方法文章

利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（ChIP）分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的跨代表观遗传

DOI：

10.3791/65285

⸱

2023年5月5日

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种RNA干扰和染色质免疫沉淀实验，用于研究RNA干扰诱导的沉默及其相关染色质修饰在C. elegans中的表观遗传遗传。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

跨代表观遗传（TEI）能够在不改变基因组序列的情况下，通过非编码RNA和染色质修饰等因素实现遗传信息经由生殖系的传递。在线虫Caenorhabditis elegans中，RNA干扰（RNAi）的遗传现象是研究TEI的有效模型，该模型充分利用了该模式生物生命周期短、可自我繁殖以及身体透明等优势。在RNAi遗传过程中，动物暴露于RNAi后，其靶基因位点会发生基因沉默以及染色质特征的改变，且这些变化可在初始诱导因子消失后持续多个世代。本实验方案描述了利用生殖系表达的核定位绿色荧光蛋白（GFP）报告基因来分析C. elegans中RNAi遗传的方法。通过喂食表达靶向GFP的双链RNA的细菌，启动报告基因的沉默。在每一代中，动物均需传代以维持发育同步，并通过显微镜观察确定报告基因的沉默状态。在特定世代，收集群体并进行染色质免疫沉淀（ChIP）-定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，以检测GFP报告基因位点处组蛋白修饰的富集水平。本研究RNAi遗传的实验方案易于修改，并可与其他分析方法结合，进一步探究小RNA和染色质通路中的TEI相关因子。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表观遗传继承使得基因调控信息能够在世代之间传递，因此亲代所处的环境或经历可能影响其后代。在 C. elegans 中，由外源双链 RNA（dsRNA）引发的生殖系基因沉默可在未暴露于原始触发因素的后代中持续传递多代1,2,3,4。这一过程被称为 RNA 干扰（RNAi）继承，是 C. elegans 中多种相关表观遗传沉默现象之一，其他现象包括由 piRNA 引发的多代沉默2,5、参数突变/RNAe（RNA 诱导的表观遗传沉默）6,7,8，以及由多拷贝阵列引发的沉默9，这些过程在小 RNA 和染色质调控机制的需求上既有重叠又各具特异性。在 C. elegans 的外源 RNAi 过程中，dsRNA 被加工成小干扰 RNA（siRNA），后者与初级 Argonaute 蛋白形成复合物，识别其靶标 mRNA。这种靶向作用会引发次级 siRNA 的扩增，次级 siRNA 与次级 Argonaute 蛋白结合，通过细胞质和细胞核内的沉默通路共同实现对靶标 mRNA 的沉默。对于在生殖系中表达的 RNAi 靶标，核内次级 Argonaute 蛋白 HRDE-1 及其他核内 RNAi 因子可靶向新生转录本，导致转录抑制，并招募组蛋白甲基转移酶沉积抑制性染色质标记，包括 H3K9me310。组蛋白 H3K9me3 有助于通过 RNAi 继承机制建立对生殖系表达的绿色荧光蛋白（GFP）转基因的可遗传沉默11,12。

本实验方案的目的是利用在生殖系中表达GFP-组蛋白融合蛋白的转基因作为报告系统，研究RNA干扰（RNAi）的遗传特性，并通过染色质免疫沉淀结合定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）检测该报告转基因位点组蛋白修饰的变化。本方案描述了一种标准化的基于培养板的RNAi饲喂方法，用于启动报告基因的沉默。同时提供了通过碱性次氯酸盐处理（“漂白”）从成年 gravid 线虫中分离in utero胚胎以实现代际传代的详细时间流程。此外，还介绍了通过荧光显微镜监测群体中部分个体GFP沉默频率的方法及组蛋白H3K9me3的ChIP-qPCR代表性数据。基于报告基因的RNAi遗传实验为功能解析遗传和环境因素在表观遗传调控中的作用提供了一个高度可行的研究体系13,14，利用此类报告系统开展的遗传筛选已鉴定出若干在跨代表观遗传持续时间中起必需作用的基因2,3,15，以及负向调控该过程的基因16,17。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：实验时间线见图1。

