本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤 体外使用组织解离仪进行胶原酶消化可减少实验变异并提高可重复性。
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摘要
摘要
该 体外 白色、棕色和米色脂肪细胞分化的研究有助于探究脂肪细胞的细胞自主功能及其作用机制。目前已公开获取并广泛使用永生化的白色前脂肪细胞系。然而，现有公开的白色脂肪细胞系难以完全模拟外界刺激下白色脂肪组织中米色脂肪细胞的出现过程。通常通过分离小鼠脂肪组织中的基质血管组分（SVF）以获取原代前脂肪细胞，并进行脂肪细胞分化实验。然而，手工切碎脂肪组织并进行胶原酶消化的步骤容易导致实验变异，并易受污染。本文介绍一种改良的半自动化实验方案，利用组织解离仪进行胶原酶消化，以更简便地分离SVF，旨在减少实验变异、降低污染风险并提高可重复性。所获得的前脂肪细胞及分化后的脂肪细胞可用于功能与机制分析。
引言
脂肪组织生物学正因全球范围内肥胖症和2型糖尿病患病率的不断上升而受到日益增多的关注1脂肪细胞以脂滴形式储存多余能量，并在饥饿时释放这些能量。此外，脂肪组织还作为内分泌器官，与其他组织进行通讯，从而维持机体的能量稳态。2,3有趣的是，脂肪组织过多（肥胖）和脂肪组织减少（脂肪萎缩）均与胰岛素抵抗和糖尿病相关1脂肪细胞分为三种类型：白色、棕色和米色1白色脂肪细胞主要将多余的能量以脂质形式储存，而棕色和米色脂肪细胞则以热能形式耗散能量 通过 线粒体解偶联蛋白-1 (Ucp1)1,4. 值得注意的是，米色脂肪细胞（也称为 "可诱导的" 棕色脂肪细胞在受到寒冷或交感神经刺激时会出现在白色脂肪组织中，其基因表达模式与白色脂肪细胞有部分重叠，但又明显不同 "经典" 棕色脂肪细胞5近年来，棕色和米色脂肪细胞被认为可能是抗肥胖和抗糖尿病治疗的潜在靶点，旨在 "增强能量耗散" 而不是 "抑制能量摄入"4. 支持性地，该风险等位基因 FTO 人类肥胖相关变异位点rs1421085，在常见变异中与较高体重指数（BMI）的关联性最强6,7 并表现出多种基因-环境相互作用8,9据报道，会负向调控米色脂肪细胞的分化与功能10过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）被称为脂肪生成的主要转录调控因子，对脂肪细胞分化既必要又充分。11转录调控因子，如含PRD1-BF1-RIZ1同源结构域蛋白16（PRDM16）、早期B细胞因子2（EBF2）和核因子I-A（NFIA），在棕色和米色脂肪细胞的分化与功能中起关键作用12,13,14,15,16,17,18另一方面，白色脂肪细胞的基因编程需要转录调节因子，如类转导素增强子蛋白3（TLE3）和锌指蛋白423（ZFP423）。19,20,21.
