小鼠假体周围Candida albicans感染模型

摘要

由危险病原体引起的假体周围关节感染（PJI）在临床骨科中较为常见。现有的动物模型无法准确模拟PJI的实际状况。本文中，我们建立了一种与白色念珠菌（Candida albicans）生物膜相关的PJI小鼠模型，用于研究和开发针对PJI的新疗法。

摘要

假体周围关节感染（PJI）是Candida albicans（C. albicans）引起的一种常见感染，日益引起外科医生和科学家的关注。通常，C. albicans会在感染部位形成生物膜，从而使其免受抗生素和免疫清除的影响。目前治疗PJI的金标准是手术干预，包括移除感染假体、清创、抗微生物治疗以及假体再植入。因此，建立动物PJI模型对于研发针对PJI的新药或治疗方法具有重要意义。本研究中，在将C. albicans沿导丝接种至关节腔之前，先将一根表面光滑的镍钛合金丝（骨科临床广泛应用的一种植入物）插入C57BL/6小鼠的股骨关节内。14天后，通过扫描电子显微镜（SEM）观察到植入物表面已形成成熟且厚实的生物膜。感染关节组织标本的H&E染色显示骨小梁显著减少。综上所述，本研究成功建立了一种操作简便、成功率高、重复性好且临床相关性强的小鼠PJI模型。该模型有望成为研究C. albicans生物膜相关PJI预防的重要临床前模型。

引言

Candida albicans（C. albicans）可共生存在于人体多个部位¹，同时也是最常见的机会性病原真菌，尤其在免疫功能低下患者中可引起危及生命的侵袭性真菌感染^2,3。C. albicans 作为一种多形性真菌，可在酵母相和菌丝相之间相互转化。菌丝相具有更高的毒力，对细胞和组织的黏附性及侵袭能力更强^4,5。此外，C. albicans 还可在义齿、导管和支架等生物医学材料表面形成生物膜^1,6,7。生物膜致密的三维结构限制了抗真菌药物的渗透，同时表达耐药基因，并下调真菌细胞的代谢以抵抗免疫系统的清除作用^6,7。因此，与生物膜相关的感染 在临床上极具治疗挑战性⁸。

Staphylococcus aureus、凝固酶阴性葡萄球菌和肠杆菌是导致PJI的主要病原体⁹。尽管真菌性PJI的发病率相对较低（约1%）¹⁰，但与细菌性PJI相比，其治疗费用更高¹¹，治疗周期更长¹¹，且治疗成功率更低¹⁰。近年来，真菌性PJI的发病率逐年上升¹⁰。念珠菌性PJI占真菌性PJI的77%–84%^10,12，其中C. albicans是最常见的念珠菌种类（占54%）。因此，有必要对真菌性PJI进行深入研究。

目前，假体关节感染（PJI）的治疗采用翻修手术，包括以下步骤：（1）移除受感染的植入物，（2）清创，（3）抗菌治疗，以及（4）重新植入假体。在彻底清创后，植入含抗生素的骨水泥，并对患者进行全身性抗生素治疗，持续超过6周，以在植入新假体前有效控制感染¹³。然而，该方法无法完全清除组织中的病原体，且长期使用抗菌治疗处理的复发性感染极易导致耐药菌株的产生^14,15,16。

建立PJI的动物模型对于研发PJI的新药或治疗方法至关重要。在PJI的发展过程中，假体周围会形成较大的死腔，导致血肿形成，进而阻断周围组织的血液供应，并削弱抗生素的疗效^11,15。由于难以模拟假体周围的微环境，传统的动物模型无法准确再现PJI的实际状况^17,18。

本研究通过使用临床上广泛应用的钛镍丝模拟关节植入物，构建了一种小鼠C. albicans生物膜相关性人工关节感染（PJI）模型^19,20。该PJI模型具有操作简便、成功率高、重复性好以及与临床相关性强等优点，有望成为研究C. albicans生物膜相关性人工关节感染预防与治疗的重要模型。

