中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与多种疾病相关，通常使用免疫荧光法对其进行可视化观察。然而，目前存在多种染色方案，且多数情况下仅针对单一类型的组织进行检测。本文中，我们建立了一种适用于小鼠和人类组织中NETs染色的通用方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）由中性粒细胞在应对细菌感染或创伤性组织损伤时释放，不仅在抗微生物防御中发挥作用，也参与自身免疫性疾病和无菌性炎症过程。NETs 是由双链 DNA 纤维、组蛋白和抗菌蛋白构成的网状结构。释放后，NETs 可在血液和组织中捕获并杀灭胞外病原体。此外，NETs 还可通过促进血小板黏附和凝血参与机体稳态调节。然而，NETs 的异常生成也与多种疾病相关，包括脓毒症和自身免疫性疾病，使其成为潜在的治疗干预靶点。除电子显微镜外，免疫荧光成像目前是唯一已知可用于展示组织中 NETs 相互作用的可视化方法。因此，已有多种染色方法被用于 NETs 的可视化研究。文献中报道了不同的染色方案，我们归纳出四种在不同方案间存在显著差异的关键组分：（1）所用抗体的类型，（2）自发荧光抑制剂的使用，（3）抗原修复方法，（4）通透处理。 体外 免疫荧光染色方案在本研究中被系统性地调整和优化，以适用于不同物种（小鼠、人）及多种组织（皮肤、肠道、肺、肝、心脏、椎间盘）。固定并经石蜡包埋后，将厚度为3 µm的切片置于载玻片上。根据改良的染色方案，使用针对髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白H3（H3cit）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的一抗对样本进行染色。载玻片经二抗染色后，采用宽场荧光显微镜观察。结果依据评估表进行分析，并以半定量方式记录差异。
本文介绍了一种适用于多种组织的优化中性粒细胞胞外诱捕网（NET）染色方案。我们采用了一种新型的一抗对瓜氨酸化组蛋白H3（H3cit）进行染色，并使用减少自发荧光的试剂降低了非特异性染色。此外，我们证明了NET染色需要持续的高温条件，并且必须对样本进行谨慎处理。
引言
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）最早由 Brinkmann 等人在 2004 年被观察到，是一种不同于凋亡和坏死的细胞死亡途径1。在此过程中，中性粒细胞将其去浓缩的染色质释放到细胞外空间，形成覆盖有抗菌蛋白的大型网状结构，这些抗菌蛋白此前储存在颗粒或细胞质中。这些抗菌蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白 H3（H3cit），它们通常用于 NETs 的间接免疫荧光检测2。该方法不仅能识别这些蛋白的定量存在，其优势还在于可特异性地检测 NET 样结构。在 NETs 中，上述蛋白与细胞外 DNA 共定位，可通过每种染色蛋白与细胞外 DNA 的荧光信号重叠来检测。与 NETs 中因细胞外 DNA 与蛋白共定位而产生的信号重叠不同，完整的中性粒细胞不显示共定位现象；在此类细胞中，NET 组分通常分别储存在颗粒、细胞核和细胞质中3。
自从首次发现以来，研究已表明中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在多种疾病中发挥核心作用，尤其是涉及炎症的疾病。在感染过程中，NETs通过在血液和组织中捕获并杀灭细胞外病原体而表现出抗菌功能4,5。然而，NETs也与自身免疫性疾病和过度炎症反应相关，例如系统性红斑狼....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究使用的组织样本来自德国汉堡州动物研究管理局（Behörde für Justiz und Verbraucherschutz，汉堡）批准的实验（批准号：73/17、100/17、94/16、109/2018、63/16）。所用组织包括脓毒症模型小鼠的肺和结肠组织，以及烧伤皮肤组织。实验使用8周龄的雄性和雌性小鼠。所有实验均遵循欧盟关于用于科学目的动物保护的2010/63/EU指令。匿名化的人体样本包括新生儿小肠结肠炎、烧伤皮肤、胆道闭锁、椎间盘炎以及心肌组织。根据汉堡医学研究伦理委员会的意见，这些样本无需知情同意，但本研究已获得该委员会批准（批准号：WF-026/21）。
1. 样品固定
- 采用源自 Abu Abed 和 Brinkmann 的以下方案进行样本固定、脱水、石蜡包埋、切片和封片3,15。
- 通过将 40 g 多聚甲醛（PFA）溶解于 800 mL pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水（TBS）中，配制 4% 甲醛溶液。
- 在通风橱中于 60 °C 下搅拌混合物，直至 PFA 完全溶解。将溶液冷却至室温（RT），并用 TBS 定容至 1,000 mL。
- 调节 pH 至 7.4。4 °C 下可保存 2–3 周，或 −20 °C....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在开始优化实验方案之前，我们通过在PubMed中检索使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）免疫染色的研究，比较其方案，从而确定成功染色的关键步骤。其中差异最显著且具有潜力的方案步骤被确定为优化的重点，而各研究间基本一致的步骤则未作改动（表1）。
表1：关于NETs的FFPE免疫染色的PubMed研究。 本表展示了所分析研究中免疫染色方案的各项变量。所使用的方案被分解为基本步骤，然后相互比较。其中差异最显著且具有优化潜力的步骤被确定为关键优化步骤，并据此调整至我们的实验方案中。对于各研究间基本一致的步骤则未作改动，例如一抗孵育时间（4 °C过夜）。请点击此处下载该表格。
