使用HeLa细胞中的实时成像对线粒体膜电位和超氧化物水平进行基于荧光的定量

摘要

该技术描述了一种有效的工作流程，使用基于荧光的实时成像可视化和定量测量HeLa细胞内的线粒体膜电位和超氧化物水平。

摘要

线粒体是通过ATP合成 控制 能量产生，对代谢稳态至关重要的动态细胞器。为了支持细胞代谢，各种线粒体质量控制机制合作以维持健康的线粒体网络。其中一种途径是线粒体自噬，其中PTEN诱导的激酶1（PINK1）和受损线粒体的Parkin磷酸化泛素化促进自噬体隔离并随后通过溶酶体融合 从 细胞中去除。线粒体自噬对细胞稳态很重要，帕金的突变与帕金森病（PD）有关。由于这些发现，人们非常重视研究线粒体损伤和周转，以了解线粒体质量控制的分子机制和动力学。在这里，活细胞成像用于可视化HeLa细胞的线粒体网络，以量化线粒体解偶联剂羰基氰间氯苯基腙（CCCP）处理后的线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，表达抑制帕金依赖性线粒体自噬的帕金PD连锁突变（Parkin^T240R）以确定与表达野生型帕金的细胞相比突变如何影响线粒体网络。此处概述的方案描述了一种简单的工作流程，使用基于荧光的方法有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平。

引言

线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生¹，先天免疫²，³和细胞信号传导^4，5中起着至关重要的作用。线粒体失调与帕金森病（^PD）等神经退行性疾病有关6^，7。PD是一种进行性神经退行性疾病，影响黑质的多巴胺能神经元，^{影响全球近}1000万人8。PD与线粒体自噬有遗传联系，线粒体自噬是维持细胞稳态所必需的线粒体质量控制途径，选择性地去除受损的线粒体^9，10。研究已经确定了多种独立的线粒体自噬途径，包括含有 1 （FUNDC1） 介导的线粒体自噬的 FUN14 结构域、Bcl-2 相互作用蛋白 3 （BNIP3） 促进的线粒体自噬、NIX 依赖性线粒体自噬以及特征明确的 PTEN 诱导激酶 1 （PINK1）/帕金调节线粒体自噬^10，11。PINK1（一种假定的激酶）和帕金（一种E3泛素连接酶）与磷酸泛素受损线粒体协同工作，后者驱动自噬体的形成，吞噬受损细胞器并与溶酶体融合以启动降解¹²，^13，14，^15，16。帕金的突变与PD相关的表型有关，例如通过多巴胺能神经元丢失引起的神经变性^17，18。

在这里，描述了一个协议，其中HeLa细胞，常规使用的源自宫颈癌的永生化细胞，用于研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用。HeLa细胞表达的内源性帕金水平可以忽略不计，因此需要外源性帕金表达¹⁹。为了研究Parkin在线粒体网络健康中的作用，用野生型Parkin（Parkin^WT），Parkin突变体（Parkin^T240R）或空对照载体转染HeLa细胞。Parkin^T240R是一种常染色体隐性幼年帕金森综合征突变，影响Parkin E3连接酶活性，显着降低线粒体自噬途径的效率²⁰。HeLa细胞暴露于轻度（5μM）或严重（20μM）浓度的羰基氰间氯苯基腙（CCCP），一种线粒体解偶联剂。用高浓度的CCCP处理通常用于在各种细胞系中诱导帕金介导的线粒体自噬，例如HeLa和COS-7细胞²¹，^22，23。

治疗后，该方案使用两种当前可用的线粒体靶向荧光染料对线粒体网络进行实时成像。四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐 （TMRE） 是一种阳离子染料，其荧光基于线粒体膜电位²⁴，而 MitoSOX 是一种线粒体超氧化物指示剂，其中荧光强度是超氧化物浓度²⁵ 的函数。最后，概述的方案使用基于荧光的定量和简单的工作流程来有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平，而用户偏差的范围最小。尽管该协议旨在研究HeLa细胞中的线粒体功能，但它可以适用于其他细胞系和原代细胞类型，以定量表征线粒体网络健康。

