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方法文章

小鼠视动反射视觉特征选择性的量化

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DOI：

10.3791/65281

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2023年6月23日

 , 
1Department of Biology, University of Toronto Mississauga, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

本文内容

摘要

本文介绍了一种量化视动反射的标准实验方案。该方法结合了虚拟转鼓刺激与视频眼动记录技术，从而能够精确评估该行为的特征选择性及其适应性可塑性。

摘要

视动反射（OKR）是一种由视觉环境整体运动所引发的重要先天性眼动反应，其功能是稳定视网膜上的图像。由于该反射具有重要生理意义且反应稳定，因此已被广泛用于研究视觉-运动学习过程，并评估具有不同遗传背景、年龄或经药物处理的小鼠的视觉功能。本文介绍一种高精度评估头部固定小鼠视动反射反应的方法。头部固定可排除前庭刺激对眼动的干扰，从而能够单独测量由视觉运动所引发的眼动反应。视动反射由一个虚拟圆筒系统诱发，该系统通过三台计算机显示器呈现垂直光栅，以恒定速度进行水平方向的振荡式或单向漂移。利用该虚拟现实系统，我们可以系统性地改变空间频率、时间/振荡频率、对比度、亮度以及光栅移动方向等视觉参数，并量化视觉特征选择性的调谐曲线。高速红外视频眼动记录技术可精确测量眼动轨迹。通过对单个小鼠眼睛进行校准，可实现对不同年龄、性别及遗传背景动物之间视动反射的比较。该技术的定量分析能力使其能够检测视动反射在老化、感觉经验或运动学习过程中发生可塑性适应时的变化，因此成为研究眼动行为可塑性的重要工具之一。

引言

面对环境中视觉刺激时，我们的眼睛会通过运动来转移视线、稳定视网膜图像、追踪移动目标，或将双眼的中央凹对准位于不同距离的观察目标，这些功能对正常视觉至关重要1,2。眼动行为因其系统结构相对简单，长期以来被广泛用作研究健康与疾病状态下感觉-运动整合神经环路的理想模型3。眼球在眼眶内的转动主要由三对眼外肌控制，其运动主要围绕三个相应轴进行：沿横轴的上转与下转、沿垂直轴的内收与外展，以及沿前后轴的内旋与外旋1,2。这种结构简单的系统使研究人员能够在实验室环境中方便而准确地评估小鼠的眼动行为。

一种重要的眼动行为是视动反射（optokinetic reflex, OKR）。这种不自主的眼动由视网膜上图像的缓慢漂移或滑动所引发，可在动物头部或周围环境运动时起到稳定视网膜图像的作用。2,4. 作为一种行为范式，视动反射（OKR）因其多个特点而引起研究人员的兴趣。首先，它能够被可靠地诱发，并可进行精确的量化5,6其次，量化该行为的步骤相对简单且标准化，可应用于评估大量动物群体的视觉功能。7第三，这种先天行为具有高度可塑性5,8,9其幅度在长时间重复发生视网膜滑移时可被增强5,8,9，或当其工作伙伴前庭眼反射（VOR）——另一种由前庭输入触发的稳定视网膜图像的机制——出现问题时2，存在损伤5这些OKR增强的实验范式使研究人员能够揭示眼动学习背后的神经环路基础。

在以往的研究中，主要采用两种非侵入性方法来评估视动反射（OKR）：（1）结合物理转鼓的视频眼动图技术7,10,11,12,13，或（2）结合虚拟转鼓的任意头部转动判定方法6,14,15,16。尽管这些方法在揭示眼动可塑性的分子与环路机制方面取得了丰硕成果，但各自仍存在一些局限性，限制了其对OKR特性的定量分析能力。首先，带有印刷黑白条纹或斑点图案的物理转鼓难以快速、灵活地更换视觉刺激模式，这在很大程度上限制了对OKR依赖特定视觉特征（如移动光栅的空间频率、方向和对比度）的测量能力8,17。相比之下，采用计算机化视觉刺激的虚拟显示系统可方便地在每次试验中调整视觉特征，从而有利于研究OKR对这些特征的选择性。通过这种方式，研究人员可在多维视觉参数空间中系统地考察OKR行为。此外，第二种OKR检测方法仅报告能够引发可识别OKR的视觉参数阈值，而无法获取眼球或头部运动的幅度信息6, 14,15,16。这种定量能力的缺失使得无法分析调谐曲线的形态及偏好视觉特征，也难以检测正常或病理状态下个体小鼠之间的细微差异。为克服上述局限，近期研究已将视频眼动图技术与计算机化的虚拟视觉刺激相结合，用于检测OKR行为5,17,18,19,20。然而，这些已发表的研究未提供足够的技术细节或分步操作指南，因此研究人员仍难以建立适用于自身研究的OKR检测系统。