方案

实验动物购自西安交通大学。所有动物实验程序均经西安交通大学机构动物伦理委员会批准（批准编号：SCXK [陕西] 2021-103）。小鼠在实验前饲养一周，每笼5只，可自由摄取食物和饮水。动物在室温（RT；24 °C ± 1 °C）及12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，直至实验开始。

1. 缓冲液与仪器准备

1. C. albicans 细胞培养
   1. 接种单克隆菌落 白色念珠菌 使用接种环从酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板培养基中挑取（SC5314）菌株，接种于5 mL YPD液体培养基（YPD + 50 µg/mL 羧苄青霉素）中。
   2. 振荡 C. albicans 细胞随后在30 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。
   3. 将悬液在400 x g 在室温下孵育5分钟。重悬沉淀物 白色念珠菌 生理盐水中的细胞并稀释细胞浓度 至 1 × 10⁶ 通过目视调整浊度至与0.5麦氏标准相当，使细胞浓度为cells/mL。
2. 生理盐水的制备
   1. 称取0.9 g氯化钠，溶于100 mL去离子水中，配制0.9%生理盐水。
3. 手术器械准备
   1. 使用前将手术器械（剪刀、镊子、止血钳、持针器、缝合针）和钛镍合金丝（直径约0.5 mm）在高压灭菌器中灭菌（121 °C，30 min）。

2. 小鼠假体周围感染模型的建立

1. 将30只C57BL/6小鼠（雄性，15-20 g）随机分为3组（每组10只），分别为对照组、空白植入组（植入钛镍丝但不感染C. albicans）和PJI组（植入钛镍丝并感染C. albicans）。
2. 使用1-4%异氟烷吸入麻醉小鼠，在去除左后肢毛发并用碘液消毒前确认麻醉深度，以翻正反射消失且对足趾刺激无反应为标准。在 麻醉期间，双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥，并在手术及恢复期间补充热量。
3. 对于对照组小鼠，不进行任何处理，自由饮水和进食。
4. 对于空白植入组和PJI组小鼠，使用#10刀片或无菌剃刀在每只左后肢膝关节处做一条5 mm的纵向切口，暴露关节。
5. 将无菌注射器针头（26 G）插入股骨髓腔，制造一个长度为5 mm的孔洞。
6. 将一根光滑的镍钛合金丝（直径0.5 mm，长度5 mm）插入孔中，随后用剪刀剪断（图1）。
7. 对于空白植入组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝滴加2 µL YPD培养基（逐滴加入），使用尼龙缝线（直径0.15 mm）逐层关闭切口。
8. 对于PJI组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝向小鼠关节腔内接种C. albicans细胞 （1 × 10⁶ 个细胞/mL）2 µL（逐滴加入），使用尼龙缝线逐层关闭切口。
9. 将小鼠饲养14天，期间自由饮水和进食。皮下注射美洛昔康（4 mg/kg），每24小时一次，持续最多3天。
10. 14天后，使用3%异氟烷麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。

