TAGGG端粒长度检测法性能参数的优化

摘要

本文详细描述了使用非放射性化学发光检测法测定端粒长度的实验方案，重点优化了TAGGG端粒长度检测试剂盒的多个性能参数，例如缓冲液体积和探针浓度。

摘要

端粒是位于染色体末端的重复序列，其缩短是人类体细胞的一个典型特征。端粒缩短是由于末端复制问题以及缺乏端粒酶所致，端粒酶是负责维持端粒长度的酶。有趣的是，端粒长度也会因多种内部生理过程（如氧化应激和炎症）而缩短，而这些过程可能受到污染物、病原体、营养物质或辐射等细胞外因子的影响。因此，端粒长度是评估衰老及多种生理健康状况的优良生物标志物。TAGGG端粒长度检测试剂盒采用端粒限制性片段（TRF）分析法来定量平均端粒长度，具有高度可重复性。然而，该方法成本较高，因此不常用于大样本量的常规检测。本文中，我们描述了一种经过优化、经济高效的端粒长度检测详细实验方案，该方法基于Southern印迹或TRF分析，并采用非放射性化学发光检测技术。

引言

端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，包含串联重复的TTAGGG序列，通过保护染色体末端免于磨损以及解决末端复制问题来维持基因组的完整性。末端复制问题指的是DNA聚合酶无法完全复制3'端突出部分^1,2。端粒过短会导致细胞内出现染色体异常，从而使细胞永久停滞于一种称为复制性衰老的阶段³。端粒过短还会引发一系列其他问题，例如线粒体功能障碍^4,5以及细胞功能异常。

细胞每次分裂时都会丢失端粒DNA重复序列，平均每年丢失25至200个碱基对⁶，经过一定次数的分裂后会导致细胞衰老⁶。衰老与共病频率升高相关，其特征表现为端粒长度缩短⁷。如Mender所述，端粒限制性片段（TRF）分析是一种成本很高的方法⁸，因此在大多数研究中并未用于端粒长度的定量分析。

目前，大多数流行病学研究采用基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法来测量端粒长度。然而，qPCR方法是一种相对测量法，因为它测量的是端粒与单拷贝基因扩增产物之间的比值，而非端粒的绝对长度。使用TRF（末端限制性片段）方法测量端粒长度是公认的金标准，因为它能够测量样本中端粒长度的分布情况，并以千碱基（kb）为单位用绝对数值表示测量结果。然而，该方法的应用受到限制，因其操作繁琐、劳动强度大且成本较高。本文中，我们介绍了一种基于化学发光的TRF端粒长度测量优化方案。

TRF 分析包括七个主要步骤：1）培养细胞以提取基因组 DNA，2）使用苯酚:氯仿:异戊醇（P:C:I）法提取基因组 DNA，3）对基因组 DNA 进行限制性酶切，4）琼脂糖凝胶电泳，5）将限制性酶切后的 DNA 片段进行 Southern 印迹，6）杂交与检测 通过 化学发光——通过碱性磷酸酶的高灵敏度化学发光底物二钠 2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷)]-4-基)-1-苯基磷酸盐（CDP-Star）显影固定化的端粒探针；7）分析这些端粒弥散条带以获得平均端粒长度及长度范围信息。

方案

注意：有关下述实验步骤中使用的所有试剂的详细信息，请参见材料表。表1列出了实验室自制试剂及其优化用量，表2列出了市售试剂的工作浓度。

1. 细胞培养

1. 将待测端粒长度的细胞（本实验使用 A2780 细胞，一种卵巢腺癌细胞系）培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、链霉素、青霉素和两性霉素 B 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）完全培养基中，置于 6 cm 培养皿内。于 37 °C、含 5% 二氧化碳的湿润恒温环境中培养，直至细胞融合度达到 80%–100%。
2. 移除培养基，并用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
3. 加入 1 mL 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，使细胞脱落。
4. 加入 2 mL DMEM 完全培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞收集至离心管中。
5. 在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
6. 用 1× PBS 洗涤沉淀物，并在 2,348 × g 条件下离心 5 分钟。
7. 将细胞沉淀物储存于 -80 °C，待后续使用。
   ​注意：细胞数量可能因细胞系不同而有所差异。本实验中 A2780 细胞系可获得约 2.5 × 10⁶ 个细胞，用于后续步骤。