本文介绍了一种在明视觉或暗视觉条件下，结合视频眼动图与计算机化虚拟视觉刺激，精确量化小鼠视动性眼震（OKR）行为视觉特征选择性的实验方案。通过固定小鼠头部，避免前庭刺激引发的眼动干扰。使用高速摄像机记录小鼠观察具有动态变化视觉参数的移动光栅时的眼球运动。对每只小鼠眼球的物理尺寸进行校准，以确保准确推算眼动角度21。该定量方法可用于比较不同年龄、不同遗传背景小鼠之间的OKR行为，或监测药物干预及视觉-运动学习所引起的行为变化。

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方案

本研究中进行的所有实验程序均经生物科学本地动物护理委员会批准，符合多伦多大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会制定的指南。

1. 在颅骨顶部植入头杆

注意：为避免前庭眼反射（VOR）行为对眼动的干扰，在进行OKR测试期间需固定小鼠头部。因此，需通过手术将头杆植入颅骨顶部。

  1. 将一只小鼠（2-5月龄雌性或雄性C57BL/6）置于含有4%异氟烷（v/v）与O2混合气体的麻醉舱中进行麻醉。将小鼠转移至定制的手术平台，并将异氟烷浓度降低至1.5%-2%。在整个手术过程中通过检测脚趾夹捏反应和呼吸频率来监测麻醉深度。
  2. 在动物身体下方放置加热垫以维持其体温。在双眼上涂抹一层润滑性眼膏以防止角膜干燥，并用铝箔覆盖眼睛以避免光照刺激。
  3. 皮下注射卡洛芬，剂量为20 mg/kg，以减轻疼痛。用氯己定葡萄糖酸盐皮肤清洁剂润湿毛发后，剃除颅骨顶部的毛发。用70%异丙醇和氯己定酒精对暴露的头皮进行两次消毒。
  4. 在切口部位皮下注射布比卡因（8 mg/kg），然后用剪刀去除头皮（约1 cm2），暴露颅骨背侧表面，包括后额骨、顶骨和顶间骨。
  5. 在暴露的颅骨上滴加数滴1%利多卡因与1:100,000肾上腺素混合液，以减轻局部疼痛和出血。使用Meyhoefer刮匙刮除颅骨表面筋膜，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗干净。
    注：分离颞肌与颅骨以增加头杆附着的表面积。
  6. 用压缩空气轻轻吹向颅骨表面，直至完全干燥，骨面呈现灰白色。在暴露的颅骨表面（包括切口边缘的头皮）涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，随后覆盖一层丙烯酸树脂。
    注：在使用氰基丙烯酸酯胶水前，颅骨表面必须无血液或水分。
  7. 将不锈钢头杆（见图1A）沿颅骨中线放置于顶部。从头杆边缘开始逐步添加更多丙烯酸树脂，直至头杆基部完全嵌入树脂中。重复涂抹2至3次以增加树脂厚度。
  8. 等待约15分钟，直至丙烯酸树脂完全硬化。皮下注射1 mL乳酸林格氏液，然后将小鼠放回置于加热垫上的笼子中，直至其完全恢复活动能力。
  9. 术后让小鼠在饲养笼中至少恢复5天。待动物状态良好后，在OKR实验装置中通过头杆固定其头部，持续15-30分钟，使其熟悉头部固定及实验环境。每天重复该适应过程，至少连续进行3天。

