由等离激元DNA折纸纳米天线实现的单分子表面增强拉曼散射测量

摘要

本方案展示了利用DNA折纸纳米天线（DONA）结合共定位原子力显微镜（AFM）与拉曼测量技术进行单分子表面增强拉曼散射（SERS）测量的方法。

摘要

表面增强拉曼散射（SERS）能够检测单个分子，这需要极高的电磁场增强效应。单分子（SM）SERS 可提供针对单个分子的特异性光谱信息，因此比其他单分子检测技术提供更详细的化学信息。同时，单分子测量还有望揭示在体相材料拉曼测量中无法观测到的信息。本实验方案描述了利用 DNA 折纸纳米天线（DONA）结合原子力显微镜（AFM）和拉曼光谱技术进行单分子 SERS 测量的方法。通过将 DNA 折纸叉状结构与两个金纳米颗粒组合，形成具有 1.2–2.0 nm 间隙的 DONA 结构，可实现高达 10¹¹ 倍的 SERS 信号增强，从而实现对单个分子的检测。该方案进一步展示了将单个分析物分子精确定位于 SERS 热点区域、进行 AFM 成像，以及随后叠加拉曼成像以在单个 DONA 中对分析物进行测量的完整流程。

引言

DNA折纸是一种纳米技术，通过将DNA链折叠成特定的形状和图案来构建结构。能够在纳米尺度上实现精确控制是DNA折纸技术的主要优势之一¹。在如此微小的尺度上操控物质的能力，有望彻底改变包括医学、电子学和材料科学在内的众多领域²。例如，DNA折纸结构已被用于将药物直接递送至癌细胞^3,4，用于构建检测疾病的纳米级传感器^5,6，以及在材料表面构建复杂的图案^6,7。此外，利用DNA折纸构建复杂纳米结构的能力，为在纳米尺度上研究基本的生物过程开辟了新的研究途径⁸。

表面增强拉曼散射（SERS）是一种强大的分析技术，能够检测并鉴定极低浓度的分子⁹。该技术基于拉曼效应，即散射光波长发生变化的现象¹⁰。SERS 需要使用等离激元金属基底来增强吸附在其表面分子的拉曼信号。这种增强效应可比通过常规拉曼光谱法测得的同一分子信号强达 10¹¹ 倍，使 SERS 成为分析痕量物质的高度灵敏方法¹¹。

纳米粒子的拉曼信号增强主要源于局域表面等离子体共振（LSPR）激发所产生的电磁增强效应¹²。在此现象中，当光入射时，金属纳米粒子内部的电子在其表面集体振荡，形成一种被称为表面等离子体的电子驻波，并可与入射光发生共振。LSPR显著增强了粒子表面附近的电场，且粒子的光吸收在等离子体共振频率处达到最大值。表面等离子体的能量取决于金属纳米粒子的形状和尺寸，以及周围介质的性质¹³。当两个纳米粒子之间的距离约为其直径长度的2.5倍或更小时，通过等离子体耦合可进一步实现更高的增强效果¹⁴。这种接近使得两个纳米粒子的LSPR相互作用，从而在粒子间隙中将电场增强数个数量级，远超过单个纳米粒子所能提供的增强效果^15,16,17。增强程度的大小与纳米粒子之间的距离成反比；随着距离减小，会出现一个临界点，此时增强效应足以检测到单个分子（SMs）¹⁸。

DNA折纸技术是一种关键方法，可高效排列等离激元纳米粒子，以利用并优化等离激元耦合¹⁹。同时，目标分子可被精确地定位在光学检测效率最高的位置。这一优势已在基于DNA折纸的等离激元纳米天线用于荧光检测中得到验证²⁰。与荧光标记检测不同，表面增强拉曼散射（SERS）能够提供分子的直接化学指纹信息，使得单分子SERS在传感、化学反应监测及机理研究方面极具吸引力。DNA折纸还可作为模板用于制备具有明确定义形状的等离激元纳米结构²¹，但此时无法再将目标分子精确地定位至热点区域。

