小鼠假体周围Candida albicans感染模型

摘要

由危险病原体引起的假体周围关节感染（PJI）在临床骨科中较为常见。现有的动物模型无法准确模拟PJI的实际状况。本文中，我们建立了一种与白色念珠菌（Candida albicans）生物膜相关的PJI小鼠模型，用于研究和开发针对PJI的新疗法。

摘要

假体周围关节感染（PJI）是Candida albicans（C. albicans）引起的一种常见感染，日益引起外科医生和科学家的关注。通常，C. albicans会在感染部位形成生物膜，从而使其免受抗生素和免疫清除的影响。目前治疗PJI的金标准是手术干预，包括移除感染假体、清创、抗微生物治疗以及假体再植入。因此，建立动物PJI模型对于研发针对PJI的新药或治疗方法具有重要意义。本研究中，在将C. albicans沿导丝接种至关节腔之前，先将一根表面光滑的镍钛合金丝（骨科临床广泛应用的一种植入物）插入C57BL/6小鼠的股骨关节内。14天后，通过扫描电子显微镜（SEM）观察到植入物表面已形成成熟且厚实的生物膜。感染关节组织标本的H&E染色显示骨小梁显著减少。综上所述，本研究成功建立了一种操作简便、成功率高、重复性好且临床相关性强的小鼠PJI模型。该模型有望成为研究C. albicans生物膜相关PJI预防的重要临床前模型。

引言

Candida albicans（C. albicans）可共生存在于人体多个部位¹，同时也是最常见的机会性病原真菌，尤其在免疫功能低下患者中可引起危及生命的侵袭性真菌感染^2,3。C. albicans 作为一种多形性真菌，可在酵母相和菌丝相之间相互转化。菌丝相具有更高的毒力，对细胞和组织的黏附性及侵袭能力更强^4,5。此外，C. albicans 还可在义齿、导管和支架等生物医学材料表面形成生物膜^1,6,7。生物膜致密的三维结构限制了抗真菌药物的渗透，同时表达耐药基因，并下调真菌细胞的代谢以抵抗免疫系统的清除作用^6,7。因此，与生物膜相关的感染 在临床上极具治疗挑战性⁸。

Staphylococcus aureus、凝固酶阴性葡萄球菌和肠杆菌是导致PJI的主要病原体⁹。尽管真菌性PJI的发病率相对较低（约1%）¹⁰，但与细菌性PJI相比，其治疗费用更高¹¹，治疗周期更长¹¹，且治疗成功率更低¹⁰。近年来，真菌性PJI的发病率逐年上升¹⁰。念珠菌性PJI占真菌性PJI的77%–84%^10,12，其中C. albicans是最常见的念珠菌种类（占54%）。因此，有必要对真菌性PJI进行深入研究。

目前，假体关节感染（PJI）的治疗采用翻修手术，包括以下步骤：（1）移除受感染的植入物，（2）清创，（3）抗菌治疗，以及（4）重新植入假体。在彻底清创后，植入含抗生素的骨水泥，并对患者进行全身性抗生素治疗，持续超过6周，以在植入新假体前有效控制感染¹³。然而，该方法无法完全清除组织中的病原体，且长期使用抗菌治疗处理的复发性感染极易导致耐药菌株的产生^14,15,16。

建立PJI的动物模型对于研发PJI的新药或治疗方法至关重要。在PJI的发展过程中，假体周围会形成较大的死腔，导致血肿形成，进而阻断周围组织的血液供应，并削弱抗生素的疗效^11,15。由于难以模拟假体周围的微环境，传统的动物模型无法准确再现PJI的实际状况^17,18。

本研究通过使用临床上广泛应用的钛镍丝模拟关节植入物，构建了一种小鼠C. albicans生物膜相关性人工关节感染（PJI）模型^19,20。该PJI模型具有操作简便、成功率高、重复性好以及与临床相关性强等优点，有望成为研究C. albicans生物膜相关性人工关节感染预防与治疗的重要模型。

方案

实验动物购自西安交通大学。所有动物实验程序均经西安交通大学机构动物伦理委员会批准（批准编号：SCXK [陕西] 2021-103）。小鼠在实验前饲养一周，每笼5只，可自由摄取食物和饮水。动物在室温（RT；24 °C ± 1 °C）及12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，直至实验开始。

1. 缓冲液与仪器准备

1. C. albicans 细胞培养
   1. 接种单克隆菌落 白色念珠菌 使用接种环从酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板培养基中挑取（SC5314）菌株，接种于5 mL YPD液体培养基（YPD + 50 µg/mL 羧苄青霉素）中。
   2. 振荡 C. albicans 细胞随后在30 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。
   3. 将悬液在400 x g 在室温下孵育5分钟。重悬沉淀物 白色念珠菌 生理盐水中的细胞并稀释细胞浓度 至 1 × 10⁶ 通过目视调整浊度至与0.5麦氏标准相当，使细胞浓度为cells/mL。
2. 生理盐水的制备
   1. 称取0.9 g氯化钠，溶于100 mL去离子水中，配制0.9%生理盐水。
3. 手术器械准备
   1. 使用前将手术器械（剪刀、镊子、止血钳、持针器、缝合针）和钛镍合金丝（直径约0.5 mm）在高压灭菌器中灭菌（121 °C，30 min）。