2. 虚拟鼓和视频眼动图的设置

  1. 将三台显示器相互垂直安装，形成一个覆盖视觉空间约270°方位角和63°仰角的方形围合结构（图1B 左）。
  2. 使用独立显卡将三台显示器合并为一个单一显示单元，以确保所有显示器之间的同步。
  3. 按照以下步骤校准显示器的亮度：
    1. 开启连接显示器的计算机，并等待15分钟。预热对于获得稳定的亮度至关重要。
    2. 系统性地以25为步长，将显示器的亮度设置从0调整至100。
    3. 针对每个亮度值，使用亮度计在不同像素值（0–255，步长为15）下测量显示器的亮度。
    4. 对像素值255的亮度与亮度设置之间的关系进行线性回归拟合，并估算出产生160 cd/m2亮度的亮度设置值。
    5. 对于亮度测量中使用的每个像素值（步骤2.3.3），基于线性回归，估算在步骤2.3.4中得出的亮度设置值下的对应亮度值。使用幂函数 lum = A * pixelγ 拟合新一组亮度值（在步骤2.3.4得出的亮度设置下）与其对应像素值之间的关系，以确定伽马因子γ和系数A。这些参数将用于生成具有目标亮度值的正弦光栅。
    6. 将三台显示器的亮度均设置为步骤2.3.4中计算出的值，以确保相同像素值下各显示器的亮度一致。
  4. 使用视觉刺激工具包生成一个用于诱发OKR行为的虚拟鼓，具体步骤如下：
    1. 在显示器上呈现垂直的正弦光栅，并沿方位角调整条纹间距，确保光栅在眼睛上的投影具有恒定的空间频率（鼓状光栅；图1B 中和右）。
    2. 确保动物头部固定于围合结构中心，使其所见的光栅在整个虚拟鼓表面具有恒定的空间频率。
    3. 在视觉刺激代码中修改运动光栅的参数，如振荡幅度、空间频率、时间/振荡频率、方向、对比度等。使用两种类型的视觉运动：（1）光栅按照正弦函数以振荡方式顺时针或逆时针漂移：
      波动方程，鼓位置 = 振幅 × sin(2π × f × t)，用于谐波运动分析。
      其中，Amp为鼓轨迹的振幅，f为振荡频率，t为时间（振荡幅度：5°；光栅空间频率：0.04–0.45 cpd；振荡频率：0.1–0.8 Hz，对应刺激峰值速度为3.14–25.12 °/s [鼓速度 = Amp × 2π × f × cos(2π × f × t)]；对比度：80%–100%；平均亮度：35–45 cd/m2）；（2）光栅以恒定速度单向漂移：
      鼓位置公式：鼓位置 = 速度 × 时间；用于运动学分析。
      （空间频率：0.04–0.64 cpd；时间频率：0.25–1 Hz；鼓速度 = 时间频率 / 空间频率）。
  5. 按照以下步骤设置视频眼动记录系统：
    1. 为避免遮挡动物的视野，将一块红外（IR）镜放置在距中线60°的位置，以形成右眼的图像。
    2. 将一个红外（IR）相机放置在小鼠右侧后方（图1C 左），用于捕捉右眼图像。
    3. 将高速红外相机安装在相机臂上，使相机能够围绕右眼成像点旋转±10°（图1C 右）。
    4. 使用附着在其中一个显示器上的光电二极管提供电信号，以同步视频眼动记录与视觉刺激的时间。
    5. 在右眼周围使用可调蛇形臂支撑四个红外发光二极管（LED），为眼睛提供红外照明。
    6. 在相机上放置两个红外LED以提供角膜反射（CR）参考点：一个固定在相机上方（X-CR），另一个位于相机左侧（Y-CR；图1D）。
    7. 使用校准载玻片测量视频眼动记录系统的光学放大倍率。
      注：参考角膜反射点用于在基于旋转眼动计算眼角度时消除平移眼动的影响。
  6. 将动物头部固定在显示器构成的围合结构中心，具体步骤如下：
    1. 使用头固定板将动物头部固定在装置中心，并使其正对前方。调整头部倾斜角度，使左右眼处于同一水平，且眼睛的鼻侧和颞侧眼角水平对齐（图1E）。
    2. 通过头固定装置提供的粗调和二维平移台提供的微调进行水平方向调整，通过头固定装置及支柱/支柱夹具组合进行垂直方向调整，直至动物右眼出现在相机的实时视频中。在进行眼动校准和测量之前，将热反射镜反射的动物右眼图像与相机臂的旋转支点重合（详见步骤3.4）。
  7. 在OKR装置周围构建一个定制的遮光 enclosure，以屏蔽室内光线（图1F）。