通过使用共定位的原子力显微镜（AFM）和拉曼测量技术，我们可以从单个DNA折纸纳米天线（DONA）获取拉曼光谱，若将目标分子精确置于信号增强最强的位置，则甚至可能实现单分子检测。该DNA折纸纳米天线由一个DNA折纸叉状结构和两个精确定位的纳米颗粒组成，纳米颗粒表面完全包覆有DNA序列，这些DNA序列与连接在DNA折纸结构上的延伸型订书钉链互补。当发生DNA杂交时，纳米颗粒会结合到DNA折纸叉状结构上，其表面间距为1.2–2.0 nm²²。这种组装结构在两个纳米颗粒之间形成一个“热点”，信号增强可达10¹¹倍（根据时域有限差分（FDTD）模拟计算结果）²²，从而实现单分子表面增强拉曼散射（SM SERS）测量。然而，最强增强区域的体积非常小（约为1–10 nm³），因此目标分子必须被精确地定位至该热点区域内。利用DNA折纸叉状结构，可通过DNA叉桥结构及适当的偶联化学方法，将单个分子精确定位于两个纳米颗粒之间。尽管如此，在拉曼光谱中观测此类单分子信号仍极具挑战性²²。另一种替代策略是将目标分子（如TAMRA染料）完全包覆于纳米颗粒表面，从而实现单个DONA结构的测量，并获得更高的SERS信号强度²¹。在此情况下，TAMRA通过共价键连接至DNA包覆链上（图1）。

方案

1. DNA折纸叉状结构的组装

1. 在单个反应体系中自组装DNA折纸结构。首先，将2.5 nM的环状支架链M13mp18（7,249个核苷酸，参见材料表）和100 nM的201条短寡核苷酸（表1）加入含15 mM MgCl₂的1x TAE缓冲液（三（羟甲基）氨基甲烷[tris]、乙酸、乙二胺四乙酸[EDTA]）中。然后，用超纯水将总体积调整至100 µL。
2. 随后在热循环仪中通过温度梯度对溶液进行退火处理：首先迅速加热至80 °C，然后以1 °C/12 min的速率从80 °C降温至20 °C，再以1 °C/6 min的速率从20 °C降温至16 °C，最后迅速从16 °C冷却至8 °C。
3. 使用100 kDa分子量截留值（MWCO）的Amicon滤膜（参见材料表）从过量的短链中纯化混合物。
   1. 向Amicon滤膜中加入100 µL DNA折纸溶液和400 µL超纯水，然后在室温（RT）下以6,000 x g离心8分钟。
   2. 通过移除滤膜并将管子倒置以弃去滤液，随后向滤膜中加入400 µL超纯水并再次离心。重复此步骤一次。
   3. 为收集纯化的纳米结构溶液，将滤膜倒置放入新管中，按照制造商说明进行离心（1,000 x g，2分钟，室温）（参见材料表）。该溶液可在8 °C冰箱中保存最多2周。
      ​注意：Amicon滤膜纯化步骤中应使用1x TAE缓冲液或含15 mM MgCl₂的1x TAE缓冲液代替超纯水，因为水会降低所得DNA折纸叉结构的稳定性和浓度。对于单个染料分子的测量，需将DNA短链混合物替换为在5'端标记TAMRA染料的修饰链混合物。该修饰链位于纳米叉桥的中间位置（表2）。

2. 金纳米颗粒（AuNP）包被

注意：采用Liu等²³ 方案的改良版本对AuNPs进行包被，包被过程涉及将AuNP-DNA溶液冷冻。

1. 取400 µL直径为60 nm的金纳米颗粒（AuNP）溶液（商业获得；参见材料表），在常温下以3,500 × g离心5分钟，使用移液器弃去上清液。然后将沉淀重悬于25 µL超纯水中。最终AuNP浓度约为0.3 nM。
2. 向4 µL巯基修饰的DNA（厂家提供的浓度为100 µM；参见材料表）中加入1 µL 100 mM的三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液，在常温下孵育10分钟。
3. 孵育结束后，将5 µL混合液加入浓缩的AuNP溶液中（步骤2.1），涡旋振荡5秒，并在-20 °C下冷冻至少2小时。
4. 在常温下解冻后，以3,500 × g离心5分钟（常温）以去除过量的包被DNA。使用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于10 µL水中。
   注意：每种AuNP在纳米叉结构上有两条包被链（表2）。操作步骤相同，仅DNA包被链序列不同。一旦颗粒完成包被，即非常稳定；可在冰箱中保存数月，甚至可进行冷冻。对于完全包被的染料标记AuNP，其包被DNA链含有内部TAMRA染料。

3. DONA 组装

1. 将包被的AuNP溶液加入纳米叉溶液中，摩尔浓度比为1.5:1。
2. 使用50 mM MgCl₂储备液将MgCl₂加入至终浓度为4 mM。用超纯水调整终体积至20 µL。
3. 在PCR仪中采用温度梯度使DONA杂交。首先迅速加热至40 °C，然后以1 °C/10 min的速率从40 °C降温至20 °C，再迅速从20 °C降温至8 °C。