体外模型系统可用于开展旨在加深理解脂肪细胞功能及功能障碍潜在机制的分子研究。尽管目前已存在一些公开可获取且可永生化的前脂肪细胞系（如 3T3-L1 和 3T3-F442A）22,23,24，但原代前脂肪细胞的培养及其向脂肪细胞的分化，是研究体内脂肪生成更为合适的模型。从小鼠脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）是获取原代前脂肪细胞的常用方法25,26。然而，脂肪组织的胶原酶消化通常在细菌摇床配合试管架的条件下进行，可能导致实验结果的变异，并容易引发污染27,28。本文中，我们描述了一种替代性方案，采用温和的磁性激活细胞分选（MACS）组织解离器进行胶原酶消化，以更简便地实现SVF的分离。
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方案
本方案中描述的所有动物实验均经东京大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照东京大学的机构指南进行。
1. 酶溶液和培养基的制备
- 取一只7-8周龄小鼠的双侧腹股沟白色脂肪组织（左右两侧，每侧约150 mg）放入解离仪的C管中，并加入2.5 mL酶溶液。
- 用3 mL不含胎牛血清（FBS）和抗生素的DMEM/F12培养基重悬酶D，用2.7 mL不含FBS和抗生素的DMEM/F12培养基重悬酶R，用1 mL缓冲液A重悬酶A。
- 在C管中加入100 µL酶D、50 µL酶R、12.5 µL酶A以及2.35 mL不含FBS和抗生素的DMEM/F12培养基，配制成2.5 mL酶溶液。将含酶溶液的C管置于冰上备用。
2. 脂肪组织的分离
- 通过颈椎脱位法处死7-8周龄雄性C57BL/6J小鼠（体重约20 g）。
- 在洁净工作台中，使用钝头/锐头剪刀从腹部开始沿下肢方向剪开皮肤，以分离腹股沟白色脂肪组织。使用锐头/锐头剪刀从大腿内侧分离脂肪组织。一侧腹股沟脂肪组织重量约为75 mg。
- 将分离的脂肪组织放入含有酶溶液并置于冰上的C管中，并将管子保持在洁净工作台内以维持无菌状态。
3. 脂肪组织的切碎与消化
- 在洁净台中，向 C 管中加入 2.5 mL 酶溶液。
- 用锋利的剪刀将脂肪组织剪切约 50 次，切成小块，使脂肪组织成为约 2 mm2 大小的组织块。
- tightly 拧紧 C 管的管盖，将管子倒置，并将其固定在组织解离仪的套管上，管盖朝下。然后在 37 °C 下消化样品约 40 分钟。
注意：本研究使用 gentleMACS Octo Dissociator with Heaters（Miltenyi Biotec 130-096-427），并按照预设程序 "37C_mr_ATDK_1" 进行操作。
4. 细胞悬液的过滤
- 将含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 预热至 37 °C。
- 从组织解离仪上取下 C 管，加入 5 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12，轻轻吹打 4 次以终止消化。
- 在 20 °C 下以 700 × g 离心 10 分钟。
- 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 加入 10 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12，轻轻吹打 5 次，重悬沉淀。
- 将细胞悬液通过置于新 50 mL 管上的 70 µm 孔径细胞滤网过滤。
- 以 250 × g 离心 5 分钟，并将沉淀重悬于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
5. 细胞铺板
- 在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，加入 10 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 培养基，用移液器吹打十次以重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬液接种至 10 cm 胶原包被培养皿中，放入细胞培养箱（37 °C，5% CO2）孵育 1–2 小时。
注意：胶原包被培养皿并非绝对必需，但根据经验，胶原包被有助于前脂肪细胞的贴壁，从而提高细胞存活率。 - 吸除培养基，每次用 3 mL PBS 洗涤细胞，共洗涤两次。
- 加入 10 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 培养基，将培养皿放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。
6. 前脂肪细胞的传代
- 次日，吸除培养基（细胞为贴壁生长，因此可直接吸除培养基），用 PBS 洗涤细胞两次，每次 3 mL，然后加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 培养基。
- 当细胞达到 80% 汇合度时（通常在 SVF 分离后 4 天），将细胞传代至四个 10 cm 胶原包被的培养皿中。
- 具体操作：吸除培养基，用 PBS（室温 [RT]）洗涤细胞，加入 1 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶，于细胞培养箱中孵育 5 分钟。
- 加入 10 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 培养基以终止胰蛋白酶活性。吹打混匀后，以 440 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，加入 40 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，将细胞接种至四个 10 cm 胶原包被的培养皿中。
- 当细胞再次达到 80% 汇合度时，进行再次传代。
7. 制备表达SV40大T抗原的逆转录病毒以永生化前脂肪细胞（可选）