3. 眼动校准

注意：旋转性眼球运动是根据瞳孔运动以及瞳孔运动轨迹的半径（Rp，即瞳孔中心到眼球中心的距离）来计算的。对于每只小鼠，该半径均通过实验测量得到21。

  1. 按照步骤 2.6.1 中所述，将动物的头部固定在由三台显示器构成的围栏中心位置。
  2. 打开摄像机，并调节围绕右眼的四个 LED，以实现均匀的红外照明。
  3. 在视觉引导下，调整右眼的位置，使其出现在视频画面的中央，具体操作如步骤 2.6.2 所述。
  4. 将右眼的虚拟图像与摄像机臂的旋转支点对齐，具体方法如下：
    1. 手动将摄像机臂向左旋转至极限位置（-10°）。在垂直于光轴的水平面上，通过微调二维平移台（图 1C，绿色箭头）手动移动动物右眼的位置，直到 X-CR 位于图像的水平中心。
    2. 手动将摄像机臂旋转至另一端（+10°）。如果 X-CR 偏离图像中心，则沿光轴方向微调右眼位置，直至 X-CR 回到中心（图 1C，蓝色箭头）。
    3. 重复步骤 3.4.1–3.4.2 数次，直到摄像机臂左右摆动时 X-CR 始终保持在图像中心。若在某次重复过程中右眼发生移动，则需重新开始调整过程。
  5. 将摄像机臂锁定在中心位置后，测量 Y-CR 与 X-CR 之间的垂直距离。打开 Y-CR LED，记录其在视频中的位置，然后切换至 X-CR LED 并记录其位置。
    注：在仅开启 X-CR LED 的眼动测量过程中，Y-CR 与 X-CR 之间的垂直距离将用于推导 Y-CR 的位置。
  6. 测量瞳孔旋转半径 Rp，具体方法如下：
    1. 将摄像机臂旋转至左端（-10°），并在视频中记录瞳孔（Pp1）和 X-CR（PCR1）的位置。
    2. 然后将摄像机臂旋转至右端（+10°），并在视频中记录瞳孔（Pp2）和 X-CR（PCR2）的位置。重复此步骤多次。
      注：每次重复过程中，动物的右眼必须保持静止，以确保视频中瞳孔的移动量准确反映摄像机臂摆动的角度。
    3. 根据上述记录的数据，使用以下公式计算瞳孔旋转半径 Rp（图 2A）：
      用于图示力学分析的静力平衡方程 \( R_p \)；\( \sin 10^\circ \) 角度。
      注：物理空间中角膜反射点与瞳孔中心之间的距离，基于其在视频中的像素距离计算：
      PCR - Pp = 视频中的像素数 × 相机芯片的像素尺寸 × 放大倍数
  7. 建立 Rp 与瞳孔直径之间的关系，具体方法如下。当瞳孔扩张或收缩时，Rp 会发生变化；近似而言，其值与瞳孔大小成反比（图 2B 上图）。
    1. 系统性地将显示器的亮度从 0 调节至 160 cd/m2，以控制瞳孔大小。
    2. 对每个亮度值，重复步骤 3.6 八到十次，并记录瞳孔直径。
    3. 基于上述测得的数据，对 Rp 与瞳孔直径之间的关系进行线性回归，以确定斜率和截距（图 2B 下图）。
      注：在进行线性拟合前，需剔除由偶然眼动引起的数据异常值。对于同一动物在多个实验阶段中的重复测量，除非其眼睛在实验过程中明显长大，否则只需校准一次。

