方法文章

基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

DOI：

10.3791/65304

⸱

2023年5月12日

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本技术描述了一种有效的工作流程，利用基于荧光的活细胞成像方法，在HeLa细胞中对线粒体膜电位和超氧化物水平进行可视化及定量检测。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体是动态的细胞器，通过调控能量产生对代谢稳态至关重要 通过 ATP合成。为支持细胞代谢，多种线粒体质量控制机制协同作用，以维持健康的线粒体网络。其中一种通路是线粒体自噬，即PTEN诱导的激酶1（PINK1）和Parkin对受损线粒体进行磷酸化泛素化修饰，从而促进自噬体的包裹及随后从细胞中清除 通过 溶酶体融合。线粒体自噬对细胞稳态至关重要，而Parkin基因的突变与帕金森病（PD）相关。基于这些发现，研究线粒体损伤及更新以揭示线粒体质量控制的分子机制与动态过程已成为重要研究方向。本文采用活细胞成像技术，用于可视化HeLa细胞中的线粒体网络，并在使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理后，定量分析线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，还研究了与帕金森病相关的Parkin突变体（ParkinT240R) 抑制 Parkin 依赖性线粒体自噬的突变体，以确定与表达野生型 Parkin 的细胞相比，该突变体的表达如何影响线粒体网络。本文所述方案概述了一种基于荧光的简便工作流程，可有效量化线粒体膜电位和超氧化物水平。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生过程中发挥着关键作用1，先天免疫2,3以及细胞信号传导4,5线粒体功能失调已与帕金森病（Parkinson's disease, PD）等神经退行性疾病相关联。6,7帕金森病（PD）是一种影响多巴胺能神经元的进行性神经退行性疾病 黑质 影响全球近1亿人8帕金森病（PD）在遗传学上与线粒体自噬（mitophagy）相关联，后者是一种线粒体质量控制通路，对维持细胞稳态至关重要，可选择性清除受损的线粒体。9,10已有多项研究鉴定出多种独立的线粒体自噬通路，包括FUN14结构域包含蛋白1（FUNDC1）介导的线粒体自噬、Bcl-2相互作用蛋白3（BNIP3）促进的线粒体自噬、NIX依赖性线粒体自噬，以及已被充分表征的PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin调控的线粒体自噬。10,11PINK1（一种假定的激酶）与Parkin（一种E3泛素连接酶）协同作用，对受损线粒体进行磷酸化泛素修饰，从而促进自噬体的形成；自噬体包裹受损细胞器后与溶酶体融合，启动其降解过程12,13,14,15,16Parkin基因突变已与帕金森病相关的表型（如神经退行性变）相关联 通过 多巴胺能神经元的丧失17,18.

本文描述了一种实验方案，该方案使用来源于宫颈癌的常用永生化细胞——HeLa细胞，研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用。HeLa细胞内源性Parkin表达水平极低，因此需要外源性表达Parkin19。为了研究Parkin在线粒体网络健康中的功能，将HeLa细胞转染野生型Parkin（ParkinWT）、Parkin突变体（ParkinT240R）或空载对照载体。ParkinT240R是一种常染色体隐性青少年型帕金森病相关突变，会影响Parkin的E3泛素连接酶活性，显著降低线粒体自噬通路的效率20。随后对HeLa细胞施加轻度（5 µM）或重度（20 µM）浓度的羰基氰化物-间-氯苯腙（CCCP），CCCP是一种线粒体解偶联试剂。使用高浓度CCCP处理是诱导多种细胞系（如HeLa细胞和COS-7细胞）中Parkin介导的线粒体自噬的常用方法21,22,23。

处理后，本方案采用两种现有的线粒体靶向荧光染料对线粒体网络进行活体成像。四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）是一种阳离子染料，其荧光强度依赖于线粒体膜电位24；而 MitoSOX 是一种线粒体超氧化物指示剂，其荧光强度与超氧化物浓度相关25。最后，该方案采用基于荧光的定量方法和简化的操作流程，能够有效量化线粒体膜电位和超氧化物水平，最大限度地减少操作者偏差。尽管本方案设计用于研究 HeLa 细胞中的线粒体功能，但也可适用于其他细胞系和原代细胞类型，以定量表征线粒体网络的健康状态。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 生物样本的制备

