌介质洗涤电极探针。如果感染是一个高度关注的问题，请在平板之间重新消毒。
      5. 计算TEER方法是从仪表中获取电阻读数，减去带有培养基但没有细胞的空白Transwell的值（对于表面积为0.33cm² 的24孔Transwell，通常为100-110 Ω），然后乘以Transwell的表面积。
         注意:TEER 值必须报告归一化到细胞表面积。健康 hfRPE 培养物的典型值范围为 350-1100 Ωcm²。TEER 值随着温度的降低而增加。因此，当将培养物从37°C培养箱中取出到室温罩中时，TEER值将在整个平板上增加。为了防止这种变化，要么快速工作（如果有经验），要么等待10-15分钟，让板温与室温平衡。
   2. 进行乳酸脱氢酶释放试验
      注意:LDH释放到细胞培养上清液中发生在细胞死亡期间，并用标准试剂盒测量（参见 材料表）。
      1. 孵育24小时后从细胞上方收集上清液，并使用标准培养基稀释至1:100。
      2. 通过在 24 孔 Transwell 中将 2 μL 10% triton X-100 添加到来自对照细胞的 100 μL 顶端培养基中，诱导总可能的 LDH 释放，这对于标准化步骤 2.2.2.1 中的所有值很重要。将Triton/细胞上清液混合物在37°C孵育15分钟后，将培养基混合在现在裂解的细胞上方并收集以测量可能的总LDH释放。
      3. 收集上清液后，使用制造商标准说明进行测定，使用试剂盒的缓冲溶液孵育30分钟后测量发光。
         注意:所有 LDH 值都归一化为可能的 LDH 释放总量。
3. 脂褐素样颗粒谱和组成的表征
   1. 获取自发荧光定量和光谱
      1. 在室温下用4%PFA固定含有UAM的培养物15分钟，然后PBS洗涤5次。
      2. 在顶端室中保留少量PBS，然后将Transwell倒置。使用解剖显微镜和剃须刀片，从Transwell上切割半多孔膜，在膜和Transwell的连接处施加切割力。
         注意:关于切口与Transwell边缘的距离保持一致，因为当切割不一致时，Transwell膜有翘曲和起皱的趋势。
      3. 一旦Transwell膜被切割，立即使用镊子放在显微镜载玻片上，小心避免用细胞接触Transwell膜的部分。用任务擦拭擦拭吸走多余的PBS，同时避免接触细胞。添加安装介质和盖玻片。确保在盖上Transwell时跟踪Transwell的哪一侧是"右侧朝上"。
      4. 使用与步骤1.3.1.4和步骤1.3.1.5相同的设置和程序获取自发荧光强度和光谱。
         注意:在对UAM进行成像时，一个重要的混淆因素是OxOS具有自发荧光，并且在OxOS喂养完成后经常粘附在RPE顶端表面数天甚至数周。因此，在定量UAM时，需要采用一种方法来确保测量的自发荧光来自UAM而不是OxOS。最简单的方法是将脂褐素培养物与视紫红质抗体共同染色。例如，抗视紫红质抗体4D2可以以1:1000稀释度和标准PFA固定免疫细胞化学方案³⁴使用。视紫红质的二抗应该是远红色染料偶联抗体（例如激发最大值接近 647 nm），因为 UAM 和 OxOS 自发荧光在该波长下往往最弱。然后可以在两个通道中依次采集共聚焦图像，用405 nm激光激发UAM和OxOS自发荧光，并从415 nm到550nm发射，而残留的视紫红质（指示未消化的OxOS）可以在单独的通道中用标准的远红染料成像参数激发。采集后，视紫红质通道可用作 ImageJ 等程序中的减法掩模，以去除来自粘性剩余 OxOS 的自发荧光，只留下 UAM 自发荧光进行量化。
         注意:即使未经过光氧化的操作系统也会显示一些自发荧光，即使经过严格的清洗，一些操作系统和 OxOS 也会粘附在 RPE 表面上。因此，如上述注释所示，如果不使用视紫红质免疫染色生成减法掩模，则无法准确定量喂食OxO或标准OS培养物中的UAM自发荧光水平。
   2. 同时检测脂褐素样颗粒和其他免疫荧光标志物
      注意:如步骤2.3.1中所述，脂褐素的宽自发荧光光谱限制了荧光共染的选择。可以考虑以下方法以促进共染色。
      1. 使用远红荧光团。脂褐素的自发荧光在近红外线中很弱。因此，利用远红染料对目标抗原进行荧光检测，结合共聚焦显微镜上通道设置的仔细调整，通常可以区分自发荧光和共染色荧光。
