本方案描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度、高分辨率和高通量的三维成像。
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方法文章
一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
了解细胞器超微结构的动态特征对于机制研究至关重要，这些特征不仅包含大量未知信息，而且从三维（3D）角度来看也极为复杂。电子显微镜（EM）具有良好的成像深度，能够重建高分辨率的图像序列，从而在纳米尺度上研究细胞器的超微结构形态；因此，3D重建因其无可比拟的优势而日益重要。扫描电子显微镜（SEM）提供了一种高通量的图像采集技术，可对连续切片中同一感兴趣区域进行成像，进而重建大尺度的三维结构。因此，SEM在大规模3D重建中的应用正变得越来越普遍，以恢复细胞器真实的三维超微结构。在本实验方案中，我们提出结合连续超薄切片与3D重建技术，用于研究胰腺癌细胞中线粒体嵴的结构。本方案以逐步说明的方式详细描述了这些技术的具体操作步骤，包括四氧化锇-硫碳酰肼-四氧化锇（OTO）染色法、连续超薄切片成像以及三维可视化展示。
引言
线粒体是细胞中最重要的细胞器之一。它们是细胞生物能量学和代谢的核心枢纽1,2，并在癌症中发挥关键作用3。胰腺癌（PC）是治疗难度最大的癌症之一4，因其扩散迅速且死亡率高。线粒体功能障碍主要由线粒体形态的改变引起3,5,6,7，已被证实与胰腺癌的疾病机制相关8。线粒体还具有高度动态性，表现为其网络连接性和嵴结构频繁而动态的变化9。嵴结构的重塑可直接影响线粒体功能和细胞状态10,11，而这些在肿瘤细胞生长、转移以及肿瘤微环境变化过程中均发生显著改变12,13。
近年来，科学家利用透射电子显微....
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方案
1. 材料准备
- 将 2 × 106 个 Panc02 细胞接种于 12 mL DMEM 培养基（含 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素-链霉素）中，在 37 °C、95% 湿度、5% 二氧化碳和 95% 空气的气氛中培养 48 小时。
- 收集 Panc02 细胞，以 28 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。确保样品量适当（1 × 107 个细胞），否则后续的固定和脱水步骤将无法有效进行。
- 向 1.5 mL 微量离心管中加入 1 mL 2.5% 戊二醛固定液，于 4 °C 过夜固定新鲜 Panc02 细胞。
注意：在后续各步骤（步骤 1.3–1.11）中，样品均需以 1,006 × g 离心 5 分钟。 - 吸除固定液，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下清洗样品两次，每次 10 分钟，再用双蒸水（ddH2O）清洗两次，每次 10 分钟。
- 加入 50 µL 含 1% 四氧化锇（OsO4）和 1.5% 亚铁氰化钾的溶液（体积比 1:1），于 4 °C 反应 1 小时。然后用 0.1 M PBS 清洗两次，每次 10 分钟，再用 ddH2O 清洗 10 分钟。
- 加入 1 mL 1% 硫代碳酰肼（TCH）溶液，....
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结果
在细胞培养过程中（图1A），我们首先将胰腺癌细胞分为对照组，用完全培养基培养，以及用(1S,3R)-RSL3处理的实验组48 （RSL3，一种铁死亡激活剂，100 nM）组，以及 RSL3（100 nM）联合 ferrostatin-1 组49 （Fer-1，一种铁死亡抑制剂，100 nM）组。通过上述实验步骤，扫描电子显微镜获得了38（补充图1), 43 (补充图2），以及44（补充图3) 对照组、RSL3组和抑制剂组（RSL3 + Fer-1组）的连续图像。图像分辨率为1,280 × 960像素，放大倍数为8,000倍（分辨率为12.40 nm/像素）。在切片上方的细胞区域内未观察到皱褶和污染。透射电镜图像可清晰区分细胞内的细胞器，如线粒体和内质网。图1E).
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讨论
本文介绍的方法为应用三维重建技术提供了一个实用的分步指南，该技术涉及将电子显微镜与图像处理技术相结合，对连续超薄切片产生的二维断层图像进行堆叠与分割。本方案强调了二维图像存在的一项局限性，即可通过细胞器超微结构的三维可视化加以克服，后者具有高分辨率下结构可重复性强和准确性更高的优势。更重要的是，这种三维可视化技术可应用于肿瘤细胞，使病理机制的研究更加直观且可靠。本研究通过比较在不同条件下获取的三组连续切片，实现了对线粒体嵴立体结构的可视化，从而验证了RSL3在癌细胞中诱导线粒体嵴膜降解的现象56。这些结果为阐明RSL3作为抗胰腺癌药物的作用机制提供了新的见解。
获取高分辨率二维图像在实现线粒体嵴三维重构57过程中具有重要作用，图像质量直接影响重构结果22,58。因此，该方法也存在一些局限性，例如扫描电镜（SEM）图像中产生的荷电伪影59.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到浙江省自然科学基金（Z23H290001、LY19H280001）；国家自然科学基金（82274364、81673607 和 81774011）；以及湖州市科技计划公益性研究项目（2021GY49、2018GZ24）的资助。我们感谢浙江中医药大学中医科学院医学研究中心公共平台提供的大力支持、技术协助和实验支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| 丙酮 | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| 天冬氨酸 | MCE | HY-42068 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔’s medium | Gibco | 11995115 | |
| 乙醇 | 默克 | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437010 | |
| 场发射扫描电子显微镜 | HITACHI | SU8010 | |
| 戊二醛 | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| 硝酸铅 | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| 四氧化锇 | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | 欧洲认证细胞培养库 | 98102213 | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 磷酸盐缓冲液 | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 环氧树脂 | SPI CHEM | GS02660 | |
| 亚铁氰化钾 | Macklin | P816416 | |
| 硫代碳酰肼 | 默克 | 223220 | |
| 超薄切片机 | LEICA | EMUC7 | |
| 醋酸铀酰 | RHAWN | R032929 |
参考文献
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M.
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重印与许可
