基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

摘要

本技术描述了一种有效的工作流程，利用基于荧光的活细胞成像方法，在HeLa细胞中对线粒体膜电位和超氧化物水平进行可视化及定量检测。

摘要

线粒体是动态的细胞器，通过调控能量产生对代谢稳态至关重要 通过 ATP合成。为支持细胞代谢，多种线粒体质量控制机制协同作用，以维持健康的线粒体网络。其中一种通路是线粒体自噬，即PTEN诱导的激酶1（PINK1）和Parkin对受损线粒体进行磷酸化泛素化修饰，从而促进自噬体的包裹及随后从细胞中清除 通过 溶酶体融合。线粒体自噬对细胞稳态至关重要，而Parkin基因的突变与帕金森病（PD）相关。基于这些发现，研究线粒体损伤及更新以揭示线粒体质量控制的分子机制与动态过程已成为重要研究方向。本文采用活细胞成像技术，用于可视化HeLa细胞中的线粒体网络，并在使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理后，定量分析线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，还研究了与帕金森病相关的Parkin突变体（Parkin^T240R) 抑制 Parkin 依赖性线粒体自噬的突变体，以确定与表达野生型 Parkin 的细胞相比，该突变体的表达如何影响线粒体网络。本文所述方案概述了一种基于荧光的简便工作流程，可有效量化线粒体膜电位和超氧化物水平。

引言

线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生过程中发挥着关键作用¹，先天免疫^2,3以及细胞信号传导^4,5线粒体功能失调已与帕金森病（Parkinson's disease, PD）等神经退行性疾病相关联。^6,7帕金森病（PD）是一种影响多巴胺能神经元的进行性神经退行性疾病 黑质 影响全球近1亿人⁸帕金森病（PD）在遗传学上与线粒体自噬（mitophagy）相关联，后者是一种线粒体质量控制通路，对维持细胞稳态至关重要，可选择性清除受损的线粒体。^9,10已有多项研究鉴定出多种独立的线粒体自噬通路，包括FUN14结构域包含蛋白1（FUNDC1）介导的线粒体自噬、Bcl-2相互作用蛋白3（BNIP3）促进的线粒体自噬、NIX依赖性线粒体自噬，以及已被充分表征的PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin调控的线粒体自噬。^10....

方案

1. 生物样本的制备

注意：在生物安全柜中使用无菌技术进行以下步骤。用70%乙醇喷洒生物安全柜表面及所有材料。

1. HeLa 细胞培养与转染
   1. 在含有 4.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清和 1% L-谷氨酰胺溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；见材料表）中培养 30,000 个 HeLa 细胞。将细胞接种于含 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像培养皿（见材料表）中。将 HeLa 细胞培养物维持在 5% CO₂ 和 37 °C 条件下^26,27。
   2. 接种后第二天，使用光学显微镜检查 35 mm 成像培养皿，确保细胞融合度约为 50%–60%。达到融合度后，用空载黄色荧光蛋白（YFP）载体、YFP-Parkin^WT 或 YFP-Parkin^T240R 转染 HeLa 细胞（图 1A）。
   3. 每次转染前，在无菌微量离心管中分别配制两种混合液。通过轻弹管壁或轻微吹打混匀。
      1. 在 1 号管中，将 200 µL ....

结果

在本实验方案中，采用基于荧光的定量方法检测经 CCCP 处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该实验流程使用 HeLa 细胞，即一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa 细胞被广泛用于线粒体生物学研究，且其细胞形态较为扁平，便于通过显微镜观察线粒体网络。为研究 Parkin 在维持线粒体网络健康中的作用，HeLa 细胞被短暂转染空载体对照、Parkin^WT 或 Parkin^T240R（一种破坏线粒体自噬的突变体）²¹。将 HeLa 细胞接种于 35 mm 玻璃底成像培养皿中，当细胞融合度达到约 50%–60% 时进行转染（图1A）。由于 HeLa 细胞增殖迅速，转染通常在接种至成像培养皿后的第二天进行。次日使用倒置显微镜观察 YFP 荧光信号，以评估转染效率。仅在转染成功后进行后续实验。

经检查后，用低浓度（5 µM）或高浓度（20 µM）的CCCP处理HeLa细胞.......

讨论

本方案可用于基于荧光成像技术，稳健且可重复地定量线粒体膜电位和超氧化物水平³⁰。在设计此类实验时，需考虑若干重要的技术限制因素。HeLa细胞分别转染空YFP载体、YFP-Parkin^WT或YFP-Parkin^T240R。使用空YFP载体作为对照，以确认实验结果特异性地源于Parkin的作用。在瞬时转染过程中，经实验确定DNA与转染试剂的质量比为1:3时转染效率最高，每种构建体使用2 µg质粒DNA²⁸。保持所有构建体使用相同的YFP标签至关重要，因为不同荧光蛋白的本征亮度存在差异^31,32。若必须使用多种荧光蛋白标签，则应选择亮度和光稳定性相近的荧光蛋白³³。

为了检测线粒体膜电位和超氧化物水平，选用了两种已有充分文献记录的染料。TMRE 的荧光信号依赖于线粒体膜电位，而 Mito.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学品、多肽和重组蛋白
CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）	Sigma-Aldrich	C2759
含4.5 g/L葡萄糖的DMEM（1×）	Gibco	11-965-084
无水DMSO	ThermoFisher Scientific	D12345
胎牛血清	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6（转染试剂）	Promega	E2691
GlutaMAX 100×（L-谷氨酰胺溶液）	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM（减血清培养基）	ThermoFisher scientific	31985070
四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）	ThermoFisher Scientific	T669
实验模型：生物体/品系
HeLa-M（Homo sapiens）	A. Peden（剑桥医学研究所）	N/A
重组DNA
EYFP空载体	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	本文	通过定点诱变由YFP-Parkin构建
YFP-Parkin WT	Addgene；PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
软件与算法
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel（电子表格软件）	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9（统计分析软件）	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
其他
35 mm培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径20 mm，未包被	MatTek	P35G-1.5-20-C
培养箱（环境控制腔室）	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL倒置显微镜	Leica	N/A
LIGHTNING去卷积软件	Leica	N/A
STELLARIS 8共聚焦显微镜	Leica	N/A