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一种最小侵入性的新型细胞注射方法

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DOI：

10.3791/65260

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2023年4月21日

1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

本文内容

摘要

该方法可消除细胞悬浮液注射过程中引起的任何重大侵入性影响。

摘要

直接将细胞注射到组织中是细胞给药和/或替代治疗中的必要步骤。细胞注射需要足量的悬浮液以使细胞进入组织，但悬浮液体积可能对组织造成影响，进而导致注射过程中产生显著的侵入性损伤。本文报道了一种名为慢速注射的新型细胞注射方法，旨在避免此类损伤。然而，根据牛顿剪切力定律，要将细胞从针尖推出，需要足够高的注射速度。为解决上述矛盾，本研究采用非牛顿流体（如明胶溶液）作为细胞悬浮液。明胶溶液具有温度敏感性，在约20 °C时其形态可由凝胶态（gel）转变为溶胶态（sol）。因此，在本实验方案中，注射器保持低温以维持细胞悬浮液的凝胶状态；而一旦溶液被注入体内，体温会使其转化为溶胶态。间质组织液流动可吸收多余的溶液。本研究中，慢速注射技术使心肌细胞球成功进入宿主心肌并实现移植，且未引发周围纤维化。该研究采用慢速注射法，将纯化并呈球状结构的新生大鼠心肌细胞注入成年大鼠心脏心肌梗死的远端区域。移植后2个月，移植组心脏的收缩功能显著改善。此外，对慢速注射心脏的组织学分析显示，宿主与移植物心肌细胞之间形成了无缝连接。 通过 含有缝隙连接的闰盘。该方法可能有助于下一代细胞治疗，特别是在心脏再生医学领域。

引言

细胞移植与替代疗法是针对严重受损器官的颇具前景的新型治疗策略。在这些新型治疗策略中，心脏再生医学已受到广泛关注。然而，损伤引发的炎症反应会在多个器官中介导瘢痕形成1,2,3,4. 人类心脏大约由1010 心肌细胞；因此，理论上5,6，必须使用超过109 心肌细胞。给予大量心肌细胞 通过 传统注射方法可能导致显著的组织损伤7该方法提供了一种新型的细胞注射技术，具有最小的组织侵入性。

将细胞注入器官实质需要进行注射操作。然而，存在一个矛盾之处：注射操作本身可能导致组织损伤。组织损伤可引起局部炎症反应，并在器官和组织中形成不可逆的瘢痕，同时损害其再生能力8,9,10。哺乳动物心脏极易形成瘢痕而非再生，这是因为心脏需立即修复损伤，以维持其持续泵血功能所产生的高血压状态11。消融治疗正是利用了这种强烈的瘢痕形成倾向，通过心律失常机制阻断可能形成瘢痕的电传导通路12。在先前的研究中观察到，瘢痕组织将注射的心肌细胞与宿主心肌组织隔离。因此，这成为心脏再生医学领域亟待解决的下一个关键问题，以提升治疗效果。

组织间质液流动在向细胞输送氧气和营养物质以及清除细胞代谢废物方面起着至关重要的作用。不同组织/器官中生理状态下的间质液流速各不相同（范围为 0.01–10 µm/s）13。据作者所知，目前尚无关于各组织/器官在不引发病理性水肿的情况下可耐受额外液体量的数据；然而，本实验尝试采用缓慢注射速度以尽可能减少组织损伤，实验结果可用于评估该设想的可行性。

方案

动物实验根据关西医科大学动物实验伦理指南进行，并经伦理委员会批准（批准号：23-104）。所有动物均在特定病原体阴性环境中，按照固定的明暗循环条件饲养。所有灭菌手术器械（如剪刀、镊子和牵开器）均经过高压灭菌并彻底干燥。