3. 假体关节感染模型评估

1. 主要器官感染的评估
   1. 处死小鼠后，采集其肾脏、肝脏和脾脏。
   2. 向每种器官中加入 500 µL 无菌生理盐水，在均质器上于 4 °C 条件下研磨组织。
   3. 取步骤 3.1.2 制备的匀浆液 100 µL 接种至 YPD 平板，并用弯头玻璃棒均匀涂布。
   4. 将 YPD 平板倒置于 37 °C 培养箱中培养 48 小时。
   5. 肉眼观察并计数菌落数量。
2. 观察植入物表面的白色念珠菌（C. albicans）及其生物膜
   1. 用剪刀小心剪开小鼠关节处皮肤，随后用镊子取出植入物。
   2. 将植入物浸入 2.5% 戊二醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。
   3. 用无菌 PBS 冲洗植入物三次，随后将其浸入 1% 锇酸溶液中 3 小时。
   4. 用无菌 PBS 冲洗植入物三次，再依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中各 15 分钟进行脱水。
   5. 将植入物在叔丁醇中浸泡 30 分钟，重复三次，随后进行冷冻干燥。
   6. 将植入物样品固定于样品台，喷金（镀金层厚度 10 nm），在高真空条件下、1.5 kV 电压下使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。
3. 股骨组织的病理学分析
   1. 处死小鼠后，用剪刀采集股骨组织。
   2. 将股骨组织浸入 4% 多聚甲醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。
   3. 将股骨组织置于 10% 福尔马林溶液中保存 1 周。
   4. 将股骨组织依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中，各 15 分钟，进行脱水处理。
   5. 将脱水后的股骨组织包埋于石蜡中，使用切片机切成 4 µm 厚的组织切片。
   6. 按照标准方案对股骨切片进行苏木精-伊红染色，随后进行病理学分析²¹。

结果

将样本接种至平板培养基，经 overnight 培养后计数菌落，是评估病灶局部病原负荷的常用方法^22,23。在本研究中，肝脏、肾脏和脾脏样本的微生物培养结果均为阴性，表明本研究所建立的模型仅导致小鼠局部感染，而未引起全身性感染²³。

空白植入组中，镍钛合金丝表面未见白色念珠菌（C. albicans）黏附或定植；而PJI组镍钛合金丝表面可见成熟且厚实的生物膜，表明术后14天小鼠体内成功构建了与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）模型。图2展示了植入物的扫描电镜图像²³。

H&股骨组织的E染色结果如图所示 图3对照组中可见清晰完整的骨小梁结构，而空白植入组的股骨组织中可见少量骨小梁组织缺损。图3，黄色箭头）。在PJI组中，骨小梁数量显著减少²³这些结果表明 C. albicans 小鼠生物膜相关性PJI模型成功建立，并伴有明显的股骨组织病理损伤。

图 1：植入手术示意图。 左侧图中的红色方框标示了手术部位，即光滑的镍钛合金丝插入的位置。右侧图显示了带有镍丝的部分股骨（红圈所示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：空白组与PJI组植入物表面的扫描电镜图像。 放大倍数1000×（比例尺 = 500 µm）和5000×（比例尺 = 100 µm）的图像作为代表性结果展示。本图经Mo等²³许可修改。 请点击此处查看此图的高清版本。

图3：股骨组织的H&E染色结果。图中展示了植入物组、PJI模型组和对照组典型的H&E染色图像。对照组显示出清晰且完整的骨小梁结构。空白植入物组股骨组织中可见少量骨小梁组织缺损（黄色箭头所示）。然而，PJI组中骨小梁数量明显减少。图中所示放大倍数分别为200×（比例尺 = 150 µm）和400×（比例尺 = 75 µm）。本图经Mo等²³许可修改。 请点击此处查看此图的高清版本。

讨论

手术过程中由于手术器械或手术环境受到污染而引起的感染，是大多数植入物相关感染的主要原因^24,25,26,27。因此，本研究构建了一种与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）小鼠模型。与传统PJI模型中使用悬浮于生理盐水中的无菌不锈钢颗粒作为植入物的方法不同，本研究采用镍钛合金丝——一种常用的植入材料——以模拟C. albicans、植入材料与骨骼之间的相互作用，更接近临床实际情况。

本文所述的PJI模型能够完美模拟临床中PJI的生理环境。该模型仅可用于研究植入期间的感染，而不能用于研究后期的血源性感染。

C. albicans 可通过两种方式接种。一种是在手术期间直接将 C. albicans 接种至植入部位²⁸，另一种是将植入物在含有 C. albicans 的培养体系中培养一段时间，使其表面形成成熟的生物膜后再进行外科植入²⁹。本研究采用前一种方法，因其可实现病原体接种数量的精确控制，从而最大限度减少组间差异，并对后续治疗效果进行更为客观的评估。此外，前一种方法更符合临床实际情况。