1. RNAi 线虫生长培养基（RNAi-NGM）平板的制备

  1. 从甘油菌种中挑取含有GFP或对照RNAi载体的 E. coli HT115(DE3) 菌株，划线接种于添加了100 µg/mL 氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB) 琼脂平板上。在37 °C条件下培养过夜。
  2. 次日，按照标准方案18制备RNAi-NGM平板（含1.7% [w/v] 琼脂、0.3% [w/v] NaCl、0.25% [w/v] 蛋白胨、1 mM CaCl2、5 µg/mL 胆固醇、25 mM 磷酸钾缓冲液 [pH 6.0]、1 mM MgSO4、25 µg/mL 羧苄青霉素和5 mM 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷 [IPTG]）。
    1. 针对实验中的每个菌株，至少准备六块接种了GFP RNAi的RNAi-NGM平板（每个生物学重复两块，共三个生物学重复），以及两块接种了对照RNAi的RNAi-NGM平板（一个生物学重复）。
    2. 用铝箔 loosely 覆盖平板以避光，并在室温下放置过夜使其干燥。
  3. 在倾注RNAi-NGM平板的同一天，准备4 mL的RNAi细菌液体培养物。
    1. 在无菌条件下，将添加了10 µg/mL 四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基4 mL分装至培养管中。从LB琼脂平板上挑取单菌落接种至各管中，在37 °C下振荡培养约16小时过夜。
  4. 将RNAi细菌接种至RNAi-NGM平板上。
    1. 过夜培养后，使用LB液体培养基将菌液按1:5比例稀释，测定其光密度（OD600）。
    2. 用添加了10 µg/mL 四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基将RNAi细菌稀释至相对OD600为2。
    3. 在无菌条件下，向每块RNAi-NGM平板上加入150 µL的对照或GFP RNAi细菌液。
    4. 用铝箔覆盖平板，于室温下静置培养至少24小时后使用。
      ​注意：未使用的RNAi-NGM平板可在黑暗、密封容器中倒置保存，于4 °C保存最多1周。

2. 启动RNAi遗传实验：对P0代胚胎进行漂白和铺板

注意：在开始 RNAi 遗传实验之前，应将携带 GFP 报告基因 mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 的线虫在 21 °C 下无饥饿培养至少两代。

  1. 在开始RNAi遗传实验前4天（96小时）（图1），将三到四只产卵期成虫挑至每个接种了OP50-1细菌的35 mm标准NGM平板上。
    注意：每种品系准备三个NGM平板即可。对于繁殖能力受损的品系，每个平板可能需要超过四只动物。
  2. 4天后，确保成虫群体已开始在平板上产下胚胎。使用800 µL添加了Triton X-100（TX-100）的M9缓冲液（22 mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，86 mM NaCl，1 mM MgSO4，0.01% (v/v) TX-100）将线虫从平板上冲洗至1.5 mL离心管中。重复冲洗一次，并将洗液合并至同一离心管中。
  3. 通过漂白法从群体中分离胚胎，步骤如下：
    1. 按1.5:1的体积比配制漂白液，其中包含漂白剂（6%次氯酸钠）和10 N NaOH。每份样品需使用250 µL，应准备足量漂白液以满足实验需求。
    2. 将含有线虫的1.5 mL离心管在1,000 × g条件下离心1.5–2分钟。
    3. 吸除上清液，保留约100 µL，注意不要扰动底部的线虫“沉淀”。或者，也可将离心管静置约2分钟，待线虫自然沉降后再吸除上清液。
    4. 向每管中加入650 µL ddH2O，使最终体积达到750 µL。
      注意：以下步骤对时间敏感。
    5. 向每管中加入250 µL漂白液，并立即启动计时器。
    6. 每隔1–2分钟彻底涡旋混匀一次。5分钟后，在体视显微镜下检查线虫，观察成虫降解情况。
    7. 持续涡旋，直至成虫完全溶解，仅剩胚胎为止。立即在1,000 × g条件下离心1.5分钟。
      注意：漂白过程通常在6–7分钟内完成，但应在体视显微镜下以足够放大倍数（40×）监测，以便观察释放出的胚胎。切勿让线虫在漂白液中停留过久，否则会影响胚胎活性。
    8. 离心后，吸除上清液，保留约50–100 µL。加入1 mL含TX-100的M9缓冲液，通过涡旋混匀进行洗涤。再次在1,000 × g条件下离心1.5–2分钟，并至少重复洗涤两次。
    9. 最后一次洗涤后，吸除上清液，每管中保留约100 µL。涡旋混匀后，从每管中吸取2 µL液体，重复两次滴加至标记好的载玻片上。使用计数器统计胚胎数量，以估算每微升中的胚胎浓度。
      注意：可使用带有多个磨砂凹槽的载玻片同时计数多个品系的重复样本。计数用载玻片可清洗后重复使用。
  4. 为建立半同步化的种群生长，将含有250个胚胎的悬液混匀后滴加至每个RNAi-NGM平板上。每个重复使用两个平板。待液体完全吸收。
  5. 对于经RNAi处理的P0代，置于21 °C培养4天（96小时）（从胚胎发育至成虫）。不同基因型的发育时间可能有所差异。

