开发一种取食测定系统以评估植物化学物质对棉铃虫Helicoverpa armigera的杀虫效果

摘要

本实验方案描述了一种强制喂养试验，用于评估植物化学物质对鳞翅目昆虫幼虫的潜在毒性作用。这是一种通量极高的昆虫生物测定方法，易于优化亚致死剂量和致死剂量、驱避活性以及生理效应。该方法可用于筛选环境友好型杀虫剂。

摘要

Helicoverpa armigera，一种鳞翅目昆虫，是一种世界性分布的多食性害虫。这种植食性昆虫对植物和农业生产构成威胁。作为应对，植物会产生多种植物化学物质，对昆虫的生长和存活产生负面影响。本实验方案展示了一种强制取食测定方法，用于评估一种植物化学物质（槲皮素）对昆虫生长、发育和存活的影响。在受控条件下，将初孵幼虫饲养于预定义的人工饲料上，直至进入二龄。随后将二龄幼虫分别置于对照组和含槲皮素的人工饲料上取食10天。每隔一天记录昆虫的体重、发育阶段、排泄物重量及死亡率。在整个实验期间评估体重变化、取食模式差异以及发育表型变化. 所述的强制性摄食实验模拟了昆虫的自然摄食方式，可扩展应用于大量昆虫。该方法可用于分析植物化学物质对昆虫生长动态、发育转变及整体适应性的影响 H. armigera此外，该装置还可用于评估营养参数和消化生理过程的变化。本文提供了取食测定系统的一套详细方法学，可应用于毒理学研究、杀虫分子筛选以及植物-昆虫相互作用中化学物质效应的机制解析。

引言

影响作物生产力的生物因素主要是病原体和害虫。多种昆虫害虫可导致农业作物减产15%至35%，并对农业经济可持续性实践造成影响¹。鞘翅目、半翅目和鳞翅目昆虫是造成严重危害的主要害虫类群。环境的高度适应性使鳞翅目昆虫进化出多种生存机制。在鳞翅目昆虫中，Helicoverpa armigera（棉铃虫）可取食约180种不同作物，并对其生殖组织造成显著损害²。在全球范围内，H. armigera的侵袭已造成约50亿美元的经济损失³。棉花、鹰嘴豆、木豆、番茄、向日葵及其他作物均为H. armigera的寄主。该害虫可在寄主植物的不同部位完成其生命周期。雌性成虫将卵产于叶片上，孵化后的幼虫在幼虫期取食植物营养组织。由于其食量大且适应性强，幼虫阶段是造成危害最严重的时期^4,5。H. armigera具有全球分布并不断侵入新区域的特性，这归因于其多项显著特征，如多食性、强大的迁飞能力、高繁殖力、强滞育能力以及对现有害虫防治策略产生抗性的能力⁶。

萜类、黄酮类、生物碱、多酚、氰苷类以及多种其他化学分子被广泛用于防治棉铃虫（H. armigera）的侵害⁷。然而，频繁使用化学分子会因其残留物对环境和人类健康产生不利影响。此外，它们还会对多种害虫天敌产生有害作用，导致生态失衡^8,9。因此，有必要探索安全且环境友好的害虫防治化学分子替代方案。

植物产生的天然杀虫分子（植物化学物质）可作为化学农药的一种有前景的替代方案。这些植物化学物质包括属于生物碱、萜类和酚类等类别的多种次生代谢产物^7,10。槲皮素是存在于多种谷物、蔬菜、水果和叶片中最丰富的黄酮类化合物（酚类化合物）之一。它对昆虫具有拒食和杀虫活性，同时对害虫的天敌无害^11,12。因此，本实验方案展示了利用槲皮素进行取食抑制试验，以评估其对棉铃虫（H. armigera）的毒性作用。

已开发出多种生物测定方法，用于评估天然和合成分子对昆虫取食、生长、发育及行为模式的影响¹³。常用的方法包括叶片圆片法、选择取食法、液滴取食法、接触法、饲料覆盖法和强制取食法^13,14。这些方法根据杀虫剂施用于昆虫的方式进行分类。其中，强制取食法是最常用、灵敏度高、操作简便且适应性强的方法之一，可用于测试潜在杀虫剂及其致死剂量¹⁴。在强制取食法中，将目标分子与人工饲料混合，从而实现对饲料成分的一致性和控制性，获得可靠且可重复的实验结果。影响取食测定的重要变量包括昆虫的发育阶段、杀虫剂的选择、环境因素以及样本量。此外，测定持续时间、两次数据记录之间的间隔、饲喂频率与饲料量、昆虫健康状况以及操作人员的技术水平也可能影响取食测定的结果^14,15。