方案

1. 生物样品的制备

注意:在生物安全柜中使用无菌技术执行以下步骤。用70%乙醇喷洒机柜表面和所有材料。

1. HeLa细胞培养和转染
   1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养30，000个HeLa细胞，含有4.5g / L葡萄糖，补充有10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺溶液（HeLa培养基;参见 材料表）。将细胞铺在含有 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像皿（参见材料 T 上）。将HeLa培养物保持在5%CO₂ 和37°C^26，27。
   2. 电镀后的第二天，使用光学显微镜检查35毫米成像皿，以确保细胞~50%-60%汇合。汇合后，用空的黄色荧光蛋白（YFP）载体，YFP-Parkin^WT或YFP-Parkin^T240R 转染HeLa细胞（图1A）。
   3. 每次转染时，在无菌微量离心管中制备两种单独的混合物。通过敲击试管或轻轻上下移液进行混合。
      1. 在管 1 中，将 200 μL 还原血清培养基（参见 材料表）与 2 μg 质粒 DNA 混合。
      2. 在试管 2 中，将 200 μL 还原血清培养基与 6 μL 转染试剂混合（参见 材料表）²⁸。
   4. 将试管在室温（RT）下孵育5分钟。将管2加入管1中，通过上下移液混合，并在室温下孵育20分钟。
   5. 将转染复合物滴加到含有HeLa细胞培养物的现有成像培养皿中，确保在整个培养皿中均匀分布。将成像培养皿置于5%CO₂ 和37°C培养箱中过夜。
      注意:用适当的转染质粒标记每个培养皿。对于每个实验，标记三个YFP-Parkin^WT 培养皿（二甲基亚砜[DMSO;见 材料表]，5μM CCCP和20μM CCCP）。用三个YFP-Parkin^T240R 培养皿和三个空的YFP载体培养皿重复标签。
2. CCCP和荧光染料的制备
   注意:荧光染料通常对光敏感。使用铝箔或棕色离心管将染料存放在黑暗中，以减少暴露在光线下。
   1. 通过将 5 mg CCCP 溶解在 4.89 mL DMSO 中，制备 5 mM 的 CCCP 工作储备液（参见 材料表）。通过将 5 mg CCCP 溶解在 1.22 mL DMSO 中，制备 20 mM 的 CCCP 工作储备液。
   2. 在 390 μL DMSO 中稀释 10 μL 1 mM MitoTracker 深红色（参见 材料表）储备溶液，制成 25 μM 工作储备液。
   3. 将 50 μg MitoSOX 红²⁵ （参见 材料表）溶解在 13 μL DMSO 中，以创建 5 mM 工作储备液。
   4. 将 10 mg TMRE²⁴ （参见 材料表）溶解在 19.4 mL DMSO 中，制成 1 mM 储备溶液。通过将 10 μL 1 mM TMRE 加入 990 μL DMSO 中来稀释 TMRE，制成 10 μM 工作储备液。

2. HeLa细胞中荧光探针的CCCP处理和线粒体标记

注意:快速执行以下步骤，以确保HeLa细胞不会长时间离开培养箱。

1. 转染后第二天，向每个实验板中加入 2 μL 的 5 或 20 mM CCCP（终浓度:分别为 5 μM 和 20 μM）。对于对照板，加入 2 μL DMSO。将板返回到5%CO₂ 和37°C培养箱中1.5小时（图1A）。
   注意:CCCP治疗总共2小时。然而，在CCCP治疗的最后30分钟内用荧光探针标记线粒体。
2. 1.5小时后，从培养箱中取出板并将荧光探针添加到成像培养皿中。将板返回到5%CO₂ 和37°C培养箱中30分钟（图1A）。
   1. TMRE 实验:加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度:25 nM）和 2 μL 10 μM TMRE（最终浓度:10 nM）。
   2. MitoSOX 实验:加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度:25 nM）和 1 μL 5 mM MitoSOX（最终浓度:2.5 μM）。
3. 在2小时CCCP处理后，准备HeLa细胞进行成像（图1A，B）。
   1. TMRE实验:HeLa细胞立即准备好成像;确保TMRE保留在HeLa细胞培养基中。
   2. MitoSOX 实验:用 2 mL 预热的 HeLa 培养基洗涤细胞 3 倍，以去除游离的 MitoSOX 染料。加入 2 mL 预热培养基。HeLa细胞现在已准备好成像。
      注意:用新鲜的预热HeLa培养基洗涤HeLa细胞，该培养基含有与实验条件相同的DMSO或CCCP浓度;不包括 MitoSOX 或 MitoTracker。