秀丽隐杆线虫RNAi实验流程图、GFP表达分析及胚胎分离方法。
图1：RNAi遗传实验示意图。 RNAi-NGM平板制备及RNAi遗传实验设置的建议时间线。在第-4天，挑选成年雌雄同体成虫转移到接种了OP50-1的NGM平板上。4天后，对成年子代进行漂白处理，并将胚胎接种至RNAi-NGM平板上。P0代在21 °C条件下暴露于RNAi环境共4天。当线虫发育至成虫阶段后，每一代均通过漂白传代，并对生殖系GFP表达情况进行重复检测和评分。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 每一代的传代培养及生殖系GFP表达的评分

注意：为便于计分，可使用乙烯基唱片制作带有线性脊状结构的琼脂糖垫，以整齐排列线虫。该方法改编自 Rivera Gomez 和 Schvarzstein19。

  1. 配制1% (w/v) 琼脂糖溶液，将琼脂糖溶解于ddH₂O中2在小型烧瓶中通过微波加热使琼脂糖溶解。加入搅拌子，并用铝箔覆盖。若需重新熔化，请在200 °C加热板上边搅拌边加热琼脂糖。待完全熔化后，将温度降至80 °C。
  2. 用含有TX-100的800 µL M9缓冲液将线虫从NGM平板上冲洗至1.5 mL离心管中。重复清洗平板两次，以彻底去除所有成年 gravid 虫。在体视显微镜下检查平板，确认线虫已高效收集。
  3. 将试管在1,000 x g条件下离心 g 孵育1.5-2分钟，或静置线虫2分钟使其沉降。吸除上清液，保留100 µL，勿扰动线虫沉淀。
  4. 制备用于固定线虫的琼脂糖垫，步骤如下。
    1. 将一滴融化的1% (w/v) 琼脂糖滴加到乙烯基唱片上（如前所述）19使用已折断细端的玻璃巴斯德吸管。
    2. 将载玻片方向调整至记录纸上的线条呈水平或垂直状态，迅速将载玻片放置在琼脂糖液滴上。等待约30秒后，再从记录纸上取下载玻片。
      注意：如果需要对多种基因型进行评分，可以在一张载玻片上制备较大的琼脂糖垫，然后用刀片将其切成两半。
  5. 将线虫固定在琼脂糖垫上。
    1. 在体视显微镜下，向琼脂糖垫上加入约 5 µL 的 5 mM 左旋咪唑溶液。左旋咪唑稀释液应每周新鲜配制。
    2. 轻轻弹击虫体管以混匀，取5-10 µL虫液转移至琼脂糖垫片上。添加时肉眼估算虫数，使每个重复样本中约有40条虫。
    3. 使用睫毛挑针将线虫排成行，以便于观察计分。加盖玻璃盖玻片。
      注意：以这种方式制备的载玻片标本可在干燥前保持数小时。
  6. 在计数玻片前，使用漂白方案（参见步骤 2.3）从剩余成虫中分离胚胎。将 250 个胚胎接种至接种了 OP50-1 的 35 mm NGM 平板上20液体吸收后，将培养板倒置并放回21 °C培养箱中。
  7. 使用配备GFP滤光片的荧光体视显微镜。利用计数器对每个重复样本中载玻片上GFP阳性与GFP阴性线虫的数量进行计数并记录。
    注意：GFP 阳性线虫的生殖系和胚胎中将呈现细胞核 GFP 表达 在子宫内GFP阴性蠕虫的生殖系不会发出荧光，然而，随着GFP在后续世代中逐渐重新表达，荧光可能较微弱。为排除观察到的自发荧光干扰，建议同时制备额外的非转基因蠕虫品系作为对照。
  8. 每4天（96小时）左右在21 °C下通过漂白法传代一次，具体操作如上所述。为方便起见，也可采用每3天与4天交替传代的方案。若采用交替方案，每次较短的3天传代应额外接种约50个胚胎，因为在72小时后胚胎产量可能较低。
    注意：P0 代细胞的传代时间应保持一致，即胚胎铺板后 4 天。

4. ChIP 实验用动物样本的采集

注意：动物数量和操作时间取决于品系、发育阶段、抗原表位以及免疫沉淀（IP）靶点的数量。在下述示例中，收集用于三次免疫沉淀的样品：H3K9me3、组蛋白H3和IgG对照。染色质免疫沉淀（ChIP）方案改编自Askjaer等人的研究21。

