一种用于采集小型节肢动物血淋巴的精确且可量化的技术

摘要

我们介绍一种高效收集小型节肢动物可量化血淋巴的方法，用于后续分析。

摘要

节肢动物可通过其血淋巴传播多种具有医学和农业重要性的病毒，血淋巴在病毒传播过程中起着关键作用。血淋巴采集是研究病毒与媒介相互作用的基础技术。本文以灰飞虱（Laodelphax striatellus，简称SBPH）为研究模型，介绍一种新型且简便的小型节肢动物血淋巴定量采集方法，该昆虫是水稻条纹病毒（RSV）的主要传播媒介。本实验方案中，首先将冷冻后的节肢动物用精细镊子轻轻掐断一条腿，从伤口处挤出血淋巴；然后利用由毛细管和吸头组成的简易微量移液器，依据毛细作用原理收集从伤口渗出的血淋巴；最后，所采集的血淋巴可溶解于特定缓冲液中用于后续研究。这种小型节肢动物血淋巴采集的新方法，为虫媒病毒及媒介-病毒相互作用的深入研究提供了一种有效且实用的工具。

引言

动物病毒和植物病毒均可通过节肢动物传播，这些病毒对人类健康构成严重威胁，并在农业领域造成巨大的经济损失^1,2,3。重要的是，节肢动物的血淋巴作为其循环系统以及免疫系统的重要组成部分，在调控虫媒病毒传播过程中发挥着关键作用。病毒通过节肢动物肠道被获取后，必须成功逃逸不利的血淋巴环境，才能被运输至其他组织^4,5,6,7。病毒在节肢动物血淋巴中的生命周期包括在血浆液体中存活、进入血细胞以及向其他组织运输，且多种病毒与媒介之间的相互作用机制均发生在血淋巴中^8,9,10,11,12。例如，灰飞虱（SBPH）对水稻条纹病毒（RSV）的垂直传播依赖于灰飞虱卵黄原蛋白与RSV衣壳蛋白之间的分子相互作用^13,14。一些病毒可通过结合特定的媒介因子来逃避免疫系统对血淋巴的免疫应答^15,16,17,18。因此，研究节肢动物血淋巴中媒介与病毒之间的相互作用，对于深入理解虫媒病毒的传播机制具有重要意义。

由于体型微小，一些小型昆虫（如飞虱、叶蝉和某些蚊子）的血淋巴难以采集。为解决这一问题，已开发出多种血淋巴采集方法，包括将注射器针头直接插入昆虫体内以提取微量血淋巴、用尖头镊子收集伤口处渗出液以及直接离心法。这些方法使得研究人员能够测定血淋巴中的相对基因表达水平和病毒滴度^19,20,21。然而，目前尚无有效方法可用于定量这些小型昆虫的血淋巴体积，而血淋巴体积的精确测定对于血细胞计数、蛋白质定量和酶活性分析至关重要。

SBPH（小褐飞虱）是一种小型昆虫媒介，体长约2-4 mm。SBPH能够传播多种植物病毒，包括水稻条纹病毒（RSV）、玉米粗缩病毒和水稻黑条矮缩病毒^22,23,24。过去十年中，SBPH与RSV之间的相互作用已被深入研究。为了便于开展SBPH相关实验，我们开发了一种新颖且简便的血淋巴采集方法。该方法基于毛细作用原理，利用带有刻度标记的毛细管，以精确且可量化的方式获取昆虫血淋巴。此技术使我们能够高效地从小型昆虫中采集特定体积的血淋巴，从而更详细地研究小型媒介昆虫血淋巴环境。

方案

1. 昆虫饲养

1. 在水稻幼苗（Oryza sativa cv. Nipponbare）中饲养本实验所用的褐飞虱。将20株水稻幼苗种植于培养皿（65 mm × 200 mm）中，在25 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。

