使用HeLa细胞中的实时成像对线粒体膜电位和超氧化物水平进行基于荧光的定量

Summary

该技术描述了一种有效的工作流程，使用基于荧光的实时成像可视化和定量测量HeLa细胞内的线粒体膜电位和超氧化物水平。

Abstract

线粒体是通过ATP合成 控制 能量产生，对代谢稳态至关重要的动态细胞器。为了支持细胞代谢，各种线粒体质量控制机制合作以维持健康的线粒体网络。其中一种途径是线粒体自噬，其中PTEN诱导的激酶1（PINK1）和受损线粒体的Parkin磷酸化泛素化促进自噬体隔离并随后通过溶酶体融合 从 细胞中去除。线粒体自噬对细胞稳态很重要，帕金的突变与帕金森病（PD）有关。由于这些发现，人们非常重视研究线粒体损伤和周转，以了解线粒体质量控制的分子机制和动力学。在这里，活细胞成像用于可视化HeLa细胞的线粒体网络，以量化线粒体解偶联剂羰基氰间氯苯基腙（CCCP）处理后的线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，表达抑制帕金依赖性线粒体自噬的帕金PD连锁突变（Parkin^T240R）以确定与表达野生型帕金的细胞相比突变如何影响线粒体网络。此处概述的方案描述了一种简单的工作流程，使用基于荧光的方法有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平。

Introduction

线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生¹，先天免疫²，³和细胞信号传导^4，5中起着至关重要的作用。线粒体失调与帕金森病（^PD）等神经退行性疾病有关6^，7。PD是一种进行性神经退行性疾病，影响黑质的多巴胺能神经元，^{影响全球近}1000万人8。PD与线粒体自噬有遗传联系，线粒体自噬是维持细胞稳态所必需的线粒体质量控制途径，选择性地去除受损的线粒体^9，10。研究已经确定了多种独立的线粒体自噬途径，包括含有 1 （FUNDC1） 介导的线粒体自噬的 FUN14 结构域、Bcl-2 相互作用蛋白 3 （BNIP3） 促进的线粒体自噬、NIX 依赖性线粒体自噬以及特征明确的 PTEN 诱导激酶 1 （PINK1）/帕金调节线粒体自噬^10，11。P....

Protocol

1. 生物样品的制备

注意:在生物安全柜中使用无菌技术执行以下步骤。用70%乙醇喷洒机柜表面和所有材料。

1. HeLa细胞培养和转染
   1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养30，000个HeLa细胞，含有4.5g / L葡萄糖，补充有10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺溶液（HeLa培养基;参见 材料表）。将细胞铺在含有 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像皿（参见材料 T 上）。将HeLa培养物保持在5%CO₂ 和37°C^26，27。
   2. 电镀后的第二天，使用光学显微镜检查35毫米成像皿，以确保细胞~50%-60%汇合。汇合后，用空的黄色荧光蛋白（YFP）载体，YFP-Parkin^WT或YFP-Parkin^T240R 转染HeLa细胞（图1A）。
   3. 每次转染时，在无菌微量离心管中制备两种单独的混合物。通过敲击试管或轻轻上下移液进行混合。
      1. 在管 1 中，将 200 μL 还原血清培养基（参见 材料表

Results

在该协议中，基于荧光的定量用于测量CCCP处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该工作流程使用了HeLa细胞，这是一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa细胞通常用于研究线粒体生物学，并且相对平坦，因此很容易使用显微镜可视化线粒体网络。为了研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用，用空对照载体Parkin^WT或Parkin^T240R （一种破坏线粒体自噬的突变体）瞬时转染HeLa细胞²¹。将HeLa细胞接种在35mm玻璃底成像培养皿中，并在达到~50%-60%汇合度后转染（图1A）。由于HeLa细胞快速分裂，这通常是将细胞接种到成像培养皿中的第二天。第二天使用光学显微镜观察YFP荧光信号，以评估转染效率。实验仅在成功转染后进行。

检查后，用轻度（5μM）或重度（20μM）浓度的CCCP处理HeLa细胞以使线粒体网络去极化（步骤1.2显示了制备CCCP和荧光探针的.......

Discussion

此处概述的工作流程可用于使用基于荧光的成像稳定且可重复地量化线粒体膜电位和超氧化物水平³⁰。在设计这些实验时，需要考虑重要的技术限制。用空的YFP载体YFP-Parkin^WT或YFP-Parkin^T240R转染HeLa细胞。空的YFP载体被用作对照，以确认实验结果是帕金特有的。对于瞬时转染，通过实验确定DNA与转染试剂的质量比为1:3，以产生最高的转染率，其中每个构建体使用2 μg质粒^DNA28。保持所有构建体的YFP标签一致很重要，因为荧光蛋白的先天亮度不同^31，32。如果必须使用多个荧光蛋白标签，则应选择具有相似亮度和光稳定性的荧光蛋白³³。

为了测量线粒体膜电位和超氧化物水平，选择了两种有据可查的染料。TMRE的荧光信号基于线粒体膜电位，而MitoSOX荧光强度是超氧化物水平.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化学品、肽和重组蛋白
CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM （1x）	Gibco	11-965-084
DMSO，无水	ThermoFisher Scientific	D12345
胎牛血清	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6（转染试剂）	Promega	E2691
GlutaMAX 100x（L-谷氨酰胺溶液）	Gibco 公司	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX 红色	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM（稀释血清培养基）	ThermoFisher scientific	31985070
四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐 （TMRE）	ThermoFisher Scientific	T669
实验模型：生物体/菌株
HeLa-M（智人）	A. Peden（剑桥医学研究所）	N/A
重组 DNA
EYFP 空载体	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	本文	由 YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	;PMID：19029340	RRID：Addgene_23955
软件和算法
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	（Schindelin， 2012）
Excel （电子表格软件）	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
徕卡应用程序套件 （LAS X）	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 （统计）分析软件）	GraphPad 软件	https://www.graphpad.com
<强>其他
35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，20 mm 玻璃直径，无涂层	MatTek	P35G-1.5-20-C
笼式培养箱（环境室）	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL 倒置显微镜	徕卡	N/A
LIGHTNING 反卷积软件	徕卡	N/A
STELLARIS 8 共聚焦显微镜	徕卡	N/A