我们介绍一种高效收集小型节肢动物可量化血淋巴的方法，用于后续分析。
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本文内容
摘要
摘要
节肢动物可通过其血淋巴传播多种具有医学和农业重要性的病毒，血淋巴在病毒传播过程中起着关键作用。血淋巴采集是研究病毒与媒介相互作用的基础技术。本文以灰飞虱（Laodelphax striatellus，简称SBPH）为研究模型，介绍一种新型且简便的小型节肢动物血淋巴定量采集方法，该昆虫是水稻条纹病毒（RSV）的主要传播媒介。本实验方案中，首先将冷冻后的节肢动物用精细镊子轻轻掐断一条腿，从伤口处挤出血淋巴；然后利用由毛细管和吸头组成的简易微量移液器，依据毛细作用原理收集从伤口渗出的血淋巴；最后，所采集的血淋巴可溶解于特定缓冲液中用于后续研究。这种小型节肢动物血淋巴采集的新方法，为虫媒病毒及媒介-病毒相互作用的深入研究提供了一种有效且实用的工具。
引言
动物病毒和植物病毒均可通过节肢动物传播，这些病毒对人类健康构成严重威胁，并在农业领域造成巨大的经济损失1,2,3。重要的是，节肢动物的血淋巴作为其循环系统以及免疫系统的重要组成部分，在调控虫媒病毒传播过程中发挥着关键作用。病毒通过节肢动物肠道被获取后，必须成功逃逸不利的血淋巴环境，才能被运输至其他组织4,5,6,7。病毒在节肢动物血淋巴中的生命周期包括在血浆液体中存活、进入血细胞以及向其他组织运输，且多种病毒与媒介之间的相互作用机制均发生在血淋巴中8,9,10,11,12。例如，灰飞虱（SBPH）对水稻条纹病毒（RSV）的垂直传播依赖于灰飞虱卵黄原蛋白与RSV衣壳蛋白之间....
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方案
1. 昆虫饲养
- 在水稻幼苗（Oryza sativa cv. Nipponbare）中饲养本实验所用的褐飞虱。将20株水稻幼苗种植于培养皿（65 mm × 200 mm）中，在25 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。
2. 收集褐飞虱血淋巴的解剖步骤
- 将SBPH放入离心管中，置于冰浴中10-30分钟。
注意：冰浴时间不得少于10分钟，否则昆虫可能复苏。 - 在体视显微镜下（参见材料表），将一只冷冻的SBPH腹部朝上放置于载玻片（参见材料表）上。调节焦距，使昆虫的六条腿清晰可见。
- 准备两把超细尖的高精度镊子（参见材料表）。用一把镊子压住昆虫身体以固定其位置，另一把镊子小心地将其中一条腿从昆虫体上拔下。
注意：对于外壳较硬的昆虫，可使用眼科手术刀切断其中一条腿。 - 用镊子轻轻按压昆虫胸部，使血淋巴从伤口处流出。
注意：血淋巴呈透明液滴状，无可见白色絮状物。若出现白色絮状物，表明存在脂肪体污染，应弃去脂质部分。
3. 使用微量移液器采....
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结果
微量移液器模型与血淋巴采集
我们开发了一种基于毛细管毛细作用原理的简易微量移液器。该微量移液器由毛细管和移液球两部分组成（图1A）。毛细管有多种容积规格可供选择，范围从1 µL到20 µL，可根据实际需求选用合适的容积。不建议使用容积更小的毛细管，因为小容积毛细管的孔径过细，可能导致难以吸取血淋巴等液体。移液球顶部有一个小孔，在采集血淋巴过程中不应将其堵塞。该移液球便于在液体采集过程中握持微量移液器（图1B），并有助于将毛细管中采集的液体转移至收集缓冲液中。
为了便于收集血淋巴，本实验中首先将褐飞虱（SBPH）置于冰上或冰箱中冷冻。将冷冻后的褐飞虱置于载玻片上，在体视显微镜下定位，然后用尖头镊子逐个拔除其中一条腿（图1C）。为确保伤口足够大并实现最佳血淋巴收集效果，最好在腿的基部将其拔除（图1Ca、
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讨论
血淋巴是节肢动物循环系统的介质，只有能够耐受恶劣的血淋巴环境，虫媒病毒才能侵入其他节肢动物组织。采集高质量的血淋巴样本是研究发生在血淋巴中的媒介-病毒相互作用的第一步。已有报道称，昆虫血淋巴可从昆虫体表多个部位获取，包括前足部位的伤口、头部区域的小切口或腹部的撕裂伤26,27,28,29。不同的采集方法可能适用于特定的实验需求。在头颈部关节处制造小切口的方法更适用于蜜蜂等大型昆虫的血淋巴采集26。然而，在SBPH头部区域制造伤口具有挑战性，可能损伤其他器官并导致其他组织污染。在腹部制造撕裂伤后，将昆虫浸入缓冲液中，随后通过离心缓冲液提取血淋巴。这是一种从小型昆虫中方便采集脂质的方法21。但由于SBPH体腔内含有大量脂肪体，身体部位的伤口可能导致脂肪体从伤口泄漏，从而污染血淋巴。该方法更适用.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由国家关键研发计划&中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1401700）和国家自然科学基金（编号：32090013 和 32072385）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE 蛋白质凝胶 | Bio-rad | 4561035 | 蛋白质分离与检测 |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | 用于细胞或组织的固定 |
| Bradford 染料试剂 | Bio-rad | 5000205 | 蛋白质浓度检测 |
| 毛细管 | Hirschmann | 9000101 | 用于收集血淋巴 |
| 细胞计数板 | ACMEC | AYA0810 | 血细胞计数 |
| 载玻片 | Gitoglas | 10127105A | 用于固定昆虫 |
| 硅烷涂层载玻片 | Sigma | S4651-72EA | 用于承载显微镜样品 |
| 含 DAPI 的抗荧光淬灭金染试剂 | Invitrogen | P36935 | 细胞核染色 |
| 显微镜盖玻片 | Gitoglas | 10212424C | 用于显微观察 |
| 移液球 | Hirschmann | 9000101 | 用于收集血淋巴 |
| Prism 8.0 软件 | GraphPad Software | / | 统计分析 |
| 体视显微镜 | Motic | SMZ-168 | 用于昆虫解剖 |
| 镊子 | Tianld | P5622 | 用于昆虫解剖 |
| 蔡司倒置显微镜 | Zeiss | Observer Z1 | 血细胞观察 |
参考文献
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....
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重印与许可
