本文详细描述了使用非放射性化学发光检测法测定端粒长度的实验方案，重点优化了TAGGG端粒长度检测试剂盒的多个性能参数，例如缓冲液体积和探针浓度。
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本文内容
摘要
摘要
端粒是位于染色体末端的重复序列，其缩短是人类体细胞的一个典型特征。端粒缩短是由于末端复制问题以及缺乏端粒酶所致，端粒酶是负责维持端粒长度的酶。有趣的是，端粒长度也会因多种内部生理过程（如氧化应激和炎症）而缩短，而这些过程可能受到污染物、病原体、营养物质或辐射等细胞外因子的影响。因此，端粒长度是评估衰老及多种生理健康状况的优良生物标志物。TAGGG端粒长度检测试剂盒采用端粒限制性片段（TRF）分析法来定量平均端粒长度，具有高度可重复性。然而，该方法成本较高，因此不常用于大样本量的常规检测。本文中，我们描述了一种经过优化、经济高效的端粒长度检测详细实验方案，该方法基于Southern印迹或TRF分析，并采用非放射性化学发光检测技术。
引言
端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，包含串联重复的TTAGGG序列，通过保护染色体末端免于磨损以及解决末端复制问题来维持基因组的完整性。末端复制问题指的是DNA聚合酶无法完全复制3'端突出部分1,2。端粒过短会导致细胞内出现染色体异常，从而使细胞永久停滞于一种称为复制性衰老的阶段3。端粒过短还会引发一系列其他问题，例如线粒体功能障碍4,5以及细胞功能异常。
细胞每次分裂时都会丢失端粒DNA重复序列，平均每年丢失25至200个碱基对6，经过一定次数的分裂后会导致细胞衰老6。衰老与共病频率升高相关，其特征表现为端粒长度缩短7。如Mender所述，端粒限制性片段（TRF）分析是一种成本很高的方法8，因此在大多数研究中并未用于端粒长度的定量分析。
目前，大多数流行病学研究采用基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法来测量端粒长度。然而，qPCR方法是一种相对测....
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方案
注意：有关下述实验步骤中使用的所有试剂的详细信息，请参见材料表。表1列出了实验室自制试剂及其优化用量，表2列出了市售试剂的工作浓度。
1. 细胞培养
- 将待测端粒长度的细胞（本实验使用 A2780 细胞，一种卵巢腺癌细胞系）培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、链霉素、青霉素和两性霉素 B 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）完全培养基中，置于 6 cm 培养皿内。于 37 °C、含 5% 二氧化碳的湿润恒温环境中培养，直至细胞融合度达到 80%–100%。
- 移除培养基，并用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 加入 1 mL 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，使细胞脱落。
- 加入 2 mL DMEM 完全培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞收集至离心管中。
- 在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
- 用 1× PBS 洗涤沉淀物，并在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟。
- 将细胞沉淀物储存于 -80 °C，待后续使用。
注意：细胞数量可能因细胞系不同而有所差异。本实验中....
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结果
提取的基因组DNA（gDNA）在1%琼脂糖凝胶上电泳后显示出良好的完整性，如图1B所示，表明该样品可用于后续的TRF分析。随后通过调整每一步所需溶液的体积进行TRF实验（见表1和表2）。TRF信号清晰可见（图3）。因此，通过调整溶液体积和浓度，可以在不影响结果的前提下处理更多样品，并且可以使用免费软件（如Telotool10）成功测定端粒长度。
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讨论
我们描述了一种基于化学发光、非放射性的端粒长度检测方法的详细实验步骤，该方法采用Southern印迹技术。本方案经过优化，可在不影响结果质量的前提下合理使用多种试剂。预杂交和杂交缓冲液最多可重复使用五次。每1.5–2 µg基因组DNA所用的酶浓度可在10–20 U之间变动，而不影响实验结果。其他多种试剂盒组分，如地高辛（DIG）标记的分子量标记物和杂交探针，均可在低于推荐浓度的条件下使用。优化后的用量详见表2。我们已测试将其用量或浓度减半的情况，仍可获得最佳实验效果。采用这些优化步骤可极大降低每个样本的检测成本，从而使研究人员能够大规模应用此方法进行端粒长度的测定。
已有多种发表的TRF实验方案。我们对市售试剂盒方案进行了优化，以提高其成本效益。本方案与部分已发表的方案不同，不使用放射性物质11,12。此外，该方案相对简便，使用试剂盒中的组分而非自行配制试剂，特别是端粒探针13。
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致谢
我们感谢 Prachi Shah 女士在本实验方案初期优化过程中提供的帮助。感谢 Manoj Garg 博士提供 A2780 卵巢癌细胞系。EK 得到了生物技术部（编号 BT/RLF/Re-entry/06/2015）、科学技术部（ECR/2018/002117）研究基金以及 NMIMS 种子基金（IO 401405）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞系 | |||
| A2780（卵巢腺癌细胞系） | 作为礼物获赠 | ||
| 设备 | |||
| ChemiDoc XRS+（用于成像和紫外交联） | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop（Epoch 2） | Biotek | EPOCH2 | |
| 软件 | |||
| TeloTool | 版本 1.3 | ||
| 材料 | |||
| 乙酸 | Molychem | 64-19-7 | |
| 琼脂糖 | MP | 180720 | |
| 两性霉素B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| 乙二胺四乙酸 | Molychem | 6381-92-6 | |
| 热灭活胎牛血清（HI FBS） | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| 尼龙膜 | Sigma | 11209299001 | |
| 青霉素 | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Affymetrix | 151-21-3 | |
| 链霉素 | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman滤纸 | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| 试剂 | |||
| 1 kb DNA ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| 封闭液（10x） | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| 检测缓冲液（10x） | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| 消化缓冲液 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1（试剂盒替代品） | NEB | R0155T | |
| 上样染料 | BIOLABS | N3231S | |
| 马来酸缓冲液（10x） | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| 分子量标记物 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| 探针 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1（试剂盒替代品） | NEB | R0167L | |
| 底物 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| 洗涤缓冲液 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
参考文献
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
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重印与许可