  1. 在收集ChIP样品之前，将上一代RNAi遗传实验扩展至额外的三个NGM平板（每个重复至少四个平板），在21 °C下培养4天。
  2. 对成年 gravid 线虫进行漂白处理以分离胚胎（参见步骤2.3）。
  3. 对于每个品系，将约3,500个胚胎接种到14个平板上（每板250个），在21 °C下培养3天，直至发育至年轻成虫阶段。
  4. 用含0.01% (v/v) TX-100的磷酸盐缓冲液（PBS/TX）将线虫洗入1.5 mL离心管中。在1,000 × g下离心2分钟。吸除上清液，并将同一品系的线虫合并至一个离心管中，再用至少1 mL的PBS/TX洗涤三次。
  5. 吸除上清液至剩余体积为1,000 µL，颠倒混匀后，取3 µL样品重复三次计数线虫数量（参见步骤2.3.9）。
  6. 计算线虫浓度，并转移相当于3,000条线虫的体积至新的离心管中，用于甲醛交联。
  7. 确保总体积至少为线虫沉淀体积的10倍。

5. 甲醛交联

注意：操作甲醛时应在通风橱中进行，以避免接触蒸气。

  1. 向含有线虫的试管中加入甲醛（终浓度为1.8%），室温旋转孵育6分钟。
  2. 立即在液氮中冷冻。此步骤可暂停实验，样品可在-80 °C条件下保存。
  3. 将交联样品在室温水浴中解冻3分钟，并在室温下旋转孵育16分钟。
  4. 加入1.25 M甘氨酸，使其终浓度为125 mM，旋转孵育5分钟。
    注意：从此时起直至磁珠洗脱步骤，样品均需置于冰上或4 °C环境中，并使用预冷缓冲液。
  5. 将样品在1,000 × g 条件下离心3分钟。每次用1 mL PBS/TX洗涤，共洗涤3次；再用1 mL重悬缓冲液（150 mM NaCl，50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]，1 mM乙二胺四乙酸[EDTA]，0.01% TX-100，蛋白酶抑制剂[每5 mL加一片]）洗涤2次。
  6. 最后一次洗涤后，保留足够缓冲液，确保总体积至少为沉淀体积的三倍，且最小体积约为100 µL。

6. 超声处理

注意：超声处理参数取决于超声仪的类型和型号以及动物所处的发育阶段。样品体积和浓度、超声开关间隔、循环次数和功率设置等参数需通过实验经验进行优化。例如，在超声处理的时间过程中，通过蛋白质检测监测线虫裂解情况，并确定蛋白浓度达到平台期的时间点。此外，通过电泳检测交联逆转后纯化的DNA，可在1.5%琼脂糖-Tris-乙酸-EDTA（TAE）凝胶上监测基因组DNA的平均剪切片段大小是否达到约200-1,000 bp。

  1. 测量前一步骤中样品的体积。混匀后取 90–120 µL 分装至聚苯乙烯超声破碎管中。
  2. 加入等体积含有 2 倍去垢剂的重悬缓冲液（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA、0.2% 脱氧胆酸钠、0.7% Sarkosyl）。
  3. 在 4 °C 条件下，使用水浴超声仪以 50% 功率超声处理 7 分钟（工作 20 秒，间歇 40 秒）。用移液器轻轻混匀。再重复超声处理 7 分钟。
  4. 将超声处理后的裂解液转移至 1.5 mL 离心管中。加入 0.5 倍体积不含去垢剂的重悬缓冲液（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA）（例如，向 200 µL 样品中加入 100 µL 缓冲液）。
  5. 在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 15 分钟。保留裂解液上清，并转移至新管中。
  6. 可选：进行蛋白质定量分析以确定各裂解液的浓度。此步骤在处理大量样品或进行不同实验间的比较时可能有用。然而，如上所述，通过标准化动物数量即可很好地适用于本文所述的样品量，因为其与通过 qPCR 测定的染色质/DNA 产量具有更好的相关性。

7. 免疫沉淀

注意：根据裂解液体积和浓度调整抗体和磁珠的用量。

  1. 将裂解液上清分为四份：三份等体积的样品用于每次免疫沉淀（IP），其中一份IP体积的10%作为Input（例如，IP #1取100 µL，IP #2取100 µL，IP #3取100 µL，Input取10 µL）。将用于IP的裂解液转移至200 µL PCR管中，将Input裂解液置于1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。
  2. 向相应的IP样品中加入0.5 µg抗H3K9me3抗体、抗组蛋白H3抗体或IgG。4 °C条件下旋转孵育过夜。
  3. 次日，将每份IP所需的9 µL蛋白G包被的磁珠分装至一个1.5 mL离心管中。用1 mL FA-150缓冲液（150 mM NaCl，50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]，1 mM EDTA，1% TX-100，0.1%脱氧胆酸钠）洗涤磁珠两次。
  4. 将磁珠用FA-150缓冲液重悬至步骤7.3中取用的原始体积。向每份IP样品中加入7.5 µL磁珠悬液。4 °C条件下旋转孵育2小时。