本研究旨在通过专性取食实验，评估槲皮素对棉铃虫（H. armigera）存活和适应性的影响。通过检测昆虫体重、死亡率和发育异常等参数，可深入了解槲皮素的杀虫效果。同时，通过测定营养参数，包括食物摄入转化效率（ECI）、消化食物转化效率（ECD）和近似消化率（AD），可揭示槲皮素的拒食特性。

方案

H. armigera 幼虫购自印度班加罗尔的印度农业研究委员会国家农业昆虫资源局（ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources，NBAIR）。本研究共使用21头二龄幼虫。

1. 鹰嘴豆人工饲料的制备

注意：配制人工饲料所需的原料列表见表1。

1. 分别称取 表1 中所列的各组分，置于烧杯中，并使用刮勺或磁力搅拌器制备成均匀的混合物。
2. 将组分C在微波炉中约100 °C下煮沸5分钟，然后加入组分A中，并充分混合。
3. 充分混合后，待混合组分稍冷却后再加入组分B（组分B含有热不稳定成分）。
4. 将混合液倒入透明的聚苯乙烯培养皿中，规格为150 mm × 150 mm。

2. 含槲皮素人工饲料的制备

1. 称取适量（1,000 ppm）槲皮素水合物（见材料表），并将其充分溶解于最小体积的有机溶剂中，例如乙醇（2 mg/mL）、二甲基亚砜（DMSO；30 mg/mL）或二甲基甲酰胺（DMF）。此处使用DMSO溶解槲皮素。
2. 将溶解后的槲皮素加入B组分中，随后加入A组分与C组分的混合物中（从B组分中减少的水体积等于所加入DMSO的体积）。
3. 向对照饲料中加入与溶解槲皮素所用有机溶剂等体积的溶剂。
   ​注意：图1展示了制备人工饲料及含槲皮素饲料的示意图。

3. 棉铃虫 H. armigera 品系的饲养与维持

注意：使用经过适当清洁和灭菌的材料进行昆虫饲养和保种。操作昆虫时应严格遵守所有与无菌和安全相关的标准操作规程^16,17,18。

1. 将棉铃虫（H. armigera）卵置于繁殖室（用纱布覆盖的塑料罐）中，并按照步骤3.3所述条件进行维持。然后，使用细毛刷将新孵化的幼虫轻轻转移到新配制的鹰嘴豆基人工饲料上。
2. 使用人工饲料饲养幼虫，成虫则供给20%（w/v）蔗糖溶液并添加1%（w/v）复合维生素（见材料表）^19,20。
   注意：由于棉铃虫（H. armigera）三龄及更晚期幼虫具有同类相食倾向，需将每头幼虫单独饲养于独立小瓶中。
3. 昆虫培养室应维持温度为25 ± 1 °C，相对湿度为70%，光照周期为16小时光照:8小时黑暗²¹。
4. 在实验室中饲养一代昆虫以确保种群一致性，随后用于取食实验。
5. 可选：将昆虫培养室温度升至28 °C，以加快幼虫和蛹的生长速度²²。

4. 取食实验的设置

1. 每组（对照组和处理组）收集21头二龄幼虫，置于无食物环境中约1-3小时。
2. 将对照组和含槲皮素的饲料切成小块，记录所提供的饲料重量及昆虫体重，并小心将昆虫转移至培养管中。让昆虫取食相应的饲料。
   注意：此步骤视为取食实验的第0天。
3. 在实验第2、4、6、8和10天（每隔一天）记录昆虫体重、已提供饲料重量、未摄食饲料重量以及虫粪重量，直至第10天。
4. 第10天后，继续让昆虫取食各自对应的饲料，以观察后续的发育和形态学变化。
   注意：发育变化包括：（1）幼虫-蛹中间态，如后半身为蛹体但带有幼虫表皮斑块、头壳和胸足；（2）前蛹期个体全身完全黑化；（3）体型过小且身体收缩的蛹；（4）蛹-蛾中间态，即蛾体仍包裹旧蛹皮。形态学变化包括成虫畸形，如身体异常、翅膀扭曲及附肢关节异常。这些变化需与对照组饲料饲养的昆虫进行比较。
5. 若无需研究发育和形态缺陷，可在第10天将昆虫冷冻保存。
   ​注意：冷冻幼虫前，需使其饥饿至少3小时，以清除消化道内残留的饲料。