1. 新生大鼠心肌细胞球的制备

  1. 新生大鼠心脏采集
    1. 心脏采集操作参照先前报道中描述的类似方法7。
    2. 将新生（出生后0-2天）Sprague-Dawley（SD）大鼠依次浸入聚维酮碘和70%乙醇溶液中消毒，随后转移至充满异氟烷蒸气（浓度应高于10% v/v）的密闭容器中，以实现深度麻醉。
    3. 确认大鼠因失去运动活动而进入无意识状态后，用手从背部固定其身体并进行断头操作，然后使用锋利的剪刀从胸骨前部中心向尾侧剪开2-4 mm组织，再沿头侧方向剪开。
    4. 抓住背部皮肤将切口拉开，将心脏从胸腔中推出。用剪刀剪下心室，并将其浸入不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS(−)）中。
  2. 新生大鼠心肌细胞的分散
    1. 在已灭菌的凹形玻璃器皿中，将收集到的心室组织置于少量Ads缓冲液（Ads缓冲液：116 mM NaCl，20 mM HEPES，12.5 mM NaH2PO4，5.6 mM葡萄糖，5.4 mM KCl，0.8 mM MgSO4，pH 7.35）中，用弯头剪刀将其剪成约1 mm × 1 mm的小块。
    2. 将剪碎的组织和微型磁力搅拌子转移至50 mL离心管中，在37 °C条件下，加入含0.1%胶原酶、0.1%胰蛋白酶、20 µg/mL DNase I和50 nM四甲基罗丹明甲酯的Ads缓冲液，搅拌30分钟，以将组织分散为单细胞。
    3. 通过自然沉降分离细胞团块与分散的单细胞，仅收集分散的细胞至新管中，并用相同的消化液再次消化残留的细胞团块。
    4. 重复此过程直至所有细胞完全解离。为确认细胞是否完全分散，可在显微镜下（使用4倍物镜）观察各管中的细胞状态。
    5. 以150 ×g离心5分钟收集分散的细胞，并将其重悬于1-2 mL Ads缓冲液中。
  3. 心肌细胞的荧光激活细胞分选
    1. 使用荧光激活细胞分选（FACS）技术，采用556-601 nm带通滤光片检测红色荧光信号，对细胞进行分析。
    2. 仔细进行预设门控以排除双联体细胞群14。双联体排除的门控设置应遵循制造商的操作说明。
    3. 将前向散射信号设为x轴，红色荧光信号设为y轴。可观察到三个细胞群体：最下方的群体包含红细胞和死亡细胞，中间群体包含非心肌细胞（如成纤维细胞和内皮细胞），最上方的群体为纯化的心室心肌细胞7。
  4. 红色荧光标记心肌细胞球的制备
    1. 选择性分选出心肌细胞，以150 × g离心5分钟。将细胞沉淀完全溶解于1 mL含10%热灭活胎牛血清（FBS）的α-最低必需培养基（alpha-MEM）中。
    2. 使用血细胞计数板测定细胞浓度，并用含10% FBS的alpha-MEM将细胞悬液稀释至3,000个细胞/mL。
    3. 将细胞悬液分配至非黏附性96孔板中（每孔100 µL），以100 × g离心5分钟，随后在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养2-3天。
    4. 在注射实验前，使用1,000 µL移液器吸取每孔中的培养基，将心肌细胞球吸出并收集至15 mL离心管中。
    5. 按照制造商说明书使用PKH26染色，以便移植后追踪细胞。

2. 缓慢注射法的准备工作

  1. 明胶储备液的制备
    1. 称取明胶，溶于Ads缓冲液中，配制成10%（w/v）的溶液，并进行高压灭菌。
  2. 细胞注射装置的制备
    1. 整体装置设计：准备如图1所示的装置。该系统由注射器冷却装置和主注射装置组合而成。
    2. 准备如下所述的主注射装置：
      1. 进行新生心肌细胞球注射时，使用带有注射器的29 G、50 mm长针头。
      2. 将动力传递注射器（18G，1 mL）与细胞注射器背对背连接（图1）。将动力传递注射器的针头通过低管腔扩张性的细聚丙烯管连接。
      3. 然后，将动力传递管的另一端连接至相同注射器（18G，1 mL）的针头，并将其安装在注射泵上。将两个动力传递注射器及管道中充满水，确保无气泡。
        注意：当推动一个动力传递注射器的活塞时，压力会直接传递至另一个注射器，使该活塞向外伸出。
    3. 按以下步骤设置注射器冷却系统：
      1. 将铜管（外径 = 1 mm；内径 = 0.3 mm；壁厚 = 0.35 mm）紧密缠绕在细胞注射器的含细胞部分，两端各预留10 mm的多余管长。
      2. 将铜管连接至柔性塑料管，再将塑料管的另一端连接至外部泵，管道内充满冷却水，并将多余的铜管浸入碎冰中以实现降温（图1）。
        注意：该冷却系统可使注射器筒内的细胞悬液温度维持在约2 °C。