注意：在生物安全柜中使用无菌技术进行以下步骤。用70%乙醇喷洒生物安全柜表面及所有材料。

  1. HeLa 细胞培养与转染
    1. 在含有 4.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清和 1% L-谷氨酰胺溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；见材料表）中培养 30,000 个 HeLa 细胞。将细胞接种于含 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像培养皿（见材料表）中。将 HeLa 细胞培养物维持在 5% CO2 和 37 °C 条件下26,27。
    2. 接种后第二天，使用光学显微镜检查 35 mm 成像培养皿，确保细胞融合度约为 50%–60%。达到融合度后，用空载黄色荧光蛋白（YFP）载体、YFP-ParkinWT 或 YFP-ParkinT240R 转染 HeLa 细胞（图 1A）。
    3. 每次转染前，在无菌微量离心管中分别配制两种混合液。通过轻弹管壁或轻微吹打混匀。
      1. 在 1 号管中，将 200 µL 低血清培养基（见材料表）与 2 µg 质粒 DNA 混合。
      2. 在 2 号管中，将 200 µL 低血清培养基与 6 µL 转染试剂（见材料表）混合28。
    4. 室温（RT）孵育 5 分钟。将 2 号管内容物加入 1 号管中，通过吹打混匀，并在室温下继续孵育 20 分钟。
    5. 将转染复合物逐滴加入已有的含 HeLa 细胞的成像培养皿中，确保在整个培养皿内均匀分布。将成像培养皿置于 5% CO2 和 37 °C 培养箱中过夜。
      注意：为每个培养皿标记所转染的质粒类型。每项实验中，标记三个 YFP-ParkinWT 培养皿（二甲基亚砜 [DMSO；见材料表]、5 µM CCCP 和 20 µM CCCP）。对三个 YFP-ParkinT240R 培养皿和三个空载 YFP 载体培养皿重复相同标记。
  2. CCCP 与荧光染料的配制
    警告：荧光染料通常对光敏感。应使用铝箔或棕色离心管避光保存，以减少光照暴露。
    1. 将 5 mg CCCP 溶解于 4.89 mL DMSO 中，配制成 5 mM 工作储备液（见材料表）。或将 5 mg CCCP 溶解于 1.22 mL DMSO 中，配制成 20 mM 工作储备液。
    2. 取 10 µL 1 mM MitoTracker Deep Red 储备液（见材料表），加入 390 µL DMSO 稀释，配制成 25 µM 工作储备液。
    3. 将 50 µg MitoSOX Red25（见材料表）溶解于 13 µL DMSO 中，配制成 5 mM 工作储备液。
    4. 将 10 mg TMRE24（见材料表）溶解于 19.4 mL DMSO 中，配制成 1 mM 储备液。取 10 µL 1 mM TMRE 加入 990 µL DMSO 中稀释，配制成 10 µM 工作储备液。

2. HeLa 细胞中使用 CCCP 处理及荧光探针标记线粒体

注意：请迅速执行以下步骤，以确保 HeLa 细胞在孵育箱外停留的时间不会过长。

  1. 转染后的第二天，向每个实验组培养板中加入 2 µL 的 5 mM 或 20 mM CCCP（终浓度分别为 5 µM 和 20 µM）。对照组培养板中加入 2 µL DMSO。将培养板放回 5% CO2、37 °C 培养箱中孵育 1.5 小时（图 1A）。
    注意：CCCP 处理总时长为 2 小时，但线粒体荧光探针标记在 CCCP 处理的最后 30 分钟进行。
  2. 孵育 1.5 小时后，从培养箱中取出培养板，并向成像用培养皿中加入荧光探针，随后将培养板放回 5% CO2、37 °C 培养箱中继续孵育 30 分钟（图 1A）。
    1. TMRE 实验：加入 2 µL 25 µM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 2 µL 10 µM TMRE（终浓度：10 nM）。
    2. MitoSOX 实验：加入 2 µL 25 µM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 1 µL 5 mM MitoSOX（终浓度：2.5 µM）。
  3. 完成 2 小时 CCCP 处理后，准备 HeLa 细胞进行成像（图 1A、B）。
    1. TMRE 实验：HeLa 细胞可直接用于成像；确保 TMRE 保留在 HeLa 细胞培养基中。
    2. MitoSOX 实验：用 2 mL 预热的 HeLa 培养基洗涤细胞 3 次，以去除游离的 MitoSOX 染料，然后加入 2 mL 预热的培养基。此时 HeLa 细胞已准备好进行成像。
      ​注意：使用新鲜的、预热的 HeLa 培养基洗涤细胞，该培养基中应含有与实验条件相同的 DMSO 或 CCCP 浓度；不要加入 MitoSOX 或 MitoTracker。