根据我们的研究结果，我们得出结论：选择针.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本研究中，我们旨在将现有的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）成像方案优化并适配于更多类型的组织，首先从实际染色步骤开始。该方法的第一个关键步骤是选择最合适的抗体。针对中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），我们尝试使用来自小鼠宿主的抗人组织NE抗体，但其染色效果与兔源抗体相比缺乏可靠性。此外，Thålin 等人提出H3cit (R8) 抗体在细胞外染色方面具有更高的特异性。我们将该抗体与广泛使用的三重瓜氨酸化组蛋白H3抗体（triH3cit, R2、R8、R17）进行了比较。我们的研究结果显示，在所用浓度下，H3cit (R8) 抗体仅产生细胞外信号，从而更易于在切片上识别NETs。该结果支持了Thålin 等人的观点，即H3cit (R8) 克隆抗体可在降低非瓜氨酸化组蛋白脱靶交叉反应的同时，提供良好的NET信号28。我们还比较了用于人和小鼠组织MPO染色的MPO抗体。结果表明，该小鼠/人共用MPO抗体染色更可靠，且可同时用于人和小鼠样本，简化了实验室中的使用流程。因此，我们推荐在今后的研究中采用H3cit (R8) 与小鼠/人MPO抗体的组合，并已将其纳入我们的实验方案中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由德国研究基金会（BO5534）资助。我们感谢Antonia Kiwitt、Moritz Lenz、Johanna Hagens、Annika Heuer博士以及Ingo Königs副教授为我们提供样本。此外，作者还感谢UKE显微成像中心（UKE医学院核心设施）团队在免疫荧光显微镜实验方面的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 稀释比例 | |||
| 抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| 抗组蛋白 H3（瓜氨酸化 R2 + R8 + R17）抗体 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| 抗髓过氧化物酶抗体 [2C7] 抗人 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| 抗髓过氧化物酶抗体 [2D4] 抗小鼠 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision 显微镜软件 | Zeiss | 4.8.2. | |
| 含驴血清的封闭液（即用型）50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| 盖玻片 | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Citrate pH6 抗原修复液（10倍浓缩） | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS 抗体稀释液 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| 驴抗山羊 Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| 驴抗兔 AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| 驴抗兔 Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G 封片介质 | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| 玻璃载片架 | Roth | H552.1 | |
| 人/小鼠 MPO 抗体 | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| 疏水笔 | KISKER | MKP-1 | |
| 兔 IgG 多克隆同型对照 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 和 1:250 |
| MaxBlock 自发荧光抑制试剂盒（RUO）100 ml | Maxvision | MB-L | |
| 显微成像相机 | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| 微波炉 | Bosch | HMT84M421 | |
| 小鼠 IgG1 阴性对照 | Dako | X0931 Aglient | 1:50 和 1:5 |
| 正常山羊 IgG 对照 | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS 磷酸盐缓冲液（10倍浓缩） | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP 染色缸 | Roth | 2292.2 | |
| 重组抗组蛋白 H3（瓜氨酸化 R8）抗体 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| 重组兔 IgG 单克隆抗体 [EPR25A] - 同型对照 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus 载玻片 | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris 缓冲盐水（10倍浓缩） | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 水浴锅 | Memmert | 830476 | |
| 水浴电饭锅 | reishunger | RCP-30 | |
| 湿盒 | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss 宽场显微镜 | Zeiss | Axiovert 200M |
参考文献
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
标签