- 至少在永生化前3天，接种Platinum-E（Plat-E）包装细胞29 密度为 3.0 x 105 细胞/mL，加入2 mL含10% FBS但不含抗生素的DMEM培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 第二天，按照 Lipofectamine 2000 的说明书，转染 4 µg pBABE-neo largeTcDNA（添加基因质粒 #1780）。
- 24小时后，吸除培养基，加入2 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。
- 第二天，收集逆转录病毒上清液。该逆转录病毒可立即用于永生化实验，或保存于 -80 °C。
8. 使用SV40大T抗原永生化前脂肪细胞（可选）
- 在SVF分离后，将前脂肪细胞传代并扩增两次。
- 以每毫升0.5–1.0 × 104个细胞的密度，将细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 次日，为6孔板的每个孔准备250 µL表达SV40大T抗原的新鲜或解冻的逆转录病毒。在440 × g条件下离心5分钟，将上清液转移至新管中。
- 每250 µL逆转录病毒上清液中加入750 µL含10% FBS、1%青霉素-链霉素和1 µL多聚素（polybrene）的DMEM/F12培养基，配制工作用病毒液。
- 吸除原有培养基，每孔加入1,000 µL工作用病毒液，作用于前脂肪细胞。
- 4小时后，每孔补充1 mL含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基。
- 次日，将感染后的前脂肪细胞转移至10 cm培养皿中，并使用含10% FBS、1%青霉素-链霉素和500 µg/mL新霉素（neomycin）的DMEM/F12培养基筛选感染细胞。为监测抗生素筛选效果，另设一皿未感染细胞加入新霉素作为对照。
- 持续使用含新霉素的培养基对感染细胞进行传代，直至监测皿中的未感染细胞全部死亡。
9. 脂肪细胞分化
- 接种细胞。对于12孔板，接种密度为4.0 × 104 细胞/mL，置于1 mL含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中。
- 当预成脂肪细胞达到汇合状态（铺板后48-72小时），吸除培养基，更换为成脂分化培养基（参见 表1 用于成分分析）。
- 分化第2天（即诱导分化后48小时），将培养基更换为维持培养基（参见 表1 用于成分分析）。之后，每2天更换一次维持培养基。终末分化在分化第7天完成。
- 油红O染色
- 对于油红O染色，吸除培养基，每孔用1 mL PBS洗涤细胞一次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育15分钟。
- 孵育期间，用ddH₂O将0.5%油红O储备液（溶于异丙醇）稀释至0.3%2O 并使用滤纸过滤工作液。
- 孵育15 min后，除去甲醛，用60%异丙醇冲洗细胞，加入1 mL过滤后的油红O工作液，室温孵育1 h。
- 孵育结束后，用流动水洗涤细胞。随后在倒置显微镜下观察含脂滴的脂肪细胞（放大倍数：20倍物镜和10倍目镜）。
- mRNA表达分析
注意：请参阅 表2 本研究中所用引物列表。- 吸弃培养基，每孔加入1 mL Trizol。
- 室温孵育15分钟，用移液器吹打使细胞脱落，收集至1.5 mL离心管中。样品可于-80 °C保存，直至进行RNA提取。
- 将冻存样本室温解冻，加入200 µL氯仿，剧烈振荡15秒。
- 在室温下孵育样品 3 分钟，然后以 20,000 x g 离心 g 4 °C下离心15分钟。
- 小心移除水相（上层，无色），并转移至新管中。切勿转移蛋白相（中间层，白色）或苯酚/氯仿相（下层，粉红色）。
- 缓慢加入等体积的70%乙醇，轻轻混匀。切勿涡旋。
- 将样品（最多700 µL）加入置于收集管中的RNA离心柱中。务必包含可能形成的任何沉淀物。
- 9,000 x g 离心 g 4 °C 下离心 30 秒，弃去穿过滤液。
- 加入 700 µL RW1 缓冲液，9,000 x g 4 °C 下离心 30 秒，弃去滤液。
- 将柱子转移至新的收集管中，并加入500 µL RPE缓冲液。
- 9,000 x g 离心 g 4 °C 条件下离心 30 秒，弃去穿过滤液。
- 加入500 µL RPE缓冲液，以9,000 x g 4 °C下离心2分钟，弃去滤液。
- 将层析柱转移至新的收集管中，在无缓冲液条件下以9,000 x g离心 g 4 °C下持续1-2分钟。
- 将离心柱转移至新的1.5 mL收集管中，直接向柱膜上加入30 µL无RNase水。
- 在室温下孵育样品 1-2 分钟。然后，在 9,000 x g 在 4 °C 下孵育 1 分钟以洗脱 RNA。
- 使用荧光分光光度计检测RNA浓度。
注意：建议在此处对浓度进行调整。 - 使用约 200 ng 的 RNA 模板进行逆转录。采用商用定量实时聚合酶链式反应（qPCR-RT）试剂盒，并按照制造商提供的说明书操作。反应完成后，将 cDNA 稀释 20 倍至 200 µL。
- 向384孔板的每个孔中加入2.0 µL cDNA、3.0 µL Power Sybr Green Master Mix、0.018 µL 100 µM qPCR正向引物、0.018 µL 100 µM qPCR反向引物以及0.96 µL ddH2O。
- 运行qPCR（孵育阶段：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟；PCR扩增阶段：95 °C 15秒、60 °C 1分钟，共40个循环；熔解曲线阶段：95 °C 15秒，60 °C 1分钟，95 °C 15秒）。采用标准曲线法进行定量。
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结果
该方案在诱导脂肪细胞分化后7天即可获得完全分化的富含脂质的脂肪细胞。脂肪细胞分化程度可通过油红O染色检测甘油三酯和脂质来评估（图1A），或采用qPCR-RT进行脂肪细胞基因（如脂肪生成主调控因子）的mRNA表达分析 Pparg 及其靶点 Fabp4 (图1B）。以诱导米色脂肪细胞分化 体外，一种噻唑烷二酮类PPARγ激动剂，例如罗格列酮，可以使用。事实上，在使用罗格列酮的实验中，我们观察到其剂量依赖性效应可达以下浓度 1 µM 棕色脂肪特异性基因的表达水平，例如 Ucp1 和 Ppargc1a另一方面，罗格列酮对 Fabp4 在某一浓度下达到饱和 0.1 µM (图1C).