3. 共聚焦显微镜图像采集设置

注意:使用配备63x/1.40数值孔径（NA）油浸物镜和环境室（见材料表）的共聚焦显微镜（见材料表）对HeLa细胞进行成像。

1. 在成像前1小时，通过打开罐阀打开CO₂。按开按钮打开显微镜的环境控制器。使用触摸板上的向上和向下箭头将温度调节到 37 °C，将 _{CO 2} 调节到 5%。完成后按设置。
   注意:确保环境室的门已关闭，并等待条件稳定下来。
2. 激光设置
   1. 打开 白光激光器 （WLL）并将 激光 功率设置为 85%， 将 激发控制 设置为 最大功率。单击" 获取 "选项卡，选择 "添加激光器"，然后在出现的对话框中，将 WLL 切换为 "开"。单击 激光功率 按钮并输入 85%。单击 励磁控制 按钮，然后从下拉菜单中选择 最大功率 （图2A）。
   2. TMRE实验: 设置YFP，MitoTracker和TMRE的激发和发射光谱。
      1. 对于YFP，将激发激光设置为514 nm，将发射光谱窗口设置为524-545 nm。 在"获取"选项卡中，单击"添加新设置"按钮;然后，单击添加激光并将其拖到设置 1 中。双击激发线并在对话框中输入 514 作为波长。双击相应的检测器，输入 524 作为起始波长，输入 545 作为结束波长。
      2. 对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641，将发射光谱窗口设置为650-750 nm。在"获取"选项卡中，单击"添加激光"按钮并将其拖到"设置1"中。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 650 作为开始波长，输入 750 作为结束波长。
      3. 对于TMRE，将激发激光设置为555 nm，将发射光谱窗口设置为557-643 nm。在"获取"选项卡中，单击"添加新设置"按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 2.双击激发线，然后在对话框中输入 555 作为波长。双击相应的检测器，输入 557 作为起始波长，输入 643 作为结束波长。
   3. MitoSOX 实验: 设置YFP，MitoTracker和MitoSOX的激发和发射光谱（图2B）。
      1. 对于YFP，将激发激光设置为507 nm，将发射光谱窗口设置为517-540 nm。在"获取"选项卡中，单击"添加新设置"按钮;然后，单击 添加激光 按钮并将其拖到设置 1。双击激发线并在对话框中输入 507 作为波长。双击相应的检测器，输入 517 作为起始波长，输入 540 作为结束波长。
      2. 对于 MitoSOX，将 激发 激光设置为 547 nm， 将发射 光谱窗口设置为 564-636 nm。在" 获取 "选项卡中，单击" 添加新设置 "按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到 设置 2.双击 激发线并在对话框中输入 547 作为波长。双击相应的 检测器 ，输入 564 作为起始波长，输入 636 作为结束波长。
      3. 对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641 nm，将发射光谱窗口设置为652-742 nm。 在"获取"选项卡中，单击"添加新设置"按钮;点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 3。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 652 作为起始波长，输入 742 作为结束波长。
3. 图像采集设置（图2C）
   1. 将 格式 设置为 1，024 x 1，024， 将扫描速度 设置为 600 Hz，将 线平均值 设置为 3。
      1. 选择" 采集"选项卡，然后单击" 格式 "按钮。从下拉菜单中，选择 1，024 x 1，024。单击 速度 按钮，然后从下拉菜单中选择 600 。然后，单击 线平均值 按钮，然后从下拉菜单中选择 3。
      2. 打开 双向扫描 并将 相位 和 变焦系数 分别设置为 22.61 和 1.50。
         1. 在" 采集"选项卡中，将" 双向 "按钮切换为 "开"。单击 阶段 X 设置并将其设置为 22.61。单击 缩放系数 设置并将其设置为 1.50。