3. 通过钝缘支冠状动脉闭塞建立大鼠心肌梗死模型

  1. 使用含3%异氟烷的空气麻醉雄性免疫缺陷型裸鼠（F344/Njcl-rnu/rnu）。将套管插入气管并连接至呼吸机。
  2. 将套管连接至带有控制器的异氟烷蒸发器，以维持3%异氟烷浓度，从而保持充分麻醉状态。确认动物对疼痛刺激无反应。在眼部涂抹兽用眼膏以防止干燥。
  3. 用剪断的手术胶带固定四肢于40 °C预热的手术板上。将大鼠身体沿身体纵轴向右侧翻转，以左侧腋窝作为手术区域。
  4. 使用脱毛膏去除手术区域的毛发，并用聚维酮碘擦拭皮肤。使用锐利剪刀在皮肤和胸大肌上做1.5 cm切口。
  5. 确认第三肋间隙，使用钝头显微镊撕开肋间肌和肋胸膜。使用牵开器保持胸腔开放。用镊子轻轻去除薄层心包膜。
  6. 为构建心脏侧壁梗死模型，找到左心耳尖端尾侧1 mm处以识别钝缘冠状动脉，穿过一根7-0丝线，从背侧向腹侧钩取一块2.5 mm宽、2.5 mm深的组织，并紧密结扎该组织。
  7. 通过结扎远端心肌收缩减弱确认结扎成功。轻柔移除牵开器后，在第二与第四肋间隙之间放置一根5-0丝线，关闭开胸切口。
  8. 将异氟烷浓度降至1%。用5-0丝线轻柔缝合肌肉和皮肤。将异氟烷浓度降至0%，等待约5分钟直至自主呼吸恢复。
  9. 在切口处局部应用生理盐水中含2 mg/mL利多卡因。via皮下注射给予1 mL生理盐水。局部涂抹兽用眼膏以预防感染。
  10. 将大鼠从气管插管中取出并放回动物笼中；随后将大鼠单独饲养1周。
  11. 采用超声心动图分析心脏收缩泵功能的变化。
    ​注：由于侧壁心肌梗死，心脏功能将下降。

4. 采用慢速注射法的超声引导经皮细胞移植

  1. 将10%明胶储备液在37 °C预热至完全液化。
  2. 用预热的Ads缓冲液稀释10%明胶储备液，得到最终可注射的5% w/v明胶溶液（每只动物需100 µL）。
  3. 将96个心肌细胞球（总计：每只动物28,800个心肌细胞）悬浮于100 µL预热的注射溶液中。
  4. 将步骤4.3中制备的悬浮液装入细胞注射器中，避免吸入过多空气。
  5. 为消除注射器中的气泡，将注射器垂直持握，针头朝上，轻弹注射器，使气泡聚集至注射器顶部边缘。
    注意：此步骤中，观察心肌细胞球逐渐沉降至推杆的橡胶密封处。
  6. 保持注射器垂直，缓慢向上推动推杆，弃去气泡和多余的细胞悬液，直至注射器内剩余20 µL细胞悬液。以恒定速度小心推动推杆，使心肌细胞球始终停留在推杆的橡胶密封处。
  7. 将带帽的注射器直接浸入冰浴中5分钟。
  8. 将冷却后的注射器放入注射装置中。使用可调节X-Y-Z位置的自制夹具，将安装在精细移动装置上的注射器装置牢固固定在动物载物台上。该精细移动装置可通过X方向20 mm滑动、Y方向摆动和Z方向弯曲运动来调节针头位置。
  9. 在充满含3%异氟烷空气的密闭箱中麻醉大鼠。通过无痛觉反应确认麻醉效果，并在眼部涂抹兽用眼膏以防止干燥。
  10. 用剪裁的手术胶带固定四肢于预热至40 °C的超声板上。为维持足够麻醉深度，确保吸入空气中异氟烷浓度约为3%。
  11. 使用脱毛膏去除注射区域（直径2 cm）及胸部的毛发，并用聚维酮碘擦拭皮肤。
  12. 在胸部和超声探头上涂抹超声耦合胶。将超声探头沿头尾轴贴近胸部，按照仪器制造商手册开始获取B型超声心动图图像。
  13. 从前侧视角将注射针尖插入心肌（图2 和 补充视频1）。
  14. 按下启动 按钮以激活主注射泵，并旋转旋钮调节至预定数值，使注射速度约为0.02 µL/s。在穿刺部位局部涂抹兽用眼膏以预防感染。
    注意：需使用注射溶液预先确定对应目标注射速度的合适旋钮数值。注射完成后，使用示例性运动系统撤出注射针。
  15. 将异氟烷浓度降至0%，等待约5分钟，直至动物恢复足够意识以维持胸卧位。