8. 洗涤与洗脱

注意：为防止磁珠干燥，在吸除上一次洗涤液后，应迅速加入每次的洗涤缓冲液或洗脱缓冲液。

  1. 每次使用 0.2–1 mL 下列缓冲液洗涤磁珠。将磁珠置于磁力架上以吸除洗涤液。每步洗涤均在 4 °C 下旋转孵育 5 分钟。按以下顺序进行洗涤：
    1. 用 FA-150 洗涤两次。
    2. 用 FA-1M（含 1 M NaCl 的 FA-150）洗涤一次。
    3. 用 FA-0.5M（含 0.5 M NaCl 的 FA-150）洗涤一次。转移至新的 PCR 管中。
    4. 用 TE-LiCl（250 mM LiCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、1% IGEPAL CA-630、1% 脱氧胆酸钠）洗涤一次。
    5. 用 TE+（50 mM NaCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、0.005% IGEPAL CA-630）洗涤两次。
      注意：除非另有说明，后续样品处理均在室温下进行。
  2. 吸除最后一次洗涤缓冲液。将磁珠重悬于 50 µL ChIP 洗脱缓冲液（200 mM NaCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]）中，并转移至 1.5 mL 离心管。
  3. 在恒温混匀仪中于 65 °C 洗脱 15 分钟，每分钟混匀 5 秒，转速为 1,000 rpm。
  4. 将磁珠置于磁力架上，收集上清液并转移至新管中。
  5. 用另外 50 µL ChIP 洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并上清液，总体积为 100 µL。随后进行逆转交联及 DNA 洗脱，具体步骤如下所述。

9. 反向交联和DNA洗脱

  1. 解冻Input裂解液样品，用ChIP洗脱缓冲液补至100 µL。
  2. 向每个IP和Input样品中加入16.5 µg RNase A，37 °C孵育1小时。
  3. 加入40 µg蛋白酶K，55 °C孵育2小时，然后65 °C过夜孵育。
  4. 将样品冷却至室温，用离心柱试剂盒纯化DNA。

10. qPCR 反应体系的配制与运行

注意：引物、反应体系设置和热循环仪参数应根据所用 qPCR 反应试剂盒制造商的建议进行调整。

  1. 制备靶向GFP RNAi报告基因以及H3K9me3阳性与阴性富集对照区域的引物组。引物的熔解温度为60 °C。引物序列见材料表。
  2. 对于Input DNA，进行四次四倍连续稀释（例如1:5、1:20、1:80、1:320）。
    注意：IP DNA可直接使用或进行稀释（例如1:2或1:3），以便进行更多反应。稀释倍数的适用性需通过实验确定，因为qPCR性能可能受到影响。
  3. 将对应同一引物组的所有反应安排在同一块PCR板上。对每个Input DNA稀释样本和每个IP DNA样本均设置技术重复。每个10 µL反应体系包含1.5 µL Input DNA或IP DNA（或洗脱缓冲液作为对照）、qPCR预混液（终浓度1x）、正向引物和反向引物（每种引物终浓度为400 nM）。
  4. 在实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：初始变性：95 °C 4分钟；扩增与荧光检测：40个循环，95 °C 10秒，60 °C 30秒，每步进行板读；最终延伸：60 °C 5分钟；熔解曲线分析：从60 °C升至90 °C，以0.5 °C为增量，每步5秒。

11. 确定扩增效率并验证产物特异性

  1. 针对每组输入DNA稀释样本，以[log10(1/稀释倍数)]为横坐标，[输入Cq值]为纵坐标，绘制四个数据点，并确定最佳拟合直线的斜率。
  2. 计算扩增效率。理想的引物组应持续表现出95%–100%的扩增效率。
    定量PCR分析中的扩增效率公式，展示方程布局。
  3. 检查所有反应是否均呈现单一尖锐的熔解曲线峰，并确认使用相同引物组的反应具有相同的熔解温度。出现多个峰或熔解温度不同可能提示非特异性扩增。
  4. 可选步骤：在室温下将反应产物在标准2%琼脂糖/TAE凝胶中电泳，以验证扩增产物条带大小。