      2. 利用脂褐素的长荧光发射尾巴。
         注意:由于脂褐素具有非常宽的荧光发射光谱，因此它通常可以在低nm波长（例如405nm激光）下激发，并且在光谱的橙色/红色部分（例如585-635nm）中仍检测到发射。这种激发和发射波长的独特组合通常可以围绕另一个共染色荧光团进行定制。
         1. 使用荧光团检测目标抗原，其峰值激发约为 488 nm，发射检测波长为 500-530 nm。为具有405 nm激发和585-635 nm发射的自发荧光检测设置单独的通道。第二个通道将仅检测UAM，而第一个通道将检测感兴趣的抗原加上脂褐素。
         2. 使用像 ImageJ 这样的免费软件程序，利用第二个仅 UAM 通道作为减法掩码，从第一个通道（包含抗原信号和 UAM 信号）中删除 UAM 信号。
      3. 利用光谱解混。大多数现代共聚焦显微镜都包含光谱解混选项。这允许仅使用UAM获取样品的光谱，而仅使用目标共染色荧光团获取另一个样品的光谱。然后可以采集包含UAM和共染色荧光团的实验样品并进行线性解混方法，以计算来自自发荧光与共染色的信号百分比。
         注意:大多数现代共聚焦显微镜都提供光谱解混的综合指南。
      4. 利用荧光寿命成像。虽然UAM和目标共染色荧光团之间的发射光谱可能相似，但它们的荧光寿命可能显着不同。通常，UAM的荧光寿命比大多数特异性荧光团短。通过访问允许终身成像的共聚焦显微镜，人们可以控制荧光信号以检测那些比典型的脂褐素寿命更长的信号。
         注意:通常，对超过2 ns的信号进行门控荧光寿命可大大减少UAM污染，尽管它不能完全消除信号。
      5. 利用自体荧光抑制器。传统上，苏丹黑已被用于在特异性免疫荧光染色之前淬灭自发荧光³⁵。几种市售的自发荧光淬灭剂产品报告改善了苏丹黑的结局，这些产品在 材料表中有详细说明。当然，自发荧光猝灭会破坏检测脂褐素的能力。
   3. 测定脂褐素样颗粒的组成
      1. 评估中性脂质
         1. 在室温下将含有UAM的RPE和对照孔（未经处理的OS）在4%PFA中固定15分钟，并用PBS 5x洗涤。
         2. 在室温下，使用10μg/ mL尼罗红或3.33μg/ mLBodipy 493 / 503在3%BSA PBS溶液中染色中性脂质1小时，然后用PBS洗涤5分钟3x。
         3. 切出并安装Transwell以及步骤2.3.1.2和2.3.1.3和图像。通常，使用以下激发和发射带宽进行成像:尼罗河红 - ex 543 nm，em 620-700 nm和Bodipy 493/503 - ex 488 nm，em 500-550 nm。
      2. 评估酯化和未酯化胆固醇
         1. 按照步骤 2.3.3.1.1 进行操作
         2. 菲律宾是一种荧光染料，可识别未酯化的胆固醇，但不能识别酯化的胆固醇³⁶。因此，为了评估UAM中总胆固醇（未酯化和酯化）的量，首先用胆固醇酯酶预处理样品，将酯化胆固醇转化为未酯化的胆固醇。在37°C下用0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.2）（参见 材料表）中的20U / mL胆固醇酯酶处理细胞3.5小时，然后用PBS洗涤5分钟3x。
         3. 在室温下用PBS中的50μg/ mL菲律宾人（见 材料表）染色1小时，并用PBS洗涤5分钟3x。将样品盖住，远离光线，因为菲律宾人很容易光漂白。
            注意:如果仅定量未酯化的胆固醇，则可以跳过步骤2.3.3.2.2中的胆固醇酯酶。如果要量化酯化胆固醇的量，可以通过样品中总胆固醇和未酯化胆固醇之间的差异来推断。
         4. 切出并安装Transwell以及步骤2.3.1.2和2.3.1.3和图像。
            注意:当菲律宾成像时，它会很快光漂白。人们需要尽量减少激发的强度和持续时间，并期望通过目镜观察样品时甚至可能发生一些光漂白。因此，在成像时，应:（1）使用菲律宾通道以外的荧光通道搜索适当的区域进行成像，（2）在宽视场而不是共聚焦显微镜上成像菲律宾（以限制光暴露的强度），以及（3）避免重复成像一个区域。通常，使用以下激发和发射带宽对菲律宾进行成像 - ex 380 nm，em 480 nm。

