利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

摘要

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外 并通过电穿孔递送。

摘要

小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）是研究组织巨噬细胞复杂生物学特性的重要工具。作为原代细胞，它们可模拟巨噬细胞的生理状态 体内 相较于永生化巨噬细胞系，原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）更接近天然状态，且可来源于已携带特定遗传修饰的小鼠。然而，在BMDMs中实现基因功能敲除在技术上仍具挑战性。本文提供了一种高效的CRISPR/Cas9基因组编辑方案，适用于BMDMs，可引入小片段插入或缺失（indels），导致移码突变，从而破坏目标基因功能。该方案详细描述了单导向RNA（sgRNA-Cas9）的合成方法，以及纯化sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）的制备流程，并通过电穿孔实现RNP递送。同时，方案中包含一种高效检测编辑效率的方法，结合常规Sanger测序及一款免费在线分析工具进行结果评估。本方案可在1周内完成，无需质粒构建，通常可达到85%至95%的编辑效率。

引言

巨噬细胞是天然免疫细胞，在组织修复和免疫中发挥关键作用^1,2永生化巨噬细胞系，例如小鼠 RAW 264.7 细胞或人 THP-1 细胞，具有多种优势特性，包括生长 robust、易于通过递送 RNA 干扰或 CRISPR/Cas9 的载体实现基因敲除^3,4然而，癌基因转化会显著改变细胞的生理状态，导致某些信号通路异常激活，而其他通路的响应则受到抑制^5,6原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）更真实地模拟 体内 巨噬细胞生理学, 但由于质粒转染和病毒转导在这类原代免疫细胞中的效率均较低，对其进行遗传操作仍然具有挑战性^7,8因此，需要更高效的方法来破坏基因功能。

CRISPR/Cas9基因组编辑是在包括哺乳动物细胞在内的多种生物系统中进行遗传操作的强大工具^9,10

方案

1. sgRNA 设计

注意：此步骤描述了靶序列的选择和sgRNA的设计。建议设计位于首个大编码外显子中的向导序列，以便在开放阅读框的早期中断任何翻译出的蛋白质。同时建议选择位于同一外显子内的靶序列，这将简化编辑效率的分析（步骤6）。本实验方案提供的基因组编辑示例中，使用的sgRNA靶向小鼠基因组中Src基因和Cblb基因的第一个外显子，以及非编码的Rosa26位点。

1. 使用多种免费的在线设计工具之一，确定要靶向的20个核苷酸基因组序列表1选择每个基因内不重叠的四到五个向导RNA，因为Cas9的活性随所选向导RNA的不同而有所差异， 先验的 无法预测高活性的向导序列。
   注意：确保向导序列相对于靶向位点序列的正确方向至关重要。设计工具通常以 5' 到 3' 方向提供向导序列，而不论其靶向的是哪一条染色体链。为验证链的方向，请检查是否存在原间隔序列邻近基序（PAM）序列 S. pyogenes Cas9（nGG）位于靶向基因组序列的紧邻3'端。sgRNA序列不包含PAM。

2. sgRNA 合成

注意：此步骤描述了如何通过 PCR 扩增....

结果

体外转录（IVT）模板是一个127 bp的PCR产物（图1B）。全长IVT产物为98 nt的RNA，其迁移速度与70 bp的双链DNA片段相似（图1C）。

电穿孔后，细胞应 >90% 存活率，总细胞数为 >起始细胞数量的70%。所获得的突变细胞群体应包含多种多样的插入缺失（indel），且这些突变起始于Cas9切割位点附近。通过PCR和Sanger测序对靶基因进行分析时，应在Cas9切割位点下游的每个位置均观察到多个不同的核苷酸图2).

讨论

利用电穿孔法递送Cas9-sgRNA复合物进行基因组编辑，可有效破坏BMDM中的基因功能。编辑效率因靶序列和基因的不同而有所差异。通常需要筛选四到五个sgRNA，以确定一个高效活性的sgRNA。某些基因位点的编辑效率较低，最可能的原因是染色质结构的影响。在这些情况下，可通过多种优化手段提高编辑效率。对同一外显子共递送两个高效sgRNA，可提升部分基因的编辑效果。然而，当两个向导RNA共转染时，我们发现TIDE分析可能会失去准确性。因此，可能需要采用其他方法（如蛋白质印迹法）来评估编辑效果。此外，加入 commercially available 的NHEJ增强剂通常可使编辑效率提高约20%（图3）。

这种方法具有多个优势。将sgRNA-Cas9直接递送至细胞，无需耗时的质粒构建或慢病毒载体生产步骤即可转导BMDM。合成sgRNA、电穿孔及生成突变细胞的过程可在1周内完成。该技术还可与来自基因修饰小鼠的BMDM联合使用，以生成双突变细胞。尽管已有化学方法可用于将siRNA或mRNA转染入原代免疫细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3T3-MCSF 细胞系	Russell Vance 惠赠	不适用
Alt-R Cas9 电穿孔增强剂	IDT	1075915
Ampure XP 纯化磁珠	贝克曼库尔特	A63880
小牛肠道碱性磷酸酶	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg（0.9 mM CaCl₂ 和 0.5 mM MgCl₂）	赛默飞世尔科技	14040-133
DPBS -Ca/Mg	赛默飞世尔科技	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
胎牛血清（FCS）	康宁	35-015-CV
Herculase DNA聚合酶 &缓冲液	安捷伦	600677
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒	NEB	E2040S
LoBind 锥形管 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf 离心管 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon 转染系统	赛默飞世尔科技	MPK5000、MPP100、MPS100
Neon 转染系统 10 µL 吸头	赛默飞世尔科技	MPK1025 或 MPK1096
PBS + 1 mM EDTA	Lonza	BE02017F
蛋白酶K	赛默飞世尔科技	EO0491
rCutSmart 缓冲液（用于 ExoI）	NEB	B6004S
Ribolock	赛默飞世尔科技	EO0384
RNA上样染料	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	加州大学宏实验室	不适用	非加州大学研究人员可通过以下途径获取  https://qb3.berkeley.edu
化脓性链球菌Cas9-NLS，经修饰的第三代	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S