12. 计算输入百分比

  1. 计算Input的稀释倍数。由于免疫沉淀裂解液体积的10%被保留作为Input，因此Input DNA进行1:5稀释后的总稀释倍数为50。
  2. 确定免疫沉淀（IP）样品的稀释倍数。如果IP DNA在进行qPCR前未稀释，则稀释倍数为1。
  3. 计算经稀释倍数校正后的IP与Input之间的Cq差值。
    ChIP定量PCR分析中的ΔCq计算公式；用于计算DNA扩增的公式。
  4. 计算Input百分比。
    qPCR结果计算中的Input百分比公式，与循环定量分析相关。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过饲喂方式对携带生殖系表达的 GFP-组蛋白 H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 报告基因（图2A）的动物施加 GFP RNAi 或对照 RNAi，并按照本方案及图1所述进行传代。在每一代中，随机选取部分群体，使用荧光体视显微镜人工评估其生殖系细胞核中的 GFP 信号。在经 GFP RNAi 处理的 P0 和 F1 代动物中，转基因沉默完全外显（图2B）。在 F2 代中，表现出 GFP 沉默遗传的个体比例约为 50%。至 F5 代时，大多数个体不再表现出沉默的遗传现象；到 F10 代时，未检测到任何遗传沉默，所有动物均表达 GFP。

为了确定组蛋白H3K9me3富集程度的变化与RNAi诱导沉默之间的对应关系，在F1代动物中进行了ChIP-qPCR实验，这些动物接受了GFP RNAi或对照RNAi处理。正如预期，与对照RNAi处理的动物相比，接受GFP RNAi处理的群体在GFP靶位点以及下游1.3 kb区域显示出更高的组蛋白H3K9me3水平（图2C）。组蛋白H3K9me3 ChIP特异性的证据来自一个已知富含该修饰的阳性对照位点（clec-18）的富集情况，而在邻近的阴性对照位点（hrp-2）则未观察到富集。在所有qPCR检测位点，IgG对照免疫沉淀中也检测到组蛋白H3的富集以及接近背景水平的富集，这与预期一致。当将报告基因位点的ChIP富集程度相对于阳性对照位点clec-18进行标准化后，结果显示GFP RNAi处理导致组蛋白H3K9me3富集程度更高，而组蛋白H3的富集程度在对照和GFP RNAi处理之间相似（图2D）。由于GFP RNAi预期不会影响clec-18位点的组蛋白H3K9me3或总组蛋白H3占据情况，因此这种标准化可减少技术变异的影响，例如GFP RNAi与对照RNAi样本之间ChIP效率的差异。不同RNAi处理之间组蛋白H3K9me3和组蛋白H3水平的倍数变化表明，在GFP RNAi诱导的沉默过程中，报告基因特异性地发生了组蛋白H3K9me3富集，且该富集独立于组蛋白占据状态（图2E）。

针对mex-5p::gfp-h2b的RNAi靶向。示意图和图表显示了多代之间的组蛋白调控情况。
图2：GFP RNAi诱导的沉默与RNAi靶位点处H3K9me3富集水平升高相对应。 （A）生殖系表达的GFP RNAi报告基因mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]的示意图，标出了qPCR扩增区域。（B）在21 °C下进行RNAi处理后，各代中GFP表达水平的评分结果。误差条表示两次生物学重复的标准差。（C）来自两次生物学重复的F1代年轻成虫中H3K9me3、组蛋白H3及IgG对照的ChIP-qPCR结果。clec-18和hrp-2分别为H3K9me3富集的阳性和阴性对照位点。（D）GFP RNAi报告基因处H3K9me3和组蛋白H3的富集程度，以clec-18阳性对照位点为标准化参照。（E）GFP RNAi处理组与对照RNAi处理组动物之间H3K9me3和组蛋白H3富集程度的变化，以clec-18为标准化参照。虚线表示1倍变化量。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，通过饲喂方式引入dsRNA，该方法已成为C. elegans18研究中的标准方法。对于RNAi遗传实验，饲喂法可简便地获得大量P0 代个体2,11,12,22,23,24,25。然而，RNAi处理的时机和持续时间会影响转基因沉默的效果26，而RNAi细菌的浓度则影响可遗传RNAi沉默的持续性1。因此，标准化的RNAi细菌培养和线虫生长条件对于获得一致的GFP沉默水平及遗传持续时间至关重要。本方案中，将胚胎接种于RNAi平板上，使P0代个体自孵化起即暴露于RNAi细菌中。其他替代方法则将同步化的L124,27或L425期个体转移至RNAi-NGM平板。此外，由于饥饿及其他应激因素会影响RNAi遗传的维持13，必须定期监测平板，避免种群密度过高及食物耗尽。除饲喂法启动RNAi外，部分早期的C. elegans RNAi遗传研究采用性腺注射诱导RNAi，该方法可更精确地控制dsRNA浓度1,28。