3. 评估脂褐素样颗粒对 RPE 吞噬作用的影响:总消耗容量

注意:通过下面的仅OS脉冲方案测量OS吞噬作用的基本原理在代表性结果部分有详细说明。该方法被称为"总消耗容量"，避免了传统OS脉冲追逐吞噬测定可能出现的吞噬效率的歧义。使用含有 4 x 10⁶ OS/mL 的 50 μL 培养基在 24 孔 Transwell 板上进行检测。

1. 计算实验所需的孔数，然后解冻适量的常规OS，在室温下以2400 x g 离心5分钟，并在标准RPE细胞培养基中重悬至4 x 10⁶ OS / mL。添加桥接配体以促进吞噬速率。
   注意:待补给细胞的培养基中桥接配体的最终浓度对于蛋白质S为4μg/ mL，对于MFG-E8为1.5μg/ mL。如步骤1.1.11中所述，对于其他RPE类型或细胞密度，可能需要改变桥接配体的浓度。
2. 取出顶端培养基并加入 50 μL 4 x 10⁶ OS/mL，理想情况下使用适当浓度的桥接配体。
3. 在加入OS后的不同时间（例如-0小时，1小时，4小时和24小时），加入16.67μL 4x Laemmli样品缓冲液和蛋白酶抑制剂以裂解细胞和覆盖的含OS的上清液。使用 P-200 移液器刮擦 Transwell 表面，注意不要刺穿 Transwell 膜或将膜从 Transwell 中分离，并将组合的细胞上清液和细胞裂解物收集在一起。涡旋，旋转，并在室温下放置30分钟以彻底变性。
   注意:尽管使用样品缓冲液裂解OS，但随后不要加热裂解液，因为这会触发视紫红质聚集。还要避免冷却裂解的OS，直到准备好储存，因为这会沉淀蛋白质。在-20°C下冷冻未使用的裂解物，确保裂解物在使用前完全解冻。
4. 使用与步骤1.3.3中相同的设置在SDS PAGE上运行裂解物，每孔上样等体积的裂解物。应使用 GAPDH、β-肌动蛋白或其他管家蛋白来规范细胞数量，因为吞噬速率取决于细胞数量。
5. 用针对视紫红质 N 端或 C 端的抗体探测蛋白质印迹。使用标准蛋白质印迹条件，抗体稀释液列在 材料表中。
   注意:在主视紫红质条带下方，将有多个视紫红质片段。这些片段代表部分消化的视紫红质，这一过程在吞噬体与溶酶体^32，33融合之前开始。与对照 RPE 相比，富含 UAM 的 RPE 中视紫红质片段数量的增加可能表明吞噬溶酶体容量的下游缺陷，在吞噬体-溶酶体融合、溶酶体酸化和/或降解酶功能水平上¹⁶，^34，35。