3. 共聚焦显微镜图像采集设置

注意：使用配备63倍/1.40数值孔径（NA）油浸物镜和环境培养室（见材料表）的共聚焦显微镜对HeLa细胞进行成像（见材料表）。

  1. 成像前 1 小时，打开二氧化碳气罐阀门以开启 CO2。按下 On 按钮，启动显微镜的环境控制器。使用触摸板上的 Up 和 Down Arrows 按钮将 温度 调节至 37 °C ，将 CO2 调节至 5%。设置完成后按下 Set 按钮。
    注意：确保环境培养箱的门已关闭，并等待环境条件稳定。
  2. 激光设置
    1. 开启 白光激光器（WLL），将 激光功率 设为 85% ，将 激发控制 设为 最大功率。点击 Acquire 选项卡，选择 Add Laser，在弹出的对话框中，将 WLL 切换为 On。点击 Laser Power 按钮，输入 85%。点击 Excitation Control 按钮，在下拉菜单中选择 Maximum Power（图 2A）。
    2. TMRE 实验：设置 YFP、MitoTracker 和 TMRE 的激发与发射光谱。
      1. 对于 YFP，将 激发激光设为 514 nm ，将 发射光谱窗口设为 524–545 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add New Setting 按钮，然后点击 Add Laser 并将其拖入 Setting 1。双击 Excitation Line，在对话框中输入波长 514 。双击对应的 detector ，起始波长输入 524 ，终止波长输入 545 。
      2. 对于 MitoTracker Deep Red，将 激发 激光设为 641，将 发射 光谱窗口设为 650–750 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add Laser 按钮并将其拖入 Setting 1。双击 Excitation Line ，在对话框中输入 641 作为 波长 。双击对应的 detector，起始波长输入 650 ，终止波长输入 750 。
      3. 对于 TMRE，将 激发 激光设为 555 nm，将 发射 光谱窗口设为 557–643 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add New Setting 按钮，然后点击 Add Laser 按钮并将其拖入 Setting 2。双击 Excitation Line ，在对话框中输入波长 555 。双击对应的 detector ，起始波长输入 557 ，终止波长输入 643 。
    3. MitoSOX 实验：设置 YFP、MitoTracker 和 MitoSOX 的激发与发射光谱（图 2B）。
      1. 对于 YFP，将 激发 激光设为 507 nm，将 发射 光谱窗口设为 517–540 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add New Setting 按钮，然后点击 Add Laser 按钮并将其拖入 Setting 1。双击 Excitation Line，在对话框中输入波长 507 。双击对应的 detector ，起始波长输入 517，终止波长输入 540。
      2. 对于 MitoSOX，将 激发 激光设为 547 nm ，将 发射 光谱窗口设为 564–636 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add New Setting 按钮，然后点击 Add Laser 按钮并将其拖入 Setting 2。双击 Excitation Line ，在对话框中输入波长 547 。双击对应的 detector ，起始波长输入 564 ，终止波长输入 636 。
      3. 对于 MitoTracker Deep Red，将 激发 激光设为 641 nm ，将 发射 光谱窗口设为 652–742 nm。在 Acquire 选项卡中，点击 Add New Setting 按钮，点击 Add Laser 按钮并将其拖入 Setting 3。双击 Excitation Line ，在对话框中输入波长 641 。双击对应的 detector ，起始波长输入 652 ，终止波长输入 742 。
  3. 图像采集设置（图 2C）
    1. 将 格式 设为 1,024 × 1,024，将 扫描速度设为 600 Hz，将 线平均设为 3。
      1. 选择 Acquisition 选项卡，点击 Format 按钮。从下拉菜单中选择 1,024 × 1,024。点击 Speed 按钮，从下拉菜单中选择 600 。然后点击 Line Average 按钮，从下拉菜单中选择 3。
      2. 开启 双向扫描 ，并将 相位 和 缩放因子分别设为 22.61 和 1.50。
        1. 在 Acquisition 选项卡中，将 Bidirectional 按钮切换为 On。点击 Phase X 设置，将其设为 22.61。点击 Zoom Factor 设置，将其设为 1.50。