5. 心脏功能评估

  1. 将大鼠置于充满含3%异氟烷空气的密闭箱中进行麻醉。通过无痛觉反应确认麻醉效果。在眼部涂抹兽医专用眼膏以防止角膜干燥。
  2. 在四肢末端涂抹导电膏以获取心电图信号。使用剪裁的手术胶带将四肢固定在预热至40 °C的超声探查板上。利用生理监测系统实时检测心电图和心率。
  3. 根据仪器制造商的说明，首先使用B模式超声图像确定长轴角度，该图像应显示左心室心尖至流出道的结构，然后将超声探头旋转90°以切换至短轴切面。
  4. 仅使用动物载物台的尾侧至头侧微调移动系统，调整短轴切面至乳头肌水平。随后按下M-mode按钮切换至M型成像模式，并按下Cine-loop按钮记录5秒的动态视频。
  5. 使用软件分析并计算缩短分数时，按下Measure 按钮，使用垂直线工具标定收缩末期和舒张末期的左心室内径。软件将自动计算缩短分数百分比（FS）。
  6. 将异氟烷浓度降至0%，等待约5分钟，直至动物恢复足够的意识以维持胸卧位姿势。

6. 免疫组织化学

  1. 使用剪好的手术胶带将已处死的动物尸体（处死方法同步骤 1.1.3）固定于操作台上，取出心脏，用 PBS 清洗，并将心脏浸入 4% 多聚甲醛/PBS 溶液中固定。
  2. 将心脏解剖为三个部分，浸入 40% 蔗糖溶液中进行冷冻保护，随后包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在 −80 °C 下冷冻保存。
  3. 将冷冻切片组织（厚度为 8 µm）贴附至氨基硅烷涂层的玻璃载片上。使用普通吹风机产生的非加热气流充分干燥后，将载片浸入含 0.2% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）中。
  4. 在封闭液中于 25 °C 封闭 30 分钟。向载片上加入 100 µL 含一抗的封闭液，加盖石蜡膜密封以确保抗体溶液均匀覆盖组织，于 4 °C 孵育过夜。
    注：抗体浓度见材料表。
  5. 将载片水平放置于自制的高湿度盒中，利用湿滤纸产生的自然水蒸气防止蒸发。用 TBS-T 洗涤载片三次。
  6. 按与一抗相同的方式，在 25 °C 下用含二抗的封闭液孵育 1 小时。经三次洗涤后，使用荧光显微镜和共聚焦激光显微镜观察荧光信号。
    注：抗体浓度见材料表。
  7. 统计分析：对于细胞体积的比较（如图 3A所示），采用非配对t检验；为评估通过缓慢注射法给予心肌细胞后心脏功能的恢复情况（如图 4A所示），采用配对t检验。本研究中，当P < .01 时认为差异具有统计学意义。误差线表示标准差。

结果

缓慢注射对细胞存活和胶原沉积的影响
将用PKH26标记的新生大鼠心肌细胞球通过常规注射或缓慢注射方法注入正常裸鼠心肌中。结果显示，缓慢注射方法显著增加了移植细胞的体积（图3A），并显著减少了局部I型胶原的沉积（图3B）。

缓慢注射对大鼠梗死模型治疗效果的影响
采用超声心动图引导下的缓慢注射法，将新生大鼠心肌细胞球或PBS(−)注入模型大鼠的梗死心脏。仅细胞注射组在术后2个月表现出心脏收缩功能的显著改善图4A免疫组织化学分析显示，移植细胞与宿主心肌细胞之间存在无缝连接 通过 含有间隙连接的闰盘（图4B).

