纳蜂 胡蜂胚胎从 Lucillia sericata 寄生后12-24小时的蛹，用酒精和10%次氯酸钠溶液清洗，以获得无菌胚胎。培养无菌胚胎后 并为它们提供 纳索尼亚 培养基，用于生长和发育 体外，无菌 Nasonia 成虫被获得。
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摘要
摘要
无菌饲养技术是一种在无菌或近乎无菌条件下培养昆虫的方法，可有效消除外界微生物对昆虫微生物群的影响，从而推动昆虫微生物群研究的快速发展。Nasonia（寄生蜂属）是一种寄生蜂昆虫，具有生命周期短、遗传变异丰富、操作简便等优点，被广泛用作昆虫模式系统。与仅能减少动物体内微生物数量的抗生素处理方法不同，无菌饲养技术能够控制动物体内微生物的组成和数量，进一步促进宿主-微生物相互作用的研究。然而，以往的Nasonia饲养培养基（NRM）存在一些缺陷和问题，例如制备过程复杂且耗时、易受细菌或真菌污染、保存时间短等。因此，本研究通过优化NRM制备过程中所用工具、储存条件及成分比例，解决了上述问题。优化后的培养基可在-20 °C下保存至少3个月，并消除了在饲喂无菌蜂过程中NRM被污染的可能性。这进一步提高了无菌Nasonia的存活率和健康水平，对于将Nasonia作为微生物研究的模式生物具有重要意义。
引言
无菌动物是指无法检测到任何活的微生物和寄生虫的动物1。通过在无菌条件下解剖母体，可获得无菌胚胎，随后在屏障系统中进行培育2。这类动物可用于研究微生物对宿主的影响，例如对肠道微生物群、免疫系统以及代谢的影响1。借助特定技术手段，许多昆虫甚至哺乳动物均可实现无菌化3,4。无菌动物具有独特的重要作用，已广泛应用于微生物学研究的各个方面5。例如，利用无菌的Nasonia胡蜂开展的研究表明，在长期外源性环境压力下，微生物可帮助宿主适应新环境6,7。
Nasonia 寄生蜂是一类将卵注入蝇类蛹中的小型寄生性黄蜂4已知有四个物种 纳蜂，包括 华金小蜂，长角华金小蜂，吉氏华金小蜂， 和 Nasonia oneida8. N. vitripennis 在全球范围内均有分布，而其余三个物种仅限于北美洲的有限区域4. Nasonia 寄生蜂因其易于培养、繁殖周期短、基因组已测序以及具有长期滞育等特性，被视为理想的模式昆虫8,9可用于研究昆虫进化、遗传学、发育、行为及共生关系的多个方面。10此外， Nasonia 寄生蜂也可用于控制农业和疾病中的有害蝇类11成功建立无菌昆虫体系包括两个主要步骤：（1）胚胎的灭菌处理，以及（2）为幼虫提供无菌食物。 体外为了获得无菌食物，Brucker和Bordenstein12 开发 纳索尼亚 通过使用抗生素、漂白剂和胎牛血清等化学物质杀死细菌，于2012年制备了NRMv1饲养培养基12然而，化学灭菌方法导致了较低的存活率和羽化率 N. vitripennis13随后，在2016年，Shropshire 等人通过采用滤膜除菌法替代化学灭菌法，消除了抗生素及其他物质带来的安全隐患，并优化了繁育流程13然而，该方法仍存在一些缺点，例如培养基的制备和使用过程较为困难，且胚胎、幼虫和封口蛹面临溺亡、摄食不足或脱水的风险14. Wang 和 Brucker14 近期改进的 Nasonia 饲养培养基版本3（NRMv3）和无菌饲养版本2（GFRv2）方案。这些改进降低了成本和培养基消耗。然而，NRMv3的保存时间极短，且极易受到污染。
在NRMv3的基础上，本研究优化了NRM制备工具的储存方法及营养成分比例。这一方法学上的改进促进了将N. vitripennis作为微生物组研究模型的应用。相较于Wang等人14开发的NRMv3，本研究改进了挤压NRM原料之一——Sarcophaga bullata蛹的工具，相比Wang等人14使用的底部带孔的60 mL注射器，新工具显著提高了S. bullata蛹组织液的制备效率。我们调整了NRM的营养成分比例，使无菌Nasonia寄生蜂的存活率有所提高，同时不影响其发育时间。此外，将NRM分装至小容量离心管（1.5 mL）中，并于-20 °C冰箱中冷冻保存，以延长其储存期限。值得注意的是，尽管本研究使用家蝇Lucilia sericata作为NRM制备的宿主和原料来源，但该方案可能适用于实验室中其他可获得的Nasonia宿主。
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方案
1. 无菌 Nasonia 饲养基质的制备