在本方案中，植入物的插入操作较难完成。操作者需反复练习多次，以确保将植入物准确置入关节腔内，而非皮下或肌肉内。此外，白色念珠菌（C. albicans）的接种数量对于假体关节感染模型的可重复性至关重要。应通过涡旋振荡充分混匀白色念珠菌（C. albicans），以确保接种数量的准确性。同时，应沿合金导丝加入白色念珠菌（C. albicans），以模拟临床情况下的感染途径。

细菌感染后7天可检测到生物膜，随后生物膜逐渐增加，并在第14^天达到平台期³⁰。因此，在第14^天评估所建立的PJI模型是否成功。通过扫描电镜（SEM）观察C. albicans在植入物表面的定植及生物膜的形成情况。通过H&E染色后的病理学分析，评估局部感染所致的植入物周围组织病变。研究表明，假体周围骨溶解是PJI的重要特征之一³¹。因此，这些指标在评估预防和治疗PJI的干预方法时也至关重要³²。

微生物培养常用于临床和实验室中检测微生物感染。因此，本研究对植入物、植入物周围组织、肝脏及其他重要器官进行了微生物培养。对于植入物，采用超声处理以去除黏附在钛镍合金丝表面的C. albicans。随后，通过离心富集C. albicans，再进行微生物培养。然而，培养结果为阴性，与扫描电镜（SEM）结果不一致（图2）。SEM结果显示C. albicans已黏附于钛镍合金丝表面。因此，微生物培养结果为假阴性，可能归因于C. albicans对钛镍合金丝的紧密黏附；超声处理未能成功将C. albicans从植入物表面剥离。同样，对植入物周围组织及其他重要器官的微生物培养结果也为阴性。可能的原因有两个：（1）本研究接种的C. albicans数量仅为2000 CFU，可能过少，不足以在实验期间侵入周围组织或全身系统；（2）从组织中提取和分离病原体的方法敏感性较低。既往发表的研究指出，微生物培养容易出现假阴性结果，可能导致治疗延误³³。Grocott-Gomori染色可用于检测骨与关节中菌丝的形成³²。此外，增加接种量、延长实验周期或在术前使小鼠处于免疫抑制状态，可能有助于提高检测率³²。但需注意，长期感染可能导致深部感染甚至全身性感染。因此，实验周期的设计应根据具体研究目的而定。

总之，本研究成功建立了一个小鼠模型 C. albicans 与生物膜相关的假体关节感染，对于研究其预防和治疗可能具有重要意义 C. albicans 与生物膜相关的种植体周围炎

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 Mactutrius turbidibris	上海路径科技有限公司	5106063
4 °C 冰箱	伊莱克斯（中国）电器有限公司	ESE6539TA
琼脂	北京奥博星生物技术有限责任公司	01-001
分析天平	岛津	ATX124
高压灭菌器	三洋	MLS-3750
羧苄西林	Amresco	C0885
Eclipse Ci 尼康 upright 光学显微镜	尼康	Eclipse Ts2-FL
葡萄糖	麦克林	D823520
接种环	赛默飞世尔科技	251586
异氟烷	RWD	20210103
NaCl	西安京西双和制药有限公司	20180108
多聚甲醛	碧云天生物技术	P0099
蛋白胨	北京奥博星生物技术有限责任公司	01-001
RWD R550 多通道小动物麻醉机	RWD	R550
扫描电子显微镜（SEM）	日立	TM-1000
恒温培养箱	上海智楚仪器有限公司	ZQTY-50N
超纯水机	Heal Force	NW20VF
超声波仪	Do-Chrom	DS10260D
酵母提取物	赛默飞世尔科技 Oxoid	LP0021B