2. 基因组DNA提取

1. 向细胞沉淀中加入 500 µL 裂解缓冲液（10 mM tris-Cl，pH 8.0；25 mM EDTA，pH 8.0；100 mM NaCl；0.5% w/v 十二烷基硫酸钠），使用剪口枪头（开口直径至少 2 mm）轻轻混匀。加入 20 µg/mL 新鲜配制的 RNase A，通过轻柔颠倒混匀。
2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟，孵育过程中偶尔颠倒离心管。
3. 加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 µg/mL，轻柔颠倒混匀 10 次。在 55 °C 下孵育 2 小时，孵育期间定期颠倒离心管（每 10 分钟一次）。
4. 加入 500 µL 苯酚:氯仿:异戊醇试剂（25:24:1），轻柔颠倒混匀 20 次。在室温（约 25 °C）下以 9,391 × g 离心 15 分钟。
   注意：图 1A 显示了离心后获得的三层结构。
5. 从可见的三层中取出黏稠的上层水相，使用剪口枪头转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿，轻柔颠倒混匀 20 次。
6. 在室温下以 9,391 × g 离心 15 分钟。
7. 收集水相层，并加入适量的 5 M NaCl，使 NaCl 的终浓度为 0.2 M。
8. 加入两倍体积的 100% 乙醇，轻柔颠倒混匀 20–25 次。在室温下以 15,871 × g 离心 5 分钟。
9. 弃去上清液，加入 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀。在室温下以 15,871 × g 离心 5 分钟。
10. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥数分钟，加入 50 µL 无菌无核酸酶水。在室温下让 DNA 重新水合 1–2 天。使用剪口枪头通过移液混匀。
11. 使用紫外（UV）分光光度法测定 DNA 浓度。如有必要，使用无菌无核酸酶水重新稀释样品，使浓度至少达到 300–500 ng/µL。
12. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性（图 1B）。
13. 将稀释后的 DNA 储存于 -20 °C，以备后续使用。

3. 基因组DNA的消化

1. 配制含有 Rsa1（20 U）和 Hinf1（20 U）的酶混合液，每反应加入 2 µL 限制性消化缓冲液。
2. 取适量基因组 DNA，使 DNA 总量为 1.5 µg。用无菌无核酸酶水补足体积，确保加入酶后总体积为 20 µL。
3. 轻轻弹击管壁充分混匀，然后短暂离心。
4. 将反应混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。

4. 琼脂糖凝胶电泳

1. 使用高纯度琼脂糖，在1x TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液中制备一块10 cm × 15 cm、浓度为0.8%的琼脂糖凝胶。
2. 向每份已消化的基因组DNA样品中加入5 µL上样染料，使最终体积为25 µL，并将样品上样至凝胶中。
3. 通过混合1 µL分子量标记物（DNA Ladder）、3 µL无菌无核酸酶水和1 µL 5x上样染料，制备分子量标记物混合液。
4. 若样品数量较多（约10个），在已消化基因组DNA样品的两侧各上样5 µL分子量标记物混合液；若样品数小于或等于5个，则仅在一侧上样。
5. 以5 V/cm的电压电泳6小时。电泳结束后，在凝胶一角切出一个缺口，以标记上样顺序。
6. 将凝胶浸入0.25 M HCl溶液中，室温下轻轻振荡处理10分钟。
7. 用蒸馏水将凝胶漂洗两次。
8. 将凝胶浸入含0.5 M NaOH和1.5 M NaCl的溶液中，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共变性两次，以实现DNA变性。
9. 用蒸馏水将凝胶漂洗两次。
10. 将凝胶浸入含0.5 M Tris-HCl和3 M NaCl（pH 7.5）的溶液中，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共中和两次，以中和DNA。