4. 图像采集

警告：实验人员必须根据YFP荧光信号进行视觉判断以选择细胞。应避免像素过饱和，因为这会显著影响荧光强度的定量分析。使用过/欠查找表（look-up table）来指示像素饱和情况，以避免采集到饱和的图像。

  1. 点击感兴趣的Setting，然后按Fast Live 以获取荧光图像的实时预览。
  2. 通过双击相应的detector来调节gain和intensity。在弹出的对话框中，使用滑块调节Gain。要更改intensity，请双击Excitation Line ，然后在弹出窗口中使用Up和Down Arrows调整强度。点击Stop结束预览。
    1. TMRE实验：首先成像DMSO control孔板。调节TMRE signal（Setting 2）的gain和intensity，使mitochondrial network intensity处于接近饱和但未饱和的水平；在整个实验过程中保持gain和intensity不变。调节MitoTracker和YFP（Setting 1）的gain和intensity，使线粒体网络可见但较暗。
    2. MitoSOX实验：首先成像DMSO control孔板。调节MitoSOX（Setting 2）signal的gain和intensity，使fluorescence信号可见但较暗；在整个实验过程中保持gain和intensity恒定。调节YFP（Setting 1）和MitoTracker（Setting 3）的gain和intensity，使mitochondrial network信号可见但较暗。
      注：记录TMRE和MitoSOX的gain和intensity值，这些参数在整个实验中必须保持不变。本方案不对YFP和MitoTracker的荧光信号进行定量分析，因此其gain和intensity可针对每张图像单独调整。最有效的设置是使gain和intensity处于细胞易于观察但仍较暗的水平，以确保细胞不会暴露于过强的激光强度下，从而避免细胞损伤或光漂白。
  3. 完成gain和intensity设置后，点击Start开始采集图像。每种实验条件下采集20个细胞的图像（例如，五张图像，每张包含四个细胞；图2D）。

5. 使用 ImageJ 进行荧光强度定量分析

注意：成像文件以".lif"格式保存，可与ImageJ29兼容。ImageJ支持的文件类型在其官方网站上有详细说明。若文件类型不兼容，可能需要进行格式转换。

  1. 创建并保存一个感兴趣区域（ROI）。
    1. 在 ImageJ 中，点击 文件 | 新建 | 图像。在出现的对话框中，点击 确定。
    2. 点击 矩形工具 按钮，绘制一个 6 微米 × 6 微米的方框。 通过点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 打开 ROI 管理器，并等待 ROI 管理器对话框出现（图 3A）。在管理器对话框中点击 添加，将 矩形 ROI 添加至管理器。选择 更多，然后点击 保存  按钮并点击 确定，以保存 ROI。
  2. 测量荧光强度。
    1. 在 ImageJ 中，点击 文件 并选择 打开。在对话框中选择实验的成像文件，然后点击 打开。
    2. 等待 Bio-formats 导入选项 窗口出现（图 3B）。选择 拆分通道，然后点击 打开。
      注：拆分通道功能可将图像中的每个通道作为独立窗口打开。通道顺序对应于采集顺序。
      1. TMRE 实验：YFP（设置 1）为第一通道（c = 0）；MitoTracker（设置 1）为第二通道（c = 1）；TMRE（设置 2）为第三通道（c = 2）。
      2. MitoSOX 实验：YFP（设置 1）为第一通道（c = 0）；MitoSOX（设置 2）为第二通道（c = 1）；MitoTracker（设置 3）为第三通道（c = 2）。
    3. 通过选择 图像 | 调整 | 亮度 来调节亮度（图 3C）。
      注：请勿点击 设定  或 应用 ，以确保图像亮度不会被永久更改。有时 TMRE 或 MitoSOX 通道中的荧光强度不可见，可调节亮度以便更清晰地观察。调节亮度不会影响原始荧光强度数值。
    4. 点击 分析 并选择 设置测量值。勾选 面积 和 平均灰度值 选项，然后点击 确定（图 3D）。
      注：平均灰度值即为荧光强度。
    5. 打开 ROI 管理器，通过点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 加载步骤 5.1 中保存的 ROI。在 ROI 管理器 中，点击 更多，然后从下拉列表中选择 打开 ，并选择已保存的 ROI。
    6. 在单个细胞中测量五个随机区域的荧光强度：从 ROI 管理器中选择已保存的 ROI，并将其移动至细胞内的任意位置（图 3E）。按下 M 键测量荧光强度。重复此步骤，再测量四个互不重叠的区域。当出现包含面积和平均灰度值的对话框时（图 3F），将数值复制并粘贴至电子表格中用于分析。
      1. TMRE 实验：选择图像（c = 2）。
      2. MitoSOX 实验：选择图像（c = 2）。
    7. 获取平均荧光强度值。使用电子表格软件（参见 材料表），对五个平均灰度值取平均。对每个细胞重复此过程。
    8. 使用统计分析软件（参见 材料表；图 4 和 图 5）分析并比较不同实验条件下 TMRE 或 MitoSOX 的平均灰度值。以柱状图或小提琴图形式展示数据。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，采用基于荧光的定量方法检测经CCCP处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该实验流程使用HeLa细胞，即一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa细胞常用于研究线粒体生物学，且其细胞形态较扁平，便于通过显微镜观察线粒体网络。为探究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用，HeLa细胞被瞬时转染空对照载体、ParkinWT或ParkinT240R（一种破坏线粒体自噬的突变体）21。将HeLa细胞接种于35 mm玻璃底成像培养皿中，当细胞融合度达到约50%–60%时进行转染（图1A）。由于HeLa细胞增殖迅速，转染通常在接种至成像培养皿后的第二天进行。次日使用倒置显微镜观察YFP荧光信号，以评估转染效率。仅在转染成功后进行后续实验。

