本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤 体外使用组织解离仪进行胶原酶消化可减少实验变异并提高可重复性。
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本文内容
摘要
摘要
该 体外 白色、棕色和米色脂肪细胞分化的研究有助于探究脂肪细胞的细胞自主功能及其作用机制。目前已公开获取并广泛使用永生化的白色前脂肪细胞系。然而，现有公开的白色脂肪细胞系难以完全模拟外界刺激下白色脂肪组织中米色脂肪细胞的出现过程。通常通过分离小鼠脂肪组织中的基质血管组分（SVF）以获取原代前脂肪细胞，并进行脂肪细胞分化实验。然而，手工切碎脂肪组织并进行胶原酶消化的步骤容易导致实验变异，并易受污染。本文介绍一种改良的半自动化实验方案，利用组织解离仪进行胶原酶消化，以更简便地分离SVF，旨在减少实验变异、降低污染风险并提高可重复性。所获得的前脂肪细胞及分化后的脂肪细胞可用于功能与机制分析。
引言
脂肪组织生物学正因全球范围内肥胖症和2型糖尿病患病率的不断上升而受到日益增多的关注1脂肪细胞以脂滴形式储存多余能量，并在饥饿时释放这些能量。此外，脂肪组织还作为内分泌器官，与其他组织进行通讯，从而维持机体的能量稳态。2,3有趣的是，脂肪组织过多（肥胖）和脂肪组织减少（脂肪萎缩）均与胰岛素抵抗和糖尿病相关1脂肪细胞分为三种类型：白色、棕色和米色1白色脂肪细胞主要将多余的能量以脂质形式储存，而棕色和米色脂肪细胞则以热能形式耗散能量 通过 线粒体解偶联蛋白-1 (Ucp1)1,4. 值得注意的是，米色脂肪细胞（也称为 "可诱导的" 棕色脂肪细胞在受到寒冷或交感神经刺激时会出现在白色脂肪组织中，其基因表达模式与白色脂肪细胞有部分重叠，但又明显不同 "经典" 棕色脂肪细胞5近年来，棕色和米色脂肪细胞被认为可能是抗肥胖和抗糖尿病治疗的潜在靶点，旨在 "增强能量耗散" 而不是 "抑制能量摄入"4.....
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方案
本方案中描述的所有动物实验均经东京大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照东京大学的机构指南进行。
1. 酶溶液和培养基的制备
- 取一只7-8周龄小鼠的双侧腹股沟白色脂肪组织（左右两侧，每侧约150 mg）放入解离仪的C管中，并加入2.5 mL酶溶液。
- 用3 mL不含胎牛血清（FBS）和抗生素的DMEM/F12培养基重悬酶D，用2.7 mL不含FBS和抗生素的DMEM/F12培养基重悬酶R，用1 mL缓冲液A重悬酶A。
- 在C管中加入100 µL酶D、50 µL酶R、12.5 µL酶A以及2.35 mL不含FBS和抗生素的DMEM/F12培养基，配制成2.5 mL酶溶液。将含酶溶液的C管置于冰上备用。
2. 脂肪组织的分离
- 通过颈椎脱位法处死7-8周龄雄性C57BL/6J小鼠（体重约20 g）。
- 在洁净工作台中，使用钝头/锐头剪刀从腹部开始沿下肢方向剪开皮肤，以分离腹股沟白色脂肪组织。使用锐头/锐头剪刀从大腿内侧分离脂肪组织。一侧腹股沟脂肪组织重量约为75 mg。
- 将分离的脂肪组织放入含有酶溶液并置于冰上的C管中，并将管子保持在洁净工作台内以维持无菌状态。
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结果
该方案在诱导脂肪细胞分化后7天即可获得完全分化的富含脂质的脂肪细胞。脂肪细胞分化程度可通过油红O染色检测甘油三酯和脂质来评估（图1A），或采用qPCR-RT进行脂肪细胞基因（如脂肪生成主调控因子）的mRNA表达分析 Pparg 及其靶点 Fabp4 (图1B）。以诱导米色脂肪细胞分化 体外，一种噻唑烷二酮类PPARγ激动剂，例如罗格列酮，可以使用。事实上，在使用罗格列酮的实验中，我们观察到其剂量依赖性效应可达以下浓度 1 µM 棕色脂肪特异性基因的表达水平，例如 Ucp1 和 Ppargc1a另一方面，罗格列酮对 Fabp4 在某一浓度下达到饱和 0.1 µM (图1C).
通过本方案获得的已分化脂肪细胞可用于多种功能与机制分析，例如耗氧率（OCR）分析16
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讨论
本文描述了一种从小鼠脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并进行脂肪细胞分化的实验方案。 体外使用组织解离仪进行胶原酶消化可降低实验变异性和污染风险，并提高可重复性。尽管该步骤在本方案中至关重要，但该过程高度自动化，无需优化。然而，根据小鼠年龄和脂肪组织库的不同，可能需要对剪碎步骤（例如组织块大小或剪切时间）进行优化。
基质血管组分（SVF）是一种异质性细胞群体，包含前脂肪细胞、巨噬细胞等免疫细胞、内皮细胞及其他细胞。由于前脂肪细胞能够贴壁生长，并耐受洗涤和培养基更换，因此在传代过程中该类细胞得以富集。然而可以合理推测，通过本方案所获得的"前脂肪细胞"仍具有异质性。若要获得更纯的前脂肪细胞群体，需使用针对已报道的前脂肪细胞表面标志物（如 PDGFRα32）的抗体进行荧光激活细胞分选（FACS）。
综上所述，本文介绍了一种使用组织解离仪进行胶原酶消化以分离基质血管组分（SVF）的实验方案。与传统的使用试管架和细菌摇床的方法相比，该方案.......
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披露
所有作者均无与本工作相关的竞争性经济利益。
致谢
作者感谢日本东京大学的Takahito Wada和Saiko Yoshida提供的实验协助。本研究由以下资助项目支持：Y.H. 获得的东京大学优秀青年研究人员计划研究资助；日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究资助（KAKENHI）项目，资助号19K17976；日本应用酶学基金会未来糖尿病研究先锋（FFDR）资助项目，资助号17F005；药理学研究基金会资助；持田纪念医药研究振兴基金会资助；MSD生命科学基金会资助；大和证券健康基金会资助；东京生物化学研究基金会资助；武田科学基金会生命科学研究资助；以及泉医学研究基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 12 孔板 | Corning | 3513 | |
| 60 mm 培养皿 | IWAKI | 3010-060 | |
| 脂肪组织解离试剂盒，小鼠和大鼠 | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | 内容物：酶 D、酶 R、酶 A 和缓冲液 A |
| 细胞滤网，70 µm | BD falcon | #352350 | |
| 胶原蛋白包被培养皿，100 mm | BD | #356450 | |
| 胶原蛋白包被培养皿，60 mm | BD | #354401 | |
| 胶原蛋白 I 包被微孔板，6 孔 | IWAKI | 4810-010 | |
| 地塞米松 | Wako | 041-18861 | |
| 解剖镊 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| 解剖剪刀，钝头/锐头 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| 解剖剪刀，锐头/锐头 | N/A | N/A | 使用前高压灭菌 |
| DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂 | Gibco | 10565-042 | |
| 胎牛血清（FBS） | N/A | N/A | |
| gentleMACS C 管 | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| 带加热模块的 gentleMACS Octo 解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R 注射液 U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378-5G | |
| 异丁基甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| 硫酸新霉素 | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS 片剂 | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) 逆转录病毒包装细胞系 | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| 罗格列酮 | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
参考文献
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
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