4. 记录OKR的眼动

  1. 按照步骤 3.1–3.4 将小鼠固定在装置中。如果记录在完成校准后立即进行，则跳过此步骤。将相机臂锁定在中央位置。
  2. 按照以下说明设置显示器和动物以进行暗视 OKR 测试。对于明视 OKR 测试，请跳过此步骤。
    1. 使用定制滤光片覆盖每个显示器的屏幕，该滤光片由五层 1.2 中性密度（ND）膜组成。确保滤光片与显示器之间无间隙漏光。
    2. 关闭室内光源。后续步骤需在红外护目镜辅助下完成。
    3. 向右眼滴加一滴匹罗卡品溶液（2% 生理盐水溶液），等待 15 分钟。确保药液保留在眼球表面，未被小鼠擦除。若药液被动物擦去，请再次滴加一滴匹罗卡品溶液。此操作可将瞳孔缩小至适合在暗视条件下进行眼动追踪的大小。
      注：在暗视条件下，瞳孔会显著扩张，导致其边缘部分被眼睑遮挡，从而影响视频眼动仪对瞳孔中心位置的精确估计。通过药物缩小右眼瞳孔可降低其视觉输入，因此视觉刺激将呈现于左眼。
    4. 用生理盐水冲洗右眼，彻底清除匹罗卡品溶液。拉下遮光帘，完全封闭测试腔体，防止杂散光干扰暗视觉。
    5. 在开始 OKR 测试前，给予动物 5 分钟时间以充分适应暗视环境。
  3. 运行视觉刺激软件和眼动追踪软件。对于明视 OKR 测量，确保圆筒光栅以正弦轨迹水平振荡；对于暗视 OKR 测量，确保圆筒光栅以恒定速度从左向右漂移，即相对于左眼的颞侧向鼻侧方向。
    注：在暗视条件下，若仅右眼瞳孔因匹罗卡品作用而缩小，则振荡性圆筒刺激诱发的 OKR 反应高度不对称。因此，在暗视 OKR 测量中，刺激左眼并监测右眼的运动。
  4. 眼动追踪软件自动测量每帧图像中的瞳孔大小、角膜反射（CR）位置和瞳孔位置，并根据以下公式计算眼球位置角度（图 2C）：
    角度 α 的反正弦方程，包含压力项 P_CR、P_p1 和半径 R_P，公式图示。
    其中，PCR 为角膜反射位置，Pp 为瞳孔位置，Rp 为瞳孔旋转半径。物理空间中角膜反射与瞳孔中心之间的距离根据视频中的像素距离计算：
    PCR - Pp = 视频中的像素数 × 相机芯片像素尺寸 × 放大倍数
    对应瞳孔大小的 Rp 值基于步骤 3.7.3 中的线性回归模型得出（图 2B 底部）。

5. 使用眼动分析软件对OKR眼动进行分析

  1. 使用中值滤波器（滤波窗口 = 0.05 s）处理眼动轨迹，以去除高频噪声（图3A 中图）。
  2. 按以下方法去除扫视或眼球震颤：
    1. 通过计算眼动的一阶导数来估计眼动速度（图3A 下图）。应用50 °/s的速度阈值来识别扫视或眼球震颤（图3A 下图）。
    2. 基于线性回归，利用扫视或眼球震颤前的眼动位置段向外推算快速眼动期间的眼位，以替代扫视或眼球震颤（图3B）。
  3. 若转鼓光栅振荡，则通过快速傅里叶变换（Goertzel算法）计算OKR眼动的振幅（图3C）；若转鼓光栅以恒定速度单向运动，则计算视觉刺激期间眼动的平均速度（图3B 下图）。
    注意：由傅里叶变换得出的振荡性眼动振幅与通过正弦函数拟合眼动轨迹所得的振幅相似（图3D）。
  4. 计算OKR增益。对于振荡性转鼓运动，OKR增益定义为眼动振幅与转鼓运动振幅的比值（图3C 右图）；对于单向转鼓运动，OKR增益定义为眼动速度与转鼓光栅速度的比值（图3B 下图）。