主要注射装置和冷却系统示意图；带泵的注射器，聚丙烯管路装置。
图1：整个注射系统的示意图。 （A）主要注射装置。 （B）注射器冷却系统。 请点击此处查看此图的放大版本。

体内光学成像实验装置；显示分析的超声图像。
图2：超声心动图引导下的经皮缓慢注射。 （A）动物体位、超声探头和注射装置的设置。（B）注射针筒与心脏的超声心动图图像。请注意，左图和右图内容相同，但右图添加了一条黄线以指示针头位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞体积柱状图和显微镜图像；正常注射与慢速注射下的胶原蛋白和DAPI染色。
图3：慢速注射法对移植细胞体积及胶原沉积的影响。 （A）移植细胞体积（N = 3）由连续切片计算得出。误差线表示标准差。*P < 0.01，非配对t检验。 （B）I型胶原免疫组织化学染色。比例尺为200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

缩短分数图和激光显微镜图像；分析心脏功能、细胞标志物。
图 4：通过缓慢注射法移植心肌细胞球后心脏功能及组织学整合的改善。（A）代表性超声心动图M型图像。图表显示了心肌细胞球移植组（实心红线；N = 4）和对照组（用于缓慢注射法的细胞悬液溶液，虚线蓝线；N = 3）中缩短分数的变化趋势。缩写：MI = 心肌梗死；Cx43 = 连接蛋白43；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PKH26 = 红色荧光细胞膜标记物。误差线表示标准差。*P < 0.01（配对t检验）。（B）移植的心肌细胞球与宿主心肌细胞之间关系的免疫组织化学分析。左列为使用2倍物镜进行的传统激光显微镜观察结果。方框中标记为*和#的两个区域的放大图像（使用20倍物镜）如下所示。比例尺：顶部图像 = 300 µm；* 和 # = 30 µm。同时展示了使用20倍物镜的共聚焦激光显微镜图像以作比较，共显示三个位置。在合并图像中，箭头指示位于移植物与宿主心肌细胞之间直接连接处的缝隙连接（Cx43）。比例尺为30 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：超声引导下缓慢注射方法。 前面观的 B 型超声心动图显示注射针尖已进入心肌。 请点击此处下载该文件。

讨论

成功实施慢速注射方法的关键之一是使用高性能的注射泵和耐高压的传压管路，构建高效的注射系统。由于需要将凝胶从细针尖端推出，因此必须采用高压系统。第二个关键点是心脏的稳定。跳动的心脏会使插入心肌的注射针造成组织损伤。本研究采用超声引导注射，以避免动物经历第二次开胸损伤，并在肺部充气状态下实现对稳定心脏的细胞注射。此外，在应用于较大动物或人类时，应将附着于心脏的某些注射装置纳入应用策略的设计中。对于小型动物的开胸心脏注射，建议使用长而柔韧的针头，以适应其较高的心率。

本研究中，与常规注射方法相比，缓慢注射法显著增加了存活心肌细胞的体积。常规注射会导致细胞损伤 通过 剪切应力15相比之下，缓慢注射法理论上不会引起此类应激，因为它除了采用缓慢注射外，还使用了非牛顿流体溶液。

就局部纤维化而言，常规注射法存活的心肌细胞周围间质区域显示出强而广泛的Ⅰ型胶原沉积。相比之下，采用慢速注射法移植的心肌细胞周围Ⅰ型胶原信号则明显更弱且范围更局限。这表明慢速注射法造成的损伤显著减轻。将新生心肌细胞以慢速注射方式注入成年心肌组织，可显著改善梗死心脏的收缩功能。组织学分析表明，采用慢速注射法移植的心肌细胞与宿主心肌细胞之间形成了直接连接和功能性耦合。这一现象解释了宿主心肌功能恢复的机制。据我们所知，这是首次报道新生心肌细胞与成年宿主心肌细胞之间形成大规模无缝连接的移植研究。移植细胞与宿主心肌组织之间的功能性连接 通过 电耦合与机械耦合可能促进移植的心肌细胞成熟，使其发挥功能性心肌细胞的作用，从而贡献于宿主心脏功能。宿主心肌细胞与移植物心肌细胞之间长期的物理力相互作用对于细胞完全成熟至关重要。因此，注射后可能需要约两个月时间才能实现梗死心脏的功能恢复。在治疗应用中，患者心脏功能随时间逐步恢复可能是预期现象，这也可作为移植细胞成功整合并建立功能连接的重要标志。 从头合成 宿主心肌细胞与移植心肌细胞之间的功能耦合与整合

