开发一种用于评估植物化学物质对 Helicoverpa armigera 的杀虫作用的摄食试验系统

Summary

该方案描述了专性摄食测定法，以评估植物化学物质对鳞翅目昆虫幼虫的潜在毒性作用。这是一种高度可扩展的昆虫生物测定法，易于优化亚致死剂量和致死剂量、威慑活性和生理效应。这可用于筛选环保杀虫剂。

Abstract

Helicoverpa armigera是一种鳞翅目昆虫，是一种分布于全球的多食性害虫。这种草食性昆虫对植物和农业生产力构成威胁。作为回应，植物会产生几种植物化学物质，对昆虫的生长和生存产生负面影响。该方案展示了一种专性摄食测定方法，用于评估植物化学物质（槲皮素）对昆虫生长，发育和生存的影响。在受控条件下，新生儿在预定的人工饮食中维持到第二龄。这些二龄幼虫被允许以对照和含有槲皮素的人工饮食为食 10 天。隔天记录昆虫的体重、发育阶段、体重和死亡率。在整个测定过程中评估体重的变化、喂养模式的差异和发育表型。 所描述的强制性摄食测定模拟了自然的摄入模式，并且可以放大到大量昆虫。它允许人们分析植物化学物质对 H. armigera 的生长动态、发育过渡和整体适应性的影响。此外，该设置还可用于评估营养参数和消化生理过程的改变。本文提供了一种详细的喂养测定系统方法，该方法可能适用于毒理学研究、杀虫分子筛选以及了解植物-昆虫相互作用中的化学效应。

Introduction

影响作物生产力的生物因子主要是病原体和害虫。一些害虫造成 15% 至 35% 的农作物损失，并影响经济可持续性^{实践 1}.属于鞘翅目、半翅目和鳞翅目昆虫的昆虫是毁灭性害虫的主要目。环境的高度适应性使鳞翅目动物进化出几种生存机制。在鳞翅目昆虫中，棉铃虫（Helicoverpa armigera）可以以大约 180 种不同的作物为食，并对其生殖组织造成重大损害²。在世界范围内，阿米格拉嗜血杆菌的侵扰已造成约 50 亿美元的损失³.棉花、鹰嘴豆、木豆、西红柿、向日葵和其他作物是 H. armigera 的宿主。它在寄主植物的不同部分完成其生命周期。雌性飞蛾产下的卵在叶子上孵化，然后在幼虫阶段以营养组织为食。幼虫阶段由于其贪婪和高度适应性而最具破坏性 ^4,5。由于其显著的属性，如多噬性、优异的迁徙能力、更高的繁殖力、强烈的滞育性以及对现有昆虫防治策略的抗性的出现^，H. armigera显示出全球分布和对新领土的侵占6。

来自萜烯、类黄酮、生物碱、多酚、氰基葡糖苷等多种化学分子被广泛用于控制阿米氏嗜血杆<....

Protocol

H. armigera 幼虫购自印度班加罗尔的ICAR-国家农业昆虫资源局（NBAIR）。本研究共使用了21只二龄幼虫。

1. 鹰嘴豆人工饲料的制备

注: 表1中提到了制备人工饮食所需的成分清单。

1. 如 表1所示，在烧杯中分别称量所有馏分，并使用刮刀/磁力搅拌器制备均匀的混合物。
2. 使用微波炉在100°C左右煮沸馏分C5分钟，加入馏分A中，并充分混合。
3. 充分混合后，让混合的馏分稍微冷却，然后再加入馏分 B（馏分 B 含有热不稳定成分）。
4. 倒入透明聚苯乙烯 150 mm x 150 mm 培养皿中。

2.含槲皮素人工饮食的制备

1. 称取适量 （1,000 ppm） 的槲皮素水合物（参见 材料表），并将其适当溶解到最小体积的有机溶剂中，例如乙醇 （2 mg/mL）、二甲基亚砜 （DMSO; 30 mg/mL） 或二甲基甲酰胺 （DMF）。在这里，DMSO用于溶解槲皮素。
2. 将溶解的槲皮素加入馏分B中，然后加入馏分A和C的混合物中（从馏分B中还原的水体积等于添加的DM....

Results

与对照组相比，以含有1,000ppm槲皮素的饮食喂养的昆虫幼虫的体重显着降低~57%（图2A）。体重的减轻导致槲皮素处理的幼虫的体型减小（图2B）。与对照组相比，槲皮素喂养的幼虫的摄食率显着降低（图2C）。

此外，以槲皮素为食的幼虫的化蛹率下降了~14%，化蛹延迟，表明治疗后发育迟缓（图3A，B）。此外，在以含槲皮素的饮食喂养的昆虫幼虫中观察到~77.65%的存活和致死表型（图4A，B）。根据食物的消耗和利用，计算对照和槲皮素喂养的幼虫的营养参数（补充表1）。以 1,000 ppm 含槲皮素的饮食喂养的昆虫对身体物质的 ECI 和 ECD 分别降低了 ~9% 和 ~49%。ECD的降低可.......

Discussion

实验室生物测定有助于预测结果，并在短时间内以合理的成本生成几种化合物的比较毒性数据。摄食生物测定有助于解释昆虫-杀虫剂和昆虫-植物-杀虫剂之间的相互作用。它是一种测量各种物质毒性的有效方法，大大简化了确定致死剂量50（LD₅₀）、致死浓度50（LC₅₀）或任何其他致死浓度或剂量^24,25的过程。各种实验室生物测定用于确定杀虫活性、杀虫剂耐药性和化合物的毒性，包括饮食覆盖、局部应用、专性喂养、注射方法、接触或残留以及薄膜方法^13,14。所有这些方法都可以根据特定研究的目的使用，但是理想的生物测定方法应该是快速有效的²⁶。因此，除吸吮昆虫外，本手稿中讨论的专性摄食测定方法在几种情况下可以成为首选的生物测定方法。

本手稿中描述的专性摄食测定可用于研究任何化合物对昆虫.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂	琼脂 Himedia	RM666	固化剂
抗坏血酸	Himedia	CMS1014	维生素 C 来源
孟加拉革兰	NA	NA	蛋白质和碳水化合物来源
酪蛋白	Sigma	C-5890	蛋白质来源
胆固醇	Sisco 研究实验室	34811	脂肪酸来源
氯化胆	Himedia	GRM6824	铵盐
DMSO	Sigma	67-68-5	溶剂
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
对羟基苯甲酸甲酯	Himedia	GRM1291	抗真菌剂
多种维生素胶囊	GalaxoSmithKline	NA	维生素来源
槲皮素	Sigma	Q4951-10G	植物化学
山梨酸	Himedia	M1880	抗微生物剂
链霉素	Himedia	CMS220	抗生素
维生素 E 胶囊	Nukind Healthcare	NA	维生素 E 来源
酵母提取物	Himedia	RM027	氨基酸来源