5. Southern 印迹杂交

1. 裁剪一张尺寸为 10 cm × 12 cm 的尼龙膜，并在与凝胶相同位置处剪出一个缺口。
2. 将膜依次浸入蒸馏水和 20× 柠檬酸钠缓冲液（SSC 缓冲液）中进行活化（见表 1）。
3. 搭建转移装置。
   1. 取一个洁净的玻璃托盘，将另一个托盘倒置放入其中。用普通滤纸制作一根虹吸芯，使其两端接触外层托盘底部。
   2. 将凝胶置于滤纸上。轻轻将已活化的尼龙膜覆盖在凝胶上，确保缺口对齐，并用玻璃棒滚压以去除气泡。
   3. 在膜上方依次放置 9.5 cm × 11.5 cm 的纤维素滤纸堆（高约 2 cm），再覆盖相同尺寸的普通滤纸堆（高约 6 cm）。在滤纸堆上放置重物，确保下方压力均匀。向外部托盘中加入 20× SSC 缓冲液（见图 2）。
   4. 静置过夜，完成转移。
4. Southern 转移完成后，将 DNA 固定于膜上：将膜置于紫外透射仪或紫外交联仪中进行 UV 交联。使用 302 nm、8 W 紫外灯照射 5 分钟，或使用 254 nm、8 W 紫外灯照射 2 分钟（能量约为 120 mJ）。确保 DNA 所在的一面朝向紫外灯。
5. 用 25 mL 的 2× SSC 缓冲液将膜清洗两次。
6. 如需暂停实验流程，可将膜完全干燥后用铝箔松散包裹，于 2–8 °C 保存，待后续处理。

6. 杂交与化学发光检测

1. 将预杂交缓冲液预热至 42 °C。
   注意：以下步骤中所列溶液/缓冲液的用量为每 100 cm² 膜面积所需体积。
2. 将膜置于 10 mL 预热的预杂交缓冲液中，在 42 °C 下轻轻振荡孵育 1 小时，进行预杂交。
3. 每 5 mL 预热的预杂交缓冲液中加入 0.5 µL 端粒探针，配制杂交溶液。
4. 将膜在 10 mL 杂交溶液中于 42 °C 轻轻振荡孵育 3 小时。
5. 用严格性缓冲液 1（表 1）在室温下轻轻振荡洗涤膜两次，每次 10 分钟（每次 25 mL）。
6. 将严格性缓冲液 2（表 1）在 50 °C 预热 30 分钟。
7. 用严格性缓冲液 2 在 50 °C 轻轻振荡洗涤膜两次，每次 15 分钟（每次 25 mL）。
8. 在室温下用 15 mL 洗涤缓冲液轻轻振荡漂洗 5 分钟。
9. 将膜置于 10 mL 新鲜配制的 1× 封闭溶液中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
10. 将膜置于 10 mL 碱性磷酸酶偶联的抗地高辛工作液中（见 表 2），在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
11. 用洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤膜两次，每次 15 分钟。
12. 将膜在 10 mL 检测缓冲液中于室温轻轻振荡孵育 5 分钟。
13. 去除多余的检测缓冲液，将膜 DNA 面朝上放置于杂交袋或醋酸纤维片上。滴加约 1–1.5 mL 底物溶液至膜表面，立即覆盖另一张薄膜，于室温孵育 5 分钟。
14. 挤出多余的底物溶液，准备成像。
15. 在凝胶成像系统中对膜进行约 20 分钟的成像，于不同时间点采集多张图像。选择未饱和的图像用于后续分析。
    ​注意：若信号较弱，可延长成像时间。