4. 凝胶电泳

注意：通过琼脂糖凝胶电泳去除 DONA 溶液中的游离纳米颗粒。

1. 制备1%琼脂糖凝胶。将0.8 g琼脂糖溶解于80 mL含有5 mM MgCl₂的1x TAE缓冲液中。
2. 向18 µL DONA溶液中加入2.25 µL上样缓冲液（30%甘油，13 mM MgCl₂； 参见材料表），使MgCl₂终浓度从3.2步骤中的4 mM升至5 mM。上样缓冲液还可确保样品保留在凝胶孔内。
3. 将凝胶置于冰水浴中，以70 V电压电泳60分钟。电泳缓冲液为含5 mM MgCl₂的1x TAE缓冲液。
4. 切下目标条带，置于包有石蜡塑料膜的载玻片上，再用另一张包有石蜡塑料膜的载玻片挤压，挤出溶液。使用移液器将挤出的液体收集至500 µL离心管中。

5. 原子力显微镜与拉曼测量的共定位

1. 将硅片（参见材料表）进行等离子体处理10分钟，然后在硅片上孵育10 µL纯化的DONA溶液和10 µL 100 mM MgCl₂，孵育时间为3小时。随后，用体积比为1:1的乙醇和水混合液洗涤硅片两次，并用压缩空气吹干。接着，将硅片固定在磁盘上，并插入仪器中进行成像。
   注意：在开始测量之前，需调整拉曼激发激光的位置，使其位于AFM探针尖端的正上方。 本研究使用的是HORIBA LabRAM HR Evolution拉曼显微镜，该显微镜与HORIBA Omegascope AFM联用。仪器通过LabSpec和AIST软件进行控制。
2. 进行AFM测量时，采用轻敲模式（AC模式），使用ACCESS-NC-A探针（共振频率：300 kHz；弹簧常数：45 N/m）²⁴。AC模式会自动控制所有参数，扫描速率除外，后者设定为1 Hz。
   注意：完成AFM成像后，需将AFM探针收回，以避免其进入拉曼激光的光路。此操作通过系统中预设的宏功能"Probe away"实现。通过这种方式，对于AFM图像中的任意选定位置，激光的位置将与AFM无偏移，保持一致。
3. 根据所测样品的不同，选择合适的激光波长、功率和累积时间进行拉曼测量。
   1. 对完全包被TAMRA的AuNP进行测量时，使用以下参数：633 nm激光，100 µW功率，积分时间为1秒。
   2. 对单个TAMRA分子进行测量时，使用以下参数：633 nm激光，400 µW功率，积分时间为4秒。
4. 调整参数后，在AFM图像中将光标移至目标DONA上方；此操作可通过软件中的"move cursor"功能实现。随后，开始拉曼测量。
   注意：光谱采集有多种模式：单点测量—一维时间映射，即对单个点进行随时间变化的连续测量²⁵；以及二维XY区域映射，即通过电动载物台在激光下移动，对XY网格中多个点阵位置采集光谱²⁶。

结果

按照方案，应确保DNA折纸叉状结构正确组装；观察叉状结构的首选方法是原子力显微镜（AFM）成像。大多数叉状结构应完整，无断裂的臂。另一方面，由于连接臂之间的桥结构直径小且柔韧性高，成像较为困难；这还需要使用非常尖锐的AFM针尖（图2）。

AuNP包被过程每一步的溶液颜色变化表明实验操作正确无误。溶液最初为深红色，仅含有AuNPs；一旦加入DNA，颜色即变为深紫红色。冷冻后颜色变为紫色，解冻后又恢复为深红色（图3A）。图3B展示了裸露AuNPs与DNA包被AuNPs的吸收光谱。

此后，在 DONA 组装步骤中，整个过程颜色始终保持深红色。在琼脂糖凝胶纯化过程中，二聚体条带出现在游离 AuNP 条带的上方，后者是样品中迁移速度最快的条带。该二聚体条带对应于 DONA，随后被切下并挤压以提取样品（图 4）。

最后，为了进行共定位测量，对样品进行原子力显微镜（AFM）成像以寻找DONA（图5）。随后，采集单个DONA的拉曼光谱并进行比较，以确认所获得的光谱来自TAMRA分子（图6）。