2. 收集褐飞虱血淋巴的解剖步骤

1. 将SBPH放入离心管中，置于冰浴中10-30分钟。
   注意：冰浴时间不得少于10分钟，否则昆虫可能复苏。
2. 在体视显微镜下（参见材料表），将一只冷冻的SBPH腹部朝上放置于载玻片（参见材料表）上。调节焦距，使昆虫的六条腿清晰可见。
3. 准备两把超细尖的高精度镊子（参见材料表）。用一把镊子压住昆虫身体以固定其位置，另一把镊子小心地将其中一条腿从昆虫体上拔下。
   注意：对于外壳较硬的昆虫，可使用眼科手术刀切断其中一条腿。
4. 用镊子轻轻按压昆虫胸部，使血淋巴从伤口处流出。
   ​注意：血淋巴呈透明液滴状，无可见白色絮状物。若出现白色絮状物，表明存在脂肪体污染，应弃去脂质部分。

3. 使用微量移液器采集血淋巴

1. 准备一支微量移液器。将一支体积为 1 µL 的毛细管（参见材料表）插入移液球（参见材料表）中。为确保测量准确，应保证刻度线清晰可见。
   注意：移液球顶部需有一个小孔。
2. 采集血淋巴时，用手握住微量移液器的移液球，将毛细管靠近昆虫伤口处。只需将毛细管尖端接触从伤口渗出的血淋巴，即可完成采集。
3. 当毛细管内的液体达到所需刻度线时，用手指轻轻堵住移液球顶部的小孔，以停止吸取过程。
   注意：应连续且迅速地采集 1 µL 血淋巴样品，以避免脂质污染和毛细管堵塞。
4. 挤压移液球，将采集的血淋巴排入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液，含 137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、4.3 mmol/L Na₂HPO₄、1.4 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.2–7.4）中。
   ​注意：将毛细管插入 PBS 缓冲液中。
5. 采集另一份 1 µL 血淋巴样品时，需更换新的毛细管。

4. 考马斯亮蓝染色

1. 根据步骤3中所述方案，从三龄幼虫中采集3份等体积（1 µL）的血淋巴样品，并将收集的血淋巴排入PBS缓冲液中，使总体积达到100 µL。
2. 向100 µL稀释后的血淋巴样品中加入25 µL的5倍蛋白上样缓冲液（250 mmol/L Tris-HCl [pH 6.8]，10% W/V SDS，0.05% W/V 溴酚蓝，50% W/V 甘油，5% W/V β-巯基乙醇），加热以使蛋白质变性。
3. 取20 µL煮沸后的样品加入10% SDS-PAGE蛋白凝胶（见材料表），进行蛋白质分离。
4. 将凝胶置于考马斯亮蓝溶液中（将1 g考马斯亮蓝R-250与250 mL异丙醇、100 mL冰醋酸和650 mL ddH₂O混合，用滤纸过滤除去颗粒）室温染色1小时，然后用脱色液（100 mL乙酸、400 mL甲醇、500 mL ddH₂O）脱色1小时。

5. 蛋白质浓度测定

1. 用 PBS 缓冲液通过两倍稀释法将 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）稀释为 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 和 0.3125 mg/mL。
2. 吸取 5 µL PBS 缓冲液及第 5.1 步中各浓度的 BSA 溶液，分别加入 1 mL 1x Bradford 染料试剂（参见材料表），在室温下孵育 5 分钟。以 PBS 缓冲液加入 Bradford 染料试剂作为空白对照，在 OD = 595 nm 处调零。测定其余各蛋白浓度的吸光度值，并绘制标准曲线。
3. 取 1 µL 幼虫、雌性或雄性褐飞虱（SBPH）的血淋巴加入 100 µL PBS 缓冲液中，然后在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟，以去除血细胞。
4. 将 90 µL 上清液转移至新的离心管中，按照第 5.2 步的操作说明测定上清液的吸光度值。
5. 根据标准曲线的回归方程计算血淋巴样品的蛋白浓度。实验中包含三个生物学重复，每个生物学重复设三个技术重复。

6. 显微检测

1. 使用微量移液器从不同发育阶段的10-15只褐飞虱（SBPH）中采集血淋巴。将收集的血淋巴加入含有20 µL 4%多聚甲醛溶液的离心管中（参见材料表）。在室温下孵育30分钟，以固定血淋巴。
2. 将20 µL固定后的血细胞滴加至经硅烷处理的载玻片中央（参见材料表）。
3. 将液滴置于载玻片干燥架上干燥。
   注意：避免过度干燥。
4. 用金抗荧光淬灭试剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）覆盖样本（参见材料表），并在倒置显微镜下观察载玻片（参见材料表）。