7. 分析

1. 获取图像文件后，以最高可能分辨率（本例中为600 dpi）将图像导出为适用于出版的 .tif 格式。
2. 安装 Telotool 软件。该软件需要特定版本（R2012a）的 MATLAB（可免费获取）才能运行。
3. 打开软件，点击右上角的 加载图像文件 按钮。
4. 图像加载完成后，点击 反转图像，使图像背景变为黑色，而条带/弥散区域为白色。
5. 从加样孔开始，以图像的上角为起点进行裁剪。完成裁剪区域选择后，在区域内单击右键，选择 裁剪图像。
6. 图像裁剪完成后，点击 计算泳道，使系统自动进行泳道检测。
7. 如果泳道未被正确检测，例如某些泳道完全未被识别，或检测出额外或不完整的泳道，请按以下方法进行泳道调整。
   1. 点击 调整泳道，在弹出的窗口中根据需要添加和/或调整泳道，然后点击 应用并关闭。
8. 调整泳道后，确保每条泳道上均显示一个红色圆点，并使用 标准品拟合 按钮调整标准品，确保两个标准品泳道中的峰数量处于相同位置。使用 删除极值 按钮删除任何多余的峰。
9. 标准品调整完成后，选择 泳道轮廓，点击 标准品拟合，然后选择 多项式拟合。
10. 按照软件建议，点击 趋势线，然后在下一项中选择 校正后。
11. 点击 获取结果，以表格形式显示结果，其中 平均TRF 行即为相应泳道样品的端粒长度测量值。
12. 点击 全部保存，将结果以电子表格形式存储。

结果

提取的基因组DNA（gDNA）在1%琼脂糖凝胶上电泳后显示出良好的完整性，如图1B所示，表明该样品可用于后续的TRF分析。随后通过调整每一步所需溶液的体积进行TRF实验（见表1和表2）。TRF信号清晰可见（图3）。因此，通过调整溶液体积和浓度，可以在不影响结果的前提下处理更多样品，并且可以使用Telotool¹⁰等免费软件成功测定端粒长度。

讨论

我们描述了一种基于化学发光、非放射性的端粒长度检测方法的详细实验步骤，该方法采用Southern印迹技术。本方案经过优化，可在不影响结果质量的前提下合理使用多种试剂。预杂交和杂交缓冲液最多可重复使用五次。每1.5–2 µg基因组DNA所用的酶浓度可在10–20 U之间变动，而不影响实验结果。其他多种试剂盒组分，如地高辛（DIG）标记的分子量标记物和杂交探针，均可在低于推荐浓度的条件下使用。优化后的用量详见表2。我们已测试将其用量或浓度减半的情况，仍可获得最佳实验效果。采用这些优化步骤可极大降低每个样本的检测成本，从而使研究人员能够大规模应用此方法进行端粒长度的测定。

已有多种发表的TRF实验方案。我们对市售试剂盒方案进行了优化，以提高其成本效益。本方案与部分已发表的方案不同，不使用放射性物质^11,12。此外，该方案相对简便，使用试剂盒中的组分而非自行配制试剂，特别是端粒探针¹³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
A2780（卵巢腺癌细胞系）	作为礼物获赠
设备
ChemiDoc XRS+（用于成像和紫外交联）	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop（Epoch 2）	Biotek	EPOCH2
软件
TeloTool	版本 1.3
材料
乙酸	Molychem	64-19-7
琼脂糖	MP	180720
两性霉素B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
乙二胺四乙酸	Molychem	6381-92-6
热灭活胎牛血清（HI FBS）	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
尼龙膜	Sigma	11209299001
青霉素	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
十二烷基硫酸钠	Affymetrix	151-21-3
链霉素	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman滤纸	GE healthcare lifesciences	1001-917
试剂
1 kb DNA ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
封闭液（10x）	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
检测缓冲液（10x）	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
消化缓冲液	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1（试剂盒替代品）	NEB	R0155T
上样染料	BIOLABS	N3231S
马来酸缓冲液（10x）	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
分子量标记物	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
探针	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1（试剂盒替代品）	NEB	R0167L
底物	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
洗涤缓冲液	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001