- 将市售的 L. sericata 蛹（见材料表）放置在能够容纳所有蛹的表面，例如托盘或一张纸上。丢弃发育不良的幼虫、颜色发暗的老蛹、空蛹壳、木屑或其他杂质，仅保留呈红褐色的年轻蛹，并将其转移至一个烧杯中（约 3,000–4,000 个蛹）。
注：经过多次实验发现，使用颜色发暗的老蛹制备的培养基容易变黑，并会抑制无菌寄生蜂的发育。而使用红褐色的年轻蛹制备培养基时未出现此现象。其原因尚不明确，需进一步研究验证。 - 向烧杯中加入足量去离子水，使水完全覆盖蛹的表面。用锡箔纸或纱布包裹烧杯口，摇动烧杯以清洗蛹表面的杂质，然后倒掉水分。重复清洗三至五次。
- 将清洗后的 L. sericata 蛹放入蒜压器的滤网中，用力挤压，收集 L. sericata 蛹的组织液至一个 50 mL 无菌离心管中。随后倒掉残渣，将新的蛹放入蒜压器的滤网中，继续挤压，直至全部完成。
注：与 Wang 等人14使用的针式挤压装置相比，蒜压器更为便捷，且能更彻底地分离间质液。这一改进为 NRM 的大规模制备和长期储存奠定了基础。 - 在 4 °C 条件下以 25,000 × g 离心 10 分钟。离心后，混合物自下而上分为三层：沉淀层、蛋白层和脂肪层（图 1）。
- 为防止过滤过程中堵塞，使用 18 G 无菌针头吸取蛋白层，并转移至一个新的 50 mL 无菌锥形聚丙烯离心管中。
- 按 1:1 的比例将市售液体 Drosophila 培养基（见材料表）加入蛋白提取物中。
注：与 NRMv3 相比，本方法采用更便捷的商业化 L. sericata 作为寄主及 NRM 原料，因此将营养比例从 1:2 调整为 1:1，该比例更有利于无菌 Nasonia 的生长发育（图 2）。 - 使用真空过滤系统，依次采用不同孔径（8、1.2、0.8 和 0.45 µm；见材料表）的滤膜对混合培养基（Drosophila 培养基与 L. sericata 蛹蛋白提取物）进行过滤，以去除不同大小的颗粒。为防止堵塞，当流速减慢时应及时更换滤膜。
注：每次过滤均需使用新的 50 mL 无菌离心管。 - 再次在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 10 分钟，并通过 0.22 µm 注射器滤器对上清液进行灭菌。重复上述步骤一次。
- 分装后将培养基在 -20 °C 保存（图 3A），以实现长期储存。
注：为防止污染及反复冻融，建议在包装后每次使用培养基时，每管 NRM 仅开启一次（图 3A）。
2. 无菌卵的收集
- 为了确保后代中稳定的雌雄比例，在蛹期将蛹放入 Drosophila 培养管中，雌雄比例为50只雌性对15只雄性，这是由于其单倍体遗传特性所致（雄性由单倍体细胞发育而来，而雌性则由受精卵产生的二倍体细胞发育而来）4,15。
- 成虫羽化后，让雌雄个体交配1.5天，然后将约40只 L. sericata 蛹放入培养管中。寄生后12–24小时内，在体视显微镜下用无菌解剖针小心打开蛹壳的一端（图4）。
- 用手固定另一端，找到寄生蜂胚胎。用解剖针将胚胎从 L. sericata 蛹体组织表面转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌细胞滤筛中14。
注意：应使用较老的 L. sericata 蛹进行寄生，因为干燥的 L. sericata 蛹组织更利于胚胎转移。为确保胚胎能顺利从 L. sericata 蛹体组织表面转移，当用解剖针打开蛹壳时应尽量小心，避免刺破组织，以防组织间液流出。
- 将20–30个胚胎置于细胞滤筛上，先用1,000 µL的10%商用次氯酸钠溶液（见材料表）均匀清洗，随后再用1,000 µL的1×无菌PBS清洗一次；接着用1,000 µL的70%乙醇溶液清洗一次，并用1,000 µL的1×无菌PBS清洗三次。
- 首先，将一片已用1×PBS预湿的直径为5 mm的聚丙烯网片（见材料表）放入24孔板中。然后，使用灭菌的小毛刷，轻轻将细胞滤筛上的寄生蜂胚胎刷到聚丙烯网片上。此操作可在24孔板的一个垂直列的全部四个孔中同时进行。
3. 无菌黄蜂的培育
- 在超净工作台中，向24孔板的每个孔中加入50 µL NRM。为维持利于生长的湿润环境，需在每孔之间加入1 mL无菌水。此外，也可将一个含有30 mL无菌水的小烧杯与24孔板一同置于5 L的无菌塑料盒中。
- 整个实验过程中，将无菌塑料盒和24孔板置于恒温25 ± 2 °C、持续光照的培养箱中。
- 每天转移并添加NRM前，先在超净工作台中将冷冻保存的NRM解冻。在无菌环境下，使用经酒精消毒的镊子将带有幼虫的聚丙烯网膜从一个孔转移至另一个孔。最后，加入已平衡至室温的50 µL NRM（图3B）。每日重复上述操作，直至观察到蛹的形成。