4. 图像采集

注意:实验者必须根据YFP荧光信号做出视觉判断以选择细胞。避免像素过饱和，因为它们会显着影响荧光强度定量。使用指示像素饱和度的过/欠查找表，以避免获取饱和图像。

1. 单击感兴趣的 设置 ，然后按快速实时以提供荧光图像的 实时预览。
2. 通过双击相应的检测器来调整增益和强度。在出现的对话框中，使用滑块调整增益。要更改强度，请双击激发线并使用弹出窗口中的向上和向下箭头更改强度。单击"停止"结束预览。
   1. TMRE实验:首先对DMSO控制板进行成像。调整TMRE信号的增益和强度（设置2），使线粒体网络强度略低于饱和度; 保持实验的增益和强度恒定。调整丝线虫追踪器和YFP的增益和强度（设置1），使线粒体网络可见但暗淡。
   2. MitoSOX 实验:首先对 DMSO 控制板进行成像。调整 MitoSOX（设置 2）信号的增益和强度，使荧光可见但暗淡;保持实验的增益和强度恒定。调整YFP（设置1）和MitoTracker（设置3）的增益和强度，使线粒体网络可见但暗淡。
      注意:记录TMRE和MitoSOX的增益和强度，因为这些值在整个实验过程中必须保持不变。YFP和MitoTracker的荧光信号在该协议中未量化。因此，可以针对每个图像调整增益和强度。最有效的是具有增益和强度设置，其中细胞 易于看到但仍很暗，以确保细胞不会暴露在导致细胞损伤或光漂白的过度激光强度下。
3. 增益和强度设置完成后，单击 "开始 "以获取图像。每个实验条件获取 20 个细胞的图像（例如，五个图像，每个图像四个细胞; 图 2D）。

5. 使用 ImageJ 进行荧光强度定量

注意:图像文件保存为".lif"，并与 ImageJ²⁹ 兼容。与 ImageJ 兼容的文件类型在其网站上指定。如果文件类型不兼容，则可能需要转换文件类型。

1. 创建并保存感兴趣区域 （ROI）。
   1. 在 ImageJ 中，单击" 文件"|"新品 |图像。 在弹出的对话框中，单击" 确定"。
   2. 单击矩形工具按钮并绘制一个 6 微米 x 6 微米的框。通过单击"分析"|"工具 |ROI 管理器，然后等待出现带有 ROI 管理器的对话框（图 3A）。通过单击管理器对话框中的添加将矩形 ROI 添加到管理器。通过选择"更多"来保存投资回报率，然后单击"保存"按钮和"确定"。
2. 测量荧光强度。
   1. 在图像 J 中，单击 文件 并选择 打开。在对话框中，选择实验的映像文件，然后单击" 打开"。
   2. 等待 "生物格式导入选项" 窗口出现（图3B）。选择 拆分通道 ，然后单击 打开。
      注意:拆分通道功能允许将图像中的每个通道作为单独的窗口打开。通道顺序对应于获取顺序。
      1. TMRE 实验: YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoTracker （设置 1）是第二个通道 （c = 1）;TMRE（设置 2）是第三个通道 （c = 2）。
      2. MitoSOX 实验: YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoSOX （设置 2）是第二个通道 （c = 1）; MitoTracker （设置3）是第三个通道（c = 2）。
   3. 通过选择 "图像 |调整 |亮度 （图3C）。
      注:请勿按" 设置"或 "应用"以确保图像亮度不会永久更改。有时，荧光强度在TMRE或MitoSOX通道中不可见。调整亮度以简化可视化。改变亮度不会影响原始荧光强度值。
   4. 单击 分析 ，然后选择 设置测量。选中 面积 和 平均灰度值 框，然后单击 确定 （图 3D）。
      注意:平均灰度值是荧光强度。
   5. 打开 ROI 管理器 ，然后通过单击 "分析"|"工具 |投资回报率经理。在 ROI 管理器中，单击 更多， 然后从显示的列表中单击 打开，然后选择保存的 ROI。
   6. 通过从ROI管理器中选择保存的ROI来测量单个细胞中五个随机区域的荧光强度，并将ROI移动到细胞内的随机位置（图3E）。按 M测量荧光强度。对另外四个不重叠区域重复此步骤。当出现包含面积和平均灰度值的对话框（图 3F）时，将这些值复制并粘贴到电子表格中进行分析。
      1. TMRE 实验:选择图像（c = 2）。
      2. MitoSOX 实验:选择图像 （c = 2）。
   7. 获得平均荧光强度值。使用电子表格软件（参见 材料表），平均五个平均灰度值。对每个单元格重复此过程。
   8. 使用统计软件程序分析和比较实验条件下的TMRE或MitoSOX平均灰度值（参见 材料表;图 4 和 图 5）。将数据显示为条形图或小提琴图。