7. 细胞定量

1. 用微量移液器收集1 µL的褐飞虱血淋巴，并将其溶解于20 µL的PBS缓冲液中。
2. 用PBS缓冲液将血淋巴样本稀释五倍。
3. 将20 µL血淋巴溶液加入细胞计数板中央（参见材料表），并用盖玻片覆盖液滴（参见材料表）。
4. 在倒置显微镜下（参见材料表）对细胞计数板上的五个方格进行细胞计数（参见补充图1）。每次实验包含三个生物学重复，每个生物学重复设三个技术重复。
   ​细胞/µL = 五个中央方格的总细胞数 × 5 × 稀释倍数 × 10⁴

8. 统计分析

1. 使用相应的软件进行统计分析（参见材料表）。创建一个新文件，选择数据列，导入数据，并生成带有柱状图的散点图。
2. 通过使用列统计方法计算每组数据的平均值和标准差（SD），并使用单因素方差分析（one-way ANOVA）工具评估各组间差异的显著性。根据三次独立实验中的三个生物学重复，确定平均值和标准差（SD）。

结果

微量移液器模型与血淋巴采集
我们开发了一种简单的微量移液器，其工作原理基于毛细管的毛细作用力。该微量移液器由毛细管和移液球两部分组成（图1A）。毛细管有多种体积规格，范围从1 µL到20 µL不等，可根据实际需求选择合适的体积。不建议使用体积过小的毛细管，因为小体积毛细管的孔径极细，可能导致难以吸取血淋巴等液体。移液球顶部有一个小孔，在采集血淋巴时不应将其堵塞。该移液球在液体采集过程中便于手持微量移液器（图1B），同时也有助于将毛细管中采集到的液体转移至收集缓冲液中。

为了便于收集血淋巴，本研究中首先将褐飞虱（SBPH）置于冰上或冰箱中冷冻。将冷冻后的褐飞虱置于体视显微镜下的载玻片上，用精细镊子逐个拔除其中一条腿（图1C）。为确保形成较大的伤口并实现最佳的血淋巴收集效果，最好从腿部基部拔除（图1Ca，

讨论

血淋巴是节肢动物循环系统的介质，只有能够耐受恶劣的血淋巴环境，虫媒病毒才能侵入其他节肢动物组织。采集高质量的血淋巴样本是研究发生在血淋巴中的媒介-病毒相互作用的第一步。已有报道称，昆虫血淋巴可从昆虫体表多个部位获取，包括前足部位的伤口、头部区域的小切口或腹部的撕裂伤^26,27,28,29。不同的采集方法可能适用于特定的实验需求。在头颈部关节处制造小切口的方法更适用于蜜蜂等大型昆虫的血淋巴采集²⁶。然而，在SBPH头部区域制造伤口具有挑战性，可能损伤其他器官并导致其他组织污染。在腹部制造撕裂伤后，将昆虫浸入缓冲液中，随后通过离心缓冲液提取血淋巴。这是一种从小型昆虫中方便采集脂质的方法²¹。但由于SBPH体腔内含有大量脂肪体，身体部位的伤口可能导致脂肪体从伤口泄漏，从而污染血淋巴。该方法更适用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% SDS-PAGE 蛋白质凝胶	Bio-rad	4561035	蛋白质分离与检测
4% 多聚甲醛	Solarbio	P1110	用于细胞或组织的固定
Bradford 染料试剂	Bio-rad	5000205	蛋白质浓度检测
毛细管	Hirschmann	9000101	用于收集血淋巴
细胞计数板	ACMEC	AYA0810	血细胞计数
载玻片	Gitoglas	10127105A	用于固定昆虫
硅烷涂层载玻片	Sigma	S4651-72EA	用于承载显微镜样品
含 DAPI 的抗荧光淬灭金染试剂	Invitrogen	P36935	细胞核染色
显微镜盖玻片	Gitoglas	10212424C	用于显微观察
移液球	Hirschmann	9000101	用于收集血淋巴
Prism 8.0 软件	GraphPad Software	/	统计分析
体视显微镜	Motic	SMZ-168	用于昆虫解剖
镊子	Tianld	P5622	用于昆虫解剖
蔡司倒置显微镜	Zeiss	Observer Z1	血细胞观察