通过本方案获得的已分化脂肪细胞可用于多种功能与机制分析，例如耗氧率（OCR）分析16
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讨论
本文描述了一种从小鼠脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并进行脂肪细胞分化的实验方案。 体外使用组织解离仪进行胶原酶消化可降低实验变异性和污染风险，并提高可重复性。尽管该步骤在本方案中至关重要，但该过程高度自动化，无需优化。然而，根据小鼠年龄和脂肪组织库的不同，可能需要对剪碎步骤（例如组织块大小或剪切时间）进行优化。
基质血管组分（SVF）是一种异质性细胞群体，包含前脂肪细胞、巨噬细胞等免疫细胞、内皮细胞及其他细胞。由于前脂肪细胞能够贴壁生长，并耐受洗涤和培养基更换，因此在传代过程中该类细胞得以富集。然而可以合理推测，通过本方案所获得的"前脂肪细胞"仍具有异质性。若要获得更纯的前脂肪细胞群体，需使用针对已报道的前脂肪细胞表面标志物（如 PDGFRα32）的抗体进行荧光激活细胞分选（FACS）。
综上所述，本文介绍了一种使用组织解离仪进行胶原酶消化以分离基质血管组分（SVF）的实验方案。与传统的使用试管架和细菌摇床的方法相比，该方案...
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披露
所有作者均无与本工作相关的竞争性经济利益。
致谢
作者感谢日本东京大学的Takahito Wada和Saiko Yoshida提供的实验协助。本研究由以下资助项目支持：Y.H. 获得的东京大学优秀青年研究人员计划研究资助；日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究资助（KAKENHI）项目，资助号19K17976；日本应用酶学基金会未来糖尿病研究先锋（FFDR）资助项目，资助号17F005；药理学研究基金会资助；持田纪念医药研究振兴基金会资助；MSD生命科学基金会资助；大和证券健康基金会资助；东京生物化学研究基金会资助；武田科学基金会生命科学研究资助；以及泉医学研究基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 12 孔板 | Corning | 3513 | |
| 60 mm 培养皿 | IWAKI | 3010-060 | |
| 脂肪组织解离试剂盒，小鼠和大鼠 | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | 内容物：酶 D、酶 R、酶 A 和缓冲液 A |
| 细胞滤网，70 µm | BD falcon | #352350 | |
| 胶原蛋白包被培养皿，100 mm | BD | #356450 | |
| 胶原蛋白包被培养皿，60 mm | BD | #354401 | |
| 胶原蛋白 I 包被微孔板，6 孔 | IWAKI | 4810-010 | |
| 地塞米松 | Wako | 041-18861 | |
| 解剖镊 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| 解剖剪刀，钝头/锐头 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| 解剖剪刀，锐头/锐头 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂 | Gibco | 10565-042 | |
| 胎牛血清（FBS） | N/A | N/A | |
| gentleMACS C 管 | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| 带加热模块的 gentleMACS Octo 解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R 注射液 U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378-5G | |
| 异丁基甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| 硫酸新霉素 | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS 片剂 | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) 逆转录病毒包装细胞系 | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| 罗格列酮 | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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