在本实验方案中，每一代均通过群体传代并结合碱性次氯酸盐处理，具体方法如前所述16,22,23,24。次氯酸盐处理可确保F1代不会被亲代环境中的RNAi细菌污染22，并防止可能出现的群体瓶颈效应。然而，批量传代也可能存在局限性，因为个体动物可能具有不同的遗传模式1,29。建立每一代的另一种方法是选择单个动物进行传代1,2,9,11,25。该方法可实现对谱系内表型的追踪，并便于引入遗传杂交。对于外显率较低的表型，谱系分析可能更具优势12。

荧光蛋白表达是RNAi诱导沉默效应的一种强大且便捷的检测指标2,3,4,12,14,15,16,25,30。如本实验方案所述，GFP表达可通过人工判读为“开启”（ON）或“关闭”（OFF）状态11,12,15,16,25。人工判读还可通过赋予定性强度等级进一步细化3,4,14。或者，也可采用显微图像的自动化强度评分11,12,14,25,27，或对活体动物进行流式细胞术荧光检测2，以获得定量且高通量的读数。然而，由于报告基因表达局限于生殖系，自动化方法的一个局限性在于必须能够区分GFP表达被沉默的个体与缺乏生殖系的个体，尤其是在研究涉及生殖系发育异常的突变体时。除GFP荧光外，逆转录（RT）-qPCR也可用于定量RNAi靶标的pre-mRNA和mRNA水平2,16,23,24。该方法可更直接地反映以RNA为靶标的沉默效果，特别适用于沉默后不产生可见表型的其他RNAi靶标。使用人工GFP报告基因的一个局限在于，在跨代表观遗传RNAi中，外源序列与内源序列的调控方式存在差异11。因此，针对内源靶标的研究，例如温度敏感型胚胎致死等位基因 oma-1(zu405)1,11,16,25，应被视为荧光转基因报告系统的一种互补性研究手段。

在RNAi遗传实验背景下进行ChIP分析时，需要对不同处理组和重复样本进行比较。首先，为了校正各样本起始材料的差异，需将ChIP信号相对于同一基因座的Input信号进行归一化，表示为“Input百分比”。同时平行处理组蛋白H3的ChIP，有助于判断组蛋白修饰的变化是否与核小体密度的改变相关。此外，由于ChIP是一个多步骤的实验流程，其效率可能在不同样本之间存在差异。因此，选择合适的阳性和阴性对照基因座有助于评估并比较各样本及实验之间的信噪比。另外，为了便于样本间的比较，通常将RNAi靶基因座处ChIP DNA的qPCR阈值循环值（Ct值）归一化至一个对照基因座3,11,15,23,30,31。为了评估RNAi处理的效果，还需比较处理组（RNAi）与对照组（无RNAi）之间ChIP信号的比值。当前方法的一个局限性在于ChIP实验使用的是整个动物组织，而对RNAi处理的响应可能仅特异存在于生殖系中。克服这一局限的一种策略是利用分离的生殖系细胞核进行ChIP实验。有关优化ChIP实验的其他技术考量，已在其他文献中被广泛讨论32,33。