Results

OS光氧化的设置如图1Ai所示。聚四氟乙烯涂层载玻片允许在每个开放的矩形中加载大量溶液中的OS，而不会扩散到载玻片的其余部分。将带有OS的载玻片包含在盖子关闭的无菌培养皿中，并将紫外灯放置在载玻片上，如图1Aii所示。或者，可以将载玻片置于UV交联剂装置中，如图1Aiii所示。光氧化后，OS自发荧光显着增加，通过显微镜和流式细胞术评估（图1B）。光氧化后的蛋白质交联程度可以通过具有考马斯染色的SDS-PAGE进行评估，显示为显性蛋白质条带（单体视紫红质）转化为更高阶的聚集体和涂片（图1C）。比较手持式紫外灯（图1Aii）与紫外交联剂装置（图1Aiii）的光氧化，表明手持式紫外灯产生的OxOS自发荧光量与UV交联剂装置（图1B...

Discussion

虽然RPE脂褐素已经研究了几十年，但其毒性存在争议2，⁹，^16，42。鉴于动物模型¹¹中脂褐素的毒性含糊不清，使用人类RPE的体外模型是有价值的。已经描述了一系列体外脂褐素积累模型，但没有一个模型同时利用OS喂养和高度成熟和分化的人类RPE培养物。这种组合代表了一个理想的模型，因为OS喂养概括了脂褐素在体内积累的方法，高度成熟的人RPE培养物最好地复制体内RPE行为。有趣的是，当使用高度分化的hfRPE培养物时，发现常规OS暴露不足以诱导脂褐素样物质，即使在重复喂养后也是如此¹⁶。因此，该协议通过以受控方式光氧化OS（OxOS）来加速脂褐素积累过程。将OxOS喂入人iPSC-RPE和hfRPE培养物导致脂褐素样颗粒的强...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm 细胞培养皿	Corning	#353003	其他也可工作
24 孔 Transwells	Corning	#3470
抗 LC3 抗体	Cell Signaling Technology	#4801S	1：1000 稀释
抗视紫红质抗体 1D4	Abcam	#5417	1：1000 稀释度。表位是 C 端。
抗视紫红质抗体 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1：5000 稀释液用于 western blot，1：1000 稀释液用于免疫染色。表位是 N 端。
自发荧光淬灭剂	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin 自发荧光淬灭剂
Vector	Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
胆固醇酯酶	Life Technologies	来自 A12216 套件
共聚焦显微镜		Leica Leica Stellaris SP8 带 FALCON 模块
适应牛视网膜	W. L. Lawson Company	暗适应牛视网膜（预解剖）	联系信息： https://wllawsoncompany.com/ （402） 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
菲律宾	Sigma-Aldrich	F4767
流式细胞仪	Thermo Fisher	Attune NxT
流式细胞仪分析软件	BD	FlowJo
手持式紫外线灯	分析耶拿美国	UVGL-55
人 MFG-E8	义翘神州	10853-H08B
人纯化蛋白 S	酶研究实验室	HPS
Laemmli 样品缓冲液	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH 检测	Promega	J2380	LDH-Glo 细胞毒性检测
封固剂	Invitrogen	P36930	Prolong Gold 抗淬灭试剂
尼罗河红	Sigma-Aldrich	#72485
聚四氟乙烯涂层载玻片	Tekdon	定制	定制规格：PTFE 面罩，带有以下"切口" -  3 个玻璃矩形，每个尺寸为 17 mm x 9 mm，方向为 17 mm 侧面距载玻片顶部 4 mm，距载玻片底部 4 mm， 假设标准显微镜载玻片为 25 mm x 75 mm。每个矩形与其他矩形和载玻片边缘至少间隔 6 毫米。在载玻片上打印 PTFE 面罩，一侧有磨砂玻璃，以便对载玻片进行标记。
蛋白酶抑制剂	Cell Signaling Technology	#5872
蛋白质检测	Bio-Rad	#5000122 RC 直流蛋白质检测
TEER 电极	World Precision Instruments	STX3
跨上皮电阻 （TEER） 仪	World Precision Instruments	EVOM3
紫外线交联剂装置	Analytik Jena US	UVP CL-1000