5. 数据记录与分析

1. 在 GraphPad Prism 软件中（参见 材料表），选择一个 XY 来自数据表的 "欢迎或新建表格" 对话，并在其中输入 昆虫数量 将重复值并列置于子列中，然后将X轴的标题命名为 天数，在A组和B组中，给出标题名称作为 对照 和 槲皮素处理分别记录每只昆虫在对照组和处理组中的体重，用于绘制体重变化图。
   注意：GraphPad 中的分析可能因样本量和处理组数量的不同而有所差异。
2. 使用学生t检验（α = 0.05）比较对照组与处理组昆虫的体重。
3. 在第10天统计活的和死亡的幼虫及蛹的数量，使用绘图软件绘制生存率的Kaplan-Meier曲线。
4. 统计蛹的数量，并使用给定公式计算化蛹率：
5. 化蛹率（%）=（形成的蛹数 / 幼虫总数）× 100
6. 比较幼虫发育的营养指数²³ 使用 以下公式，ECI (%) =（幼虫体重增加量 / 摄食量）× 100
   ECD (%) = (幼虫增重/[摄食量 - 粪便量]) × 100
   AD (%) = [（摄食饲料重量 - 粪便重量）/ 摄食饲料重量] × 100

结果

与对照组相比，饲喂含1,000 ppm槲皮素饮食的昆虫幼虫体重显著下降约57%（图2A）。体重的减少导致槲皮素处理组幼虫体型变小（图2B）。与对照组相比，饲喂槲皮素的幼虫摄食速率也明显降低（图2C）。

此外，以槲皮素为食的幼虫化蛹率降低了约14%，且出现化蛹延迟，表明处理导致发育迟缓（图3A、B）。进一步观察到，摄食含槲皮素饲料的昆虫幼虫中，约77.65%表现出存活率下降和致死表型（图4A、B）。根据食物的摄取和利用情况，计算了对照组和摄食槲皮素幼虫的营养参数（补充表1）。摄食含1,000 ppm槲皮素饲料的昆虫，其转化为体物质的效率（ECI）和转化效率（ECD）分别降低了约9%和约49...

讨论

实验室生物测定有助于在较短时间内以合理成本预测结果，并对多种化合物产生比较毒性数据。取食生物测定有助于解释昆虫-杀虫剂以及昆虫-植物-杀虫剂之间的相互作用。这是一种高效的测定多种物质毒性的方法，可显著简化确定半数致死剂量（LD₅₀）、半数致死浓度（LC₅₀）或其他任何致死浓度或剂量的过程^24,25。 目前已有多种实验室生物测定方法用于评估杀虫活性、杀虫剂抗性及化合物毒性，包括饲料覆盖法、点滴法、强制取食法、注射法、接触或残留法以及药膜法^13,14。这些方法可根据具体研究目的选择使用，但理想的生物测定方法应具备快速且高效的特点²⁶。因此，本文所讨论的强制取食法在多种情况下可作为首选的生物测定方法，但不适用于刺吸式口器昆虫。

本文所述的强制取食实验可用于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Himedia	RM666	凝固剂
抗坏血酸	Himedia	CMS1014	维生素C来源
鹰嘴豆	NA	NA	蛋白质和碳水化合物来源
酪蛋白	Sigma	C-5890	蛋白质来源
胆固醇	Sisco Research Laboratories	34811	脂肪酸来源
氯化胆碱	Himedia	GRM6824	铵盐
DMSO	Sigma	67-68-5	溶剂
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
对羟基苯甲酸甲酯	Himedia	GRM1291	抗真菌剂
多种维生素胶囊	GalaxoSmithKline	NA	维生素来源
槲皮素	Sigma	Q4951-10G	植物化学物质
山梨酸	Himedia	M1880	抗菌剂
链霉素	Himedia	CMS220	抗生素
维生素E胶囊	Nukind Healthcare	NA	维生素E来源
酵母提取物	Himedia	RM027	氨基酸来源