优化无菌黄蜂的饲养流程

摘要

纳蜂 胡蜂胚胎从 Lucillia sericata 寄生后12-24小时的蛹，用酒精和10%次氯酸钠溶液清洗，以获得无菌胚胎。培养无菌胚胎后 并为它们提供 纳索尼亚 培养基，用于生长和发育 体外，无菌 Nasonia 成虫被获得。

摘要

无菌饲养技术是一种在无菌或近乎无菌条件下培养昆虫的方法，可有效消除外界微生物对昆虫微生物群的影响，从而推动昆虫微生物群研究的快速发展。Nasonia（寄生蜂属）是一种寄生蜂昆虫，具有生命周期短、遗传变异丰富、操作简便等优点，被广泛用作昆虫模式系统。与仅能减少动物体内微生物数量的抗生素处理方法不同，无菌饲养技术能够控制动物体内微生物的组成和数量，进一步促进宿主-微生物相互作用的研究。然而，以往的Nasonia饲养培养基（NRM）存在一些缺陷和问题，例如制备过程复杂且耗时、易受细菌或真菌污染、保存时间短等。因此，本研究通过优化NRM制备过程中所用工具、储存条件及成分比例，解决了上述问题。优化后的培养基可在-20 °C下保存至少3个月，并消除了在饲喂无菌蜂过程中NRM被污染的可能性。这进一步提高了无菌Nasonia的存活率和健康水平，对于将Nasonia作为微生物研究的模式生物具有重要意义。

引言

无菌动物是指无法检测到任何活的微生物和寄生虫的动物¹。通过在无菌条件下解剖母体，可获得无菌胚胎，随后在屏障系统中进行培育²。这类动物可用于研究微生物对宿主的影响，例如对肠道微生物群、免疫系统以及代谢的影响¹。借助特定技术手段，许多昆虫甚至哺乳动物均可实现无菌化^3,4。无菌动物具有独特的重要作用，已广泛应用于微生物学研究的各个方面⁵。例如，利用无菌的Nasonia胡蜂开展的研究表明，在长期外源性环境压力下，微生物可帮助宿主适应新环境^6,7。

Nasonia 寄生蜂是一类将卵注入蝇类蛹中的小型寄生性黄蜂⁴已知有四个物种 纳蜂，包括 华金小蜂，长角华金小蜂，吉氏华金小蜂， 和 Nasonia oneida⁸. N. vitrip....

方案

1. 无菌 Nasonia 饲养基质的制备

1. 将市售的 L. sericata 蛹（见材料表）放置在能够容纳所有蛹的表面，例如托盘或一张纸上。丢弃发育不良的幼虫、颜色发暗的老蛹、空蛹壳、木屑或其他杂质，仅保留呈红褐色的年轻蛹，并将其转移至一个烧杯中（约 3,000–4,000 个蛹）。
   注：经过多次实验发现，使用颜色发暗的老蛹制备的培养基容易变黑，并会抑制无菌寄生蜂的发育。而使用红褐色的年轻蛹制备培养基时未出现此现象。其原因尚不明确，需进一步研究验证。
2. 向烧杯中加入足量去离子水，使水完全覆盖蛹的表面。用锡箔纸或纱布包裹烧杯口，摇动烧杯以清洗蛹表面的杂质，然后倒掉水分。重复清洗三至五次。
3. 将清洗后的 L. sericata 蛹放入蒜压器的滤网中，用力挤压，收集 L. sericata 蛹的组织液至一个 50 mL 无菌离心管中。随后倒掉残渣，将新的蛹放入蒜压器的滤网中，继续挤压，直至全部完成。
   注：与 Wang 等人¹⁴使用的针式挤压装置相比，蒜压器更为便捷，且能更彻底地分离间质液。这一改进为 NRM 的大规模制备和长期储存奠定了基础。
4. 在 4 °C 条件下以 25,000 × g

结果

通过改进制备工具，显著提高了NRM的制备效率。此外，通过优化喂养策略和保存方法，消除了NRM在喂食过程中的污染问题。同时，调整后的NRM以L. sericata为宿主时，更符合无菌寄生蜂生长发育所需的营养比例。与使用GFRv2培养基并以NRMv3饲养的无菌寄生蜂相比，从幼虫到蛹阶段的存活率显著提高（图2）。此外，无菌寄生蜂的世代周期与常规饲养的寄生蜂无显著差异（约每14天一个世代）（图5）。这些改进对于发展Nasonia模式生物以及研究宿主-微生物互作机制具有重要意义。

讨论

随着基因组学和代谢组学等高通量检测技术的应用，研究人员逐渐认识到肠道微生物群具有巨大的遗传多样性和代谢复杂性¹⁶。这些共生细菌通过与宿主之间的复杂相互作用，与宿主的多种生理或病理状态密切相关，例如营养代谢、肿瘤、免疫以及衰老等¹⁷。然而，由于每个自然个体中微生物的组成并不完全相同，因此针对宿主内微生物群体组成与功能网络的相关研究极为困难¹⁶。因此，亟需一个理想的模型来探索微生物与宿主之间的相互作用及相关机制。Nasonia 寄生蜂因其诸多生物学优势以及无菌蜂的特性，可作为微生物组研究领域的理想模型⁶。与抗生素处理相比，使用无菌动物能够精确控制微生物的组成和数量，这对于研究微生物功能至关重要。此外，抗生素处理可能引发多种副作用，包括抗生素耐药性、肠道功能障碍以及肠屏障损伤¹⁸。因此，开发一种更高效的方法以获得无菌寄生蜂，对于研究宿主-微生物组相互作用具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 微米无菌真空滤器	NEST	331011
10% 次氯酸钠	LIRCON	XB-84BS-1
1× PBS 溶液	Solarbio	P1020
200 目尼龙网	BIOBYING	BY-378Z
24 孔板	NEST	702001
8、1.2、0.8 和 0.45 µm 滤膜	上海兴亚净化材料厂	HN-AA-JT-10079
无水乙醇	Macklin	E809057-500ml
细胞滤筛	BIOLOGIX	15-1100
商用果蝇培养基	Boer	B645446-500ml
解剖针	Bioroyee	17-9140
蒜压器	Taobao	无目录编号	在淘宝购买
丝光绿蝇蛹	合肥大源生物科技有限公司	无目录编号	在淘宝购买
小型毛笔	Cestidur	BL0508
体视显微镜	SOPTOP	RX50
镊子	SALMART	A109001-56