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结果

通过上述详细步骤，我们评估了视动眼震（OKR）对多种视觉特征的依赖性。此处所示的示例轨迹数据是使用补充代码文件1中提供的分析代码生成的，示例轨迹的原始数据文件可在补充代码文件2中找到。当圆筒光栅以正弦轨迹（0.4 Hz）移动时，动物的眼球会自动以类似的振荡方式跟随光栅运动（图3B 上图），这是OKR行为的典型特征2,5,8。通过快速傅里叶变换（FFT）计算得出水平方向OKR眼动的振幅（图3C&D），OKR增益则定义为眼动振幅与光栅运动振幅的比值（图3C）。OKR增益随空间频率、振荡频率以及光栅运动方向的变化而变化（

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讨论

本文介绍的OKR行为检测方法具有多项优势。首先，计算机生成的视觉刺激解决了物理转鼓固有的问题。针对物理转鼓无法系统性地检测空间频率、运动方向或对比度调谐这一缺陷8，虚拟转鼓可在每次试验中灵活调整这些视觉参数，从而促进对OKR行为特征选择性的系统性与定量分析（图4A）；而物理转鼓因外部光源照射导致光照不均匀23，虚拟转鼓则可在整个表面提供均匀的亮度；借助中性密度滤光片（ND滤光片）和亮度计，计算机生成的视觉刺激可实现从暗视觉到明视觉范围内多个精确控制的亮度水平下的OKR测量（图4B），这在物理转鼓上难以实现。由于不受物理转鼓因惯性质量导致的加速度限制，虚拟视觉刺激可实现理想精确的运动轨迹，尤其在高加速度和高速度条件下表现更佳。此外，计算机生成的视觉刺激还支持其他类型视觉刺激的创造性设计，例如相干运动的光点，有助于研究多种眼动行为的神经机制。其次，我们的实验流程标准化，几乎无需人工监控行为记录的进展，从而可同时检测多只小鼠，适用...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢 Yingtian He 分享方向调谐数据。本研究得到了加拿大创新基金会和安大略省研究基金（CFI/ORF 项目编号 37597）、自然科学与工程研究理事会（NSERC，RGPIN-2019-06479）、加拿大健康研究院（CIHR，项目资助 437007）以及康诺特新研究员奖的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二维平移台ThorlabsXYT1
丙烯酸树脂Lang DentalB1356用于将头固定板固定在颅骨上并保护颅骨
布比卡因STERIMAXST-BX223布比卡因注射液 BP 0.5%。局部麻醉
卡洛芬RIMADYL8507-14-1镇痛
压缩空气Dust-Off
眼膏AlconSystane用于保持眼睛湿润
显卡NVIDIAGeforce GTX 1650 或 Quadro P620用于在三个显示器之间生成单个屏幕
加热垫Kent ScientificHTP-1500用于维持体温
高速红外（IR）相机Teledyne DalsaG3-GM12-M0640用于记录眼球旋转
红外LEDDigikeyPDI-E803-ND用于角膜反射参考及眼部照明
红外镜Edmund optics64-471用于反射眼部图像
异氟烷FRESENIUS KABICP0406V2
LabviewNational instruments版本 2014眼动追踪
乳酸林格液BAXTERJB2324提供水分和能量
利多卡因与肾上腺素混合液Dentsply Sirona82215-1利多卡因。局部麻醉
亮度计Konica MinoltaLS-150用于显示器校准
MatlabMathWorks版本 xxx眼动分析
梅霍弗刮匙World Precision Instruments501773用于刮除颅骨及去除筋膜
显微镜校准载玻片AmscopeMR095用于测量视频眼动图的放大倍数
显示器Acer B247W视觉刺激
中性密度滤光片Lee filters299用于生成暗视觉条件下的视觉刺激
夜视镜Alpha opticsAO-3277用于暗视觉OKR实验
光电二极管DigikeyTSL254-R-LF-ND用于同步视觉刺激与视频眼动记录
盐酸毛果芸香碱Sigma-AldrichP6503
支架杆ThorlabsTR1.5
支架夹持器ThorlabsPH1
PsychoPy开源软件版本 xxx视觉刺激工具包
剪刀RWDS12003-09用于去除皮肤
超级胶水Krazy Glue类型：通用型。用于将头固定板粘附在颅骨上

参考文献

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