2. 小鼠假体周围感染模型的建立

1. 将30只C57BL/6小鼠（雄性，15-20 g）随机分为3组（每组10只），分别为对照组、空白植入组（植入钛镍丝但不感染C. albicans）和PJI组（植入钛镍丝并感染C. albicans）。
2. 使用1-4%异氟烷吸入麻醉小鼠，在去除左后肢毛发并用碘液消毒前确认麻醉深度，以翻正反射消失且对足趾刺激无反应为标准。在 麻醉期间，双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥，并在手术及恢复期间补充热量。
3. 对于对照组小鼠，不进行任何处理，自由饮水和进食。
4. 对于空白植入组和PJI组小鼠，使用#10刀片或无菌剃刀在每只左后肢膝关节处做一条5 mm的纵向切口，暴露关节。
5. 将无菌注射器针头（26 G）插入股骨髓腔，制造一个长度为5 mm的孔洞。
6. 将一根光滑的镍钛合金丝（直径0.5 mm，长度5 mm）插入孔中，随后用剪刀剪断（图1）。
7. 对于空白植入组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝滴加2 µL YPD培养基（逐滴加入），使用尼龙缝线（直径0.15 mm）逐层关闭切口。
8. 对于PJI组小鼠，在逐层缝合伤口前，沿镍钛合金丝向小鼠关节腔内接种C. albicans细胞 （1 × 10⁶ 个细胞/mL）2 µL（逐滴加入），使用尼龙缝线逐层关闭切口。
9. 将小鼠饲养14天，期间自由饮水和进食。皮下注射美洛昔康（4 mg/kg），每24小时一次，持续最多3天。
10. 14天后，使用3%异氟烷麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。

3. 假体关节感染模型评估

1. 主要器官感染的评估
   1. 处死小鼠后，采集其肾脏、肝脏和脾脏。
   2. 向每种器官中加入 500 µL 无菌生理盐水，在均质器上于 4 °C 条件下研磨组织。
   3. 取步骤 3.1.2 制备的匀浆液 100 µL 接种至 YPD 平板，并用弯头玻璃棒均匀涂布。
   4. 将 YPD 平板倒置于 37 °C 培养箱中培养 48 小时。
   5. 肉眼观察并计数菌落数量。
2. 观察植入物表面的白色念珠菌（C. albicans）及其生物膜
   1. 用剪刀小心剪开小鼠关节处皮肤，随后用镊子取出植入物。
   2. 将植入物浸入 2.5% 戊二醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。
   3. 用无菌 PBS 冲洗植入物三次，随后将其浸入 1% 锇酸溶液中 3 小时。
   4. 用无菌 PBS 冲洗植入物三次，再依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中各 15 分钟进行脱水。
   5. 将植入物在叔丁醇中浸泡 30 分钟，重复三次，随后进行冷冻干燥。
   6. 将植入物样品固定于样品台，喷金（镀金层厚度 10 nm），在高真空条件下、1.5 kV 电压下使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。
3. 股骨组织的病理学分析
   1. 处死小鼠后，用剪刀采集股骨组织。
   2. 将股骨组织浸入 4% 多聚甲醛溶液中，在 4 °C 条件下固定 48 小时。
   3. 将股骨组织置于 10% 福尔马林溶液中保存 1 周。
   4. 将股骨组织依次浸入 50%、70%、80%、90% 和 100% 乙醇溶液中，各 15 分钟，进行脱水处理。
   5. 将脱水后的股骨组织包埋于石蜡中，使用切片机切成 4 µm 厚的组织切片。
   6. 按照标准方案对股骨切片进行苏木精-伊红染色，随后进行病理学分析²¹。

结果

将样本接种至平板培养基，经 overnight 培养后计数菌落，是评估病灶局部病原负荷的常用方法^22,23。在本研究中，肝脏、肾脏和脾脏样本的微生物培养结果均为阴性，表明本研究所建立的模型仅导致小鼠局部感染，而未引起全身性感染²³。

空白植入组中，镍钛合金丝表面未见白色念珠菌（C. albicans）黏附或定植；而PJI组镍钛合金丝表面可见成熟且厚实的生物膜，表明术后14天小鼠体内成功构建了与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）模型。图2展示了植入物的扫描电镜图像²³。

H&股骨组织的E染色结果如图所示 图3对照组中可见清晰完整的骨小梁...

讨论

手术过程中由于手术器械或手术环境受到污染而引起的感染，是大多数植入物相关感染的主要原因^24,25,26,27。因此，本研究构建了一种与C. albicans生物膜相关的假体关节感染（PJI）小鼠模型。与传统PJI模型中使用悬浮于生理盐水中的无菌不锈钢颗粒作为植入物的方法不同，本研究采用镍钛合金丝——一种常用的植入材料——以模拟C. albicans、植入材料与骨骼之间的相互作用，更接近临床实际情况。

本文所述的PJI模型能够完美模拟临床中PJI的生理环境。该模型仅可用于研究植入期间的感染，而不能用于研究后期的血源性感染。

C. albicans 可通过两种方式接种。一种是在手术期间直接将 C. albicans<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 Mactutrius turbidibris	上海路径科技有限公司	5106063
4 °C 冰箱	伊莱克斯（中国）电器有限公司	ESE6539TA
琼脂	北京奥博星生物技术有限责任公司	01-001
分析天平	岛津	ATX124
高压灭菌器	三洋	MLS-3750
羧苄西林	Amresco	C0885
Eclipse Ci 尼康 upright 光学显微镜	尼康	Eclipse Ts2-FL
葡萄糖	麦克林	D823520
接种环	赛默飞世尔科技	251586
异氟烷	RWD	20210103
NaCl	西安京西双和制药有限公司	20180108
多聚甲醛	碧云天生物技术	P0099
蛋白胨	北京奥博星生物技术有限责任公司	01-001
RWD R550 多通道小动物麻醉机	RWD	R550
扫描电子显微镜（SEM）	日立	TM-1000
恒温培养箱	上海智楚仪器有限公司	ZQTY-50N
超纯水机	Heal Force	NW20VF
超声波仪	Do-Chrom	DS10260D
酵母提取物	赛默飞世尔科技 Oxoid	LP0021B