注意：随着蜂类的发育，应适当增加NRM的用量，以确保无菌蜂获得充足的营养。例如，四龄幼虫需供给60至70 µL NRM。由于同一孔中可能存在不同发育阶段的个体，应使用灭菌毛刷将蛹移出，对剩余的幼虫补充少量NRM。操作中须采用无菌技术，防止微生物侵入和污染。 - 饲养9至11天后，超过80%的幼虫会发育为白色或黄色的蛹。此时，将滤膜转移至洁净的孔板中，停止添加培养基，静置等待羽化。
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结果
通过改进制备工具，显著提高了NRM的制备效率。此外，通过优化喂养策略和保存方法，消除了NRM在喂食过程中的污染问题。同时，调整后的NRM以L. sericata为宿主时，更符合无菌寄生蜂生长发育所需的营养比例。与使用GFRv2培养基并以NRMv3饲养的无菌寄生蜂相比，从幼虫到蛹阶段的存活率显著提高（图2）。此外，无菌寄生蜂的世代周期与常规饲养的寄生蜂无显著差异（约每14天一个世代）（图5）。这些改进对于发展Nasonia模式生物以及研究宿主-微生物互作机制具有重要意义。
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讨论
随着基因组学和代谢组学等高通量检测技术的应用，研究人员逐渐认识到肠道微生物群具有巨大的遗传多样性和代谢复杂性16。这些共生细菌通过与宿主之间的复杂相互作用，与宿主的多种生理或病理状态密切相关，例如营养代谢、肿瘤、免疫以及衰老等17。然而，由于每个自然个体中微生物的组成并不完全相同，因此针对宿主内微生物群体组成与功能网络的相关研究极为困难16。因此，亟需一个理想的模型来探索微生物与宿主之间的相互作用及相关机制。Nasonia 寄生蜂因其诸多生物学优势以及无菌蜂的特性，可作为微生物组研究领域的理想模型6。与抗生素处理相比，使用无菌动物能够精确控制微生物的组成和数量，这对于研究微生物功能至关重要。此外，抗生素处理可能引发多种副作用，包括抗生素耐药性、肠道功能障碍以及肠屏障损伤18。因此，开发一种更高效的方法以获得无菌寄生蜂，对于研究宿主-微生物组相互作用具有重要意义。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
资助：本工作得到中国国家自然科学基金（32270538）、国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2022YFF0710603）、北京市自然科学基金（6222046）以及中国科学院战略性先导科技专项资助 通过 CAS-CSIRO 资助项目（152111KYSB20210011）授予 G.H.W. 作者贡献：所有作者共同确定了综述的范围与重点，并参与了稿件的撰写。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 微米无菌真空滤器 | NEST | 331011 | |
| 10% 次氯酸钠 | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1× PBS 溶液 | Solarbio | P1020 | |
| 200 目尼龙网 | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 孔板 | NEST | 702001 | |
| 8、1.2、0.8 和 0.45 µm 滤膜 | 上海兴亚净化材料厂 | HN-AA-JT-10079 | |
| 无水乙醇 | Macklin | E809057-500ml | |
| 细胞滤筛 | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| 商用果蝇培养基 | Boer | B645446-500ml | |
| 解剖针 | Bioroyee | 17-9140 | |
| 蒜压器 | Taobao | 无目录编号 | 在淘宝购买 |
| 丝光绿蝇蛹 | 合肥大源生物科技有限公司 | 无目录编号 | 在淘宝购买 |
| 小型毛笔 | Cestidur | BL0508 | |
| 体视显微镜 | SOPTOP | RX50 | |
| 镊子 | SALMART | A109001-56 |
参考文献
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