结果

在该协议中，基于荧光的定量用于测量CCCP处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该工作流程使用了HeLa细胞，这是一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa细胞通常用于研究线粒体生物学，并且相对平坦，因此很容易使用显微镜可视化线粒体网络。为了研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用，用空对照载体Parkin^WT或Parkin^T240R （一种破坏线粒体自噬的突变体）瞬时转染HeLa细胞²¹。将HeLa细胞接种在35mm玻璃底成像培养皿中，并在达到~50%-60%汇合度后转染（图1A）。由于HeLa细胞快速分裂，这通常是将细胞接种到成像培养皿中的第二天。第二天使用光学显微镜观察YFP荧光信号，以评估转染效率。实验仅在成功转染后进行。

检查后，用轻度（5μM）或重度（20μM）浓度的CCCP处理HeLa细胞以使线粒体网络去极化（步骤1.2显示了制备CCCP和荧光探针的...

讨论

此处概述的工作流程可用于使用基于荧光的成像稳定且可重复地量化线粒体膜电位和超氧化物水平³⁰。在设计这些实验时，需要考虑重要的技术限制。用空的YFP载体YFP-Parkin^WT或YFP-Parkin^T240R转染HeLa细胞。空的YFP载体被用作对照，以确认实验结果是帕金特有的。对于瞬时转染，通过实验确定DNA与转染试剂的质量比为1:3，以产生最高的转染率，其中每个构建体使用2 μg质粒^DNA28。保持所有构建体的YFP标签一致很重要，因为荧光蛋白的先天亮度不同^31，32。如果必须使用多个荧光蛋白标签，则应选择具有相似亮度和光稳定性的荧光蛋白³³。

为了测量线粒体膜电位和超氧化物水平，选择了两种有据可查的染料。TMRE的荧光信号基于线粒体膜电位，而MitoSOX荧光强度是超氧化物水平...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学品、肽和重组蛋白
CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM （1x）	Gibco	11-965-084
DMSO，无水	ThermoFisher Scientific	D12345
胎牛血清	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6（转染试剂）	Promega	E2691
GlutaMAX 100x（L-谷氨酰胺溶液）	Gibco 公司	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX 红色	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM（稀释血清培养基）	ThermoFisher scientific	31985070
四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐 （TMRE）	ThermoFisher Scientific	T669
实验模型：生物体/菌株
HeLa-M（智人）	A. Peden（剑桥医学研究所）	N/A
重组 DNA
EYFP 空载体	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	本文	由 YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	;PMID：19029340	RRID：Addgene_23955
软件和算法
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	（Schindelin， 2012）
Excel （电子表格软件）	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
徕卡应用程序套件 （LAS X）	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 （统计）分析软件）	GraphPad 软件	https://www.graphpad.com
<强>其他
35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，20 mm 玻璃直径，无涂层	MatTek	P35G-1.5-20-C
笼式培养箱（环境室）	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL 倒置显微镜	徕卡	N/A
LIGHTNING 反卷积软件	徕卡	N/A
STELLARIS 8 共聚焦显微镜	徕卡	N/A