经检查后，用低浓度（5 µM）或高浓度（20 µM）的CCCP处理HeLa细胞，以去极化线粒体网络（步骤 1.2 提供了制备...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案可用于基于荧光成像技术，稳健且可重复地定量线粒体膜电位和超氧化物水平30。在设计此类实验时，需考虑若干重要的技术限制因素。HeLa细胞分别转染空YFP载体、YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R。使用空YFP载体作为对照，以确认实验结果特异性地源于Parkin的作用。在瞬时转染过程中，经实验确定DNA与转染试剂的质量比为1:3时转染效率最高，每种构建体使用2 µg质粒DNA28。保持所有构建体使用相同的YFP标签至关重要，因为不同荧光蛋白的本征亮度存在差异31,32。若必须使用多种荧光蛋白标签，则应选择亮度和光稳定性相近的荧光蛋白33。

为了检测线粒体膜电位和超氧化物水平，选用了两种已有充分文献记录的染料。TMRE 的荧光信号依赖于线粒体膜电位，而 Mito...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Evans 实验室成员对本文手稿提出的宝贵意见。本工作由杜克大学怀特海德学者项目、杜克大学科学与技术学者项目以及霍华德·休斯医学研究所（HHMI）汉娜·格雷博士后奖学金资助。图1A 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学品、多肽和重组蛋白
CCCP（羰基氰化物间氯苯腙） Sigma-AldrichC2759
含4.5 g/L葡萄糖的DMEM（1×）Gibco11-965-084
无水DMSOThermoFisher ScientificD12345
胎牛血清HycloneSH3007103
FuGENE 6（转染试剂）PromegaE2691
GlutaMAX 100×（L-谷氨酰胺溶液） Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM（减血清培养基）ThermoFisher scientific31985070
四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE） ThermoFisher ScientificT669
实验模型：生物体/品系
HeLa-M（Homo sapiens）A. Peden（剑桥医学研究所）N/A
重组DNA
EYFP空载体N/AN/A
YFP-Parkin T240R本文通过定点诱变由YFP-Parkin构建
YFP-Parkin WTAddgene；PMID:19029340RRID:Addgene_23955
软件与算法
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel（电子表格软件）Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9（统计分析软件）GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
其他
35 mm培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径20 mm，未包被MatTekP35G-1.5-20-C
培养箱（环境控制腔室）Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL倒置显微镜LeicaN/A
LIGHTNING去卷积软件LeicaN/A
STELLARIS 8共聚焦显微镜LeicaN/A

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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