缓慢注射法可在开胸手术期间实施。此外，该方法也可应用于小鼠。对于未来在人类治疗中的应用，我们仍需解决若干问题。应根据人体各靶器官间质液流动的缓冲能力，优化注射速度。应采用无异种成分的材料，如人源明胶或可生物降解的合成材料。应开发符合临床GMP标准的缓慢注射装置，例如紧凑型器官特异性一次性工具，或可重复使用的适用于多种器官的装置。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本学术振兴会（JSPS）科研费（课题编号：23390072 和 19K07335）以及日本医疗研究开发机构（AMED）（课题编号：A-149）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18号针头 && 结核菌素，1 mLTerumo NN1838R，SS-01T
29号针头，长度50 mmIto Corporation，东京，日本14903 型-A 
一根铜管通用供应商外径，1 mm；内径，0.3 mm；厚度，0.35 mm
吸附缓冲液所有成分均购自日本宫崎市富士胶片和光纯药株式会社手工配制，成分：116 mM NaCl，20 mM HEPES，12.5 mM NaH2PO4，5.6 mM 葡萄糖，5.4 mM KCl，0.8 mM MgSO4，pH 7.35
α-MEM日本宫崎市富士胶片和光纯药株式会社051-07615
抗I型胶原兔多克隆抗体（H+L）Proteintech14695-1-AP使用1:100稀释
抗连接蛋白-43兔多克隆抗体（H+L）Sigma AldrichC6219使用1:100稀释
抗兔IgG（H+L）多克隆抗体-AlexaFluor 488 赛默飞世尔科技A21206使用1:300的稀释比例
封闭液（Blocking One）Nacalai Tesque，京都，日本03953-95 
胶原酶日本宫崎市富士胶片和光纯药株式会社034-22363
共聚焦激光显微镜卡尔·蔡司公司，德国奥伯科亨LSM510 META
DNase ISigma-AldrichDN25
FACS Aria IIIBecton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖
胎牛血清美国佛罗里达州 BioWest 公司S1820-500
精细运动装置（显微操作器）日本东京Narishige有限公司M-44
荧光显微镜 尼康仪器公司，日本东京Eclipse Ti2
牛皮明胶Sigma-AldrichG9382用PBS（-）溶解至10%，并进行高压灭菌
新生Sprague-Dawley（SD）大鼠日本静冈日本SLC公司0–出生后2天
非黏附性96孔板（球状体培养板）住友化学，东京，日本MS-0096S
最佳切割温度（OCT）包埋剂 Sakura Finetek USA, Inc.，加利福尼亚州，美国Tissue-Tek OCT 包埋剂
蠕动泵（用于冷却系统）As One 公司，日本大阪SMP-23AS
PKH26Sigma-AldrichPKH26GL
磁力搅拌子，微型，聚四氟乙烯涂层，长度 × 直径（毫米）：5 × 2Chemglass生命科学有限责任公司，新泽西州，美国CG-2003-120
注射器 日本东京市伊藤株式会社MS-N25
带遥控器的注射泵As One 公司，日本大阪MR-1, CT-10
四甲基罗丹明甲酯赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆T668
胰蛋白酶DIFCO，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，美国215240
Tween-20日本宫崎市富士胶片和光纯药株式会社167-11515
兽医软膏 藤田制药株式会社Hibikusu 软膏  #WAK-95832
Vevo 2100 成像系统Fujifilm VisualSonics, Inc.，加拿大安大略省多伦多市Vevo 2100
Vevo 2100 成像系统软件版本 1.0.0Fujifilm VisualSonics, Inc.，加拿大多伦多Vevo 2100
弧度较弱的眼科缝合针，带眼科缝线日本东京市，NATSUME 制作所有限公司C7-70

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