总体而言，该RNAi遗传与ChIP实验方案提供了一个详细且易于调整的基础，可与其他技术相结合，以进一步探索跨代表观遗传调控。例如，可利用ChIP DNA（ChIP-seq）构建高通量测序文库，从而更详细地分析RNAi靶标附近区域乃至全基因组范围内的染色质状态。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者确认无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们希望感谢 C. elegans 研究领域中开发并共享了相关工具的各个实验室，本文引用了他们的研究成果。部分菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本研究获得了加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（A.L.S.，PJT-175245）。C.L. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金（PGS-D）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖BioshopAGA002
氨苄青霉素BioshopAMP201用超纯水配制成100 mg/mL的溶液，过滤除菌后于-20 °C保存。
抗H3K9me3兔多克隆抗体Abcamab8898浓度依批次而定（0.9 - 1 mg/mL）。
抗组蛋白H3兔多克隆抗体Abcamab1791浓度依批次而定（0.7 - 1 mg/mL）。
漂白剂（6%次氯酸钠）Lavo02358107
C. elegans GFP RNAi报告菌株NASX1263Sapetschnig 等，2015年（参考文献7）。由剑桥大学E. Miska实验室惠赠。
羧苄青霉素BioShopCAR544用超纯水配制成25 mg/mL的溶液，过滤除菌后于-20 °C保存。
Dynabeads Protein G磁珠Invitrogen10003D
E. coli HT115(DE3)菌株秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）HT115(DE3)
E. coli OP50-1菌株秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）OP50-1
EDTA（0.5 M，pH 8.0）Invitrogen15575020
荧光体视显微镜ZeissAxio Zoom.V16
甲醛（37%）SigmaF8775
甘氨酸Sigma50046配制成1.25 M溶液，4 °C保存。
HEPES-KOH（1 M，pH 7.5）TeknovaH1035
疏水性打印载玻片，10孔VWR100488-904
IGEPAL CA-630（辛基苯基聚氧乙烯醚）BioShopNON999用超纯水配制成10%（v/v）溶液，室温保存。
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）BioShopIPT001用超纯水配制成0.2 g/mL溶液，过滤除菌后于-20 °C保存。
iTaq通用SYBR Green SupermixBio-Rad1725122
添加100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板NANA标准实验室配方。
左旋咪唑（盐酸四咪唑）SigmaL9756用超纯水配制成200 mM溶液，-20 °C保存。
LiCl（8 M）SigmaL7026
M9缓冲液NANA22 mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，86 mM NaCl，1 mM MgSO4。
磁力架（适用于1.5 mL离心管）Applied BiosystemsA13346
磁力架（适用于0.2 mL离心管）PermagenMSR812
显微镜盖玻片Fisher Scientific12541B
显微镜载玻片Technologist ChoiceLAB-037
NaCl（5 M）PromegaV4221用于ChIP缓冲液。
NaOH SigmaS5881配制成10 M溶液，室温保存。
NGM平板NANA1.7%（w/v）琼脂，0.3%（w/v）NaCl，0.25%（w/v）蛋白胨，1 mM CaCl2，5 μg/mL胆固醇，25 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0），1 mM MgSO4，50 µg/mL链霉素。
正常兔IgG（1 mg/mL）Cell Signaling Technology2729
培养皿（35 mm × 10 mm）Sarstedt82.1135.500
磷酸盐缓冲液（10X）Fisher BioReagentsBP3991
质粒 - 对照RNAi AddgeneL4440（质粒#1654）
质粒 - 靶向GFP的RNAi AddgeneL4417（质粒#1649）注意：可使用其他源自L4440的靶向GFP的质粒。
引物对 [-3.3 kb gfp上游区]Integrated DNA TechnologiesNAF: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
引物对 [+1.3 kb gfp下游区]Integrated DNA TechnologiesNAF: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
引物对 [clec-18]Integrated DNA TechnologiesNAF: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
引物对 [gfp外显子1]Integrated DNA TechnologiesNAF: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
引物对 [gfp外显子4]Integrated DNA TechnologiesNAF: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
引物对 [hrp-2]Integrated DNA TechnologiesNAF: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche11836170001
蛋白酶K BiolineBIO-37084
QIAquick PCR纯化试剂盒 Qiagen28104
实时荧光定量PCR检测系统Bio-RadCFX96 
RNAi-NGM平板NANA1.7%（w/v）琼脂，0.3%（w/v）NaCl，0.25%（w/v）蛋白胨，1 mM CaCl2，5 µg/mL胆固醇，25 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0），1 mM MgSO4，25 µg/mL羧苄青霉素和5 mM IPTG。
RNase ASigmaR4642
Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠）SigmaL5777配制成10%（w/v）溶液，避光室温保存，最多保存1个月。
SDSSigma74255配制成10%（w/v）溶液，室温保存。
脱氧胆酸钠Sigma30970配制成5%（w/v）溶液，避光室温保存，最多保存1个月。
超声破碎管Evergreen214-3721-010
超声破碎管盖Evergreen300-2911-020
超声破碎仪QsonicaQ800R3-110
硫酸链霉素BioshopSTP101用超纯水配制成50 mg/mL溶液，过滤除菌后于-20 °C保存。
TAE缓冲液（1X）NANA40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA
计数器UlineH-7350
四环素BioshopTET701用乙醇配制成5 mg/mL溶液，-20 °C保存。
恒温混匀仪Eppendorf05-400-205
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）Invitrogen15568025
Triton X-100SigmaT8787用超纯水配制成10%（v/v）溶液，室温保存。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
  2. Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
  3. Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
  4. Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882(2006).
  5. Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
  6. Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
  7. Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).
  8. Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
  9. Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
  10. Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
  11. Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448(2019).
  12. Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
  13. Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797(2021).
  14. Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
  15. Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
  16. Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
  17. Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
  18. Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
  19. Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  21. Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
  22. Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
  23. Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).
  24. Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
  25. Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
  26. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  27. Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
  28. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
  29. Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
  30. Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
  31. Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
  32. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  33. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RNAi GFP RNA

相关文章