图1：DNA折纸叉结构及完全组装的DONA的示意图。（A）DNA折纸叉的尺寸，其中桥段长度为90个核苷酸。（B）组装完成的DONA的侧面示意图，包含两个AuNPs以及位于其间的DNA折纸叉。（C）组装完成的DONA的顶视示意图，显示SM分子位于桥段中央的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：DNA 折纸叉状结构组装后的原子力显微镜图像。 叉状结构形态良好，部分叉状结构中可见桥接区域。叉状结构的高度为 1.5–2 nm。比例尺 = 500 nm。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：AuNPs的颜色变化及吸收光谱。（A）不同步骤中AuNP溶液颜色的试管图示。（1）裸露AuNP溶液呈深红色。（2）向AuNPs中加入包被DNA后变为深紫红色。（3）将DNA包被的AuNP混合物冷冻后呈现紫色。（4）混合物解冻后颜色恢复为深红色。（B）60 nm AuNPs的吸收光谱，显示从裸露AuNPs（试管1）到DNA包被AuNPs（试管4）吸收峰的位移。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：DONA溶液的琼脂糖凝胶电泳图。 两条泳道中的样品相同，二聚体条带（DONA）和游离AuNP条带均清晰可见。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：DONA的AFM图像。（A）图像显示多个DONA结构；该AFM图像用于共定位测量。（B）圈出的DONA的放大图像及DONA的垂直截面图。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：携带完全包被TAMRA AuNP和单个TAMRA分子的DONA的表面增强拉曼光谱（SERS）。 垂直网格线表示主要的TAMRA峰。在完全包被TAMRA的AuNP中可观察到主要的TAMRA峰。尽管SM TAMRA光谱的信噪比较低，但主要峰仍可识别：1,360 cm^-1：C-C伸缩振动；1,509 cm^-1：C=C伸缩振动；1,536 cm^-1：C=C伸缩振动；1,654 cm^-1：C=O伸缩振动。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：DNA折纸叉形短链列表。 请点击此处下载该表格。

表2：修饰DNA链列表。 请点击此处下载该表格。

讨论

单分子表面增强拉曼散射（SM SERS）是一种强大的工具，可使研究人员研究样品中单个分子的行为及其相互作用¹。该技术能够在前所未有的灵敏度水平上分析系统，为单分子的基本行为以及分子集合中化学或物理性质的分布提供新的见解，并有助于识别化学过程中的关键中间体。然而，将单个分子精确置于热点区域，同时确保该热点具有足够的表面增强效应，仍具有较大挑战性²⁷。本实验方案中所述的DNA纳米结构（DONAs）能够将单个分子精确定位于两个金纳米颗粒之间的热点区域，同时确保实现10¹¹倍的表面增强效果。

纳米颗粒之间的间隙对于DONA组装实现表面增强拉曼光谱（SERS）单分子研究所需的表面增强至关重要。DONA结构针对粒径在60至80 nm范围内的球形纳米颗粒进行了优化。此外，纳米颗粒的质量会显著影响其与DNA折纸叉状结构的杂交效率；在包被步骤中使用的纳米颗粒若存放时间超过6个月，其杂交效率将开始下降。

该方案的另一个关键方面是，需要精确组分比例的步骤必须严格遵循，否则 DONA 无法正确形成。DNA 折纸叉结构对温度梯度程序极为敏感，温度变化会影响结构的完整性，或导致叉状结构无法形成。

在表面增强拉曼光谱（SERS）测量中，非晶碳的生成是一个重要问题，因为其拉曼峰通常出现在许多分子的指纹区范围内（1,200–1,700 cm^-1）。尽管其形成机制尚未完全明确，但通常与高激光功率或长积分时间有关²⁸。作为预防措施，应尽可能使用最低的激光功率和最短的积分时间。然而，这并不容易实现，因为在获得理想的SERS信号与避免非晶碳生成之间必须取得平衡。

在可用的纳米颗粒类型和形状方面，DNA折纸纳米天线（DONAs）作为表面增强拉曼散射（SM）系统具有极高的灵活性，例如可使用银球、金花或星形纳米颗粒。 此外，通过仅更换桥接结构中间的DNA链即可轻松替换待研究的分子，而无需改变实验流程。若要改用细胞色素C等蛋白质，可在桥接结构中使用经吡啶修饰的DNA捕获链，使其结合细胞色素C并确保其位于SM SERS测量的热点区域²²。这也意味着可灵活选择激发激光，甚至可能采用能提供最大增强效果的激光器。

总之，该方法在组装DONA结构并将其用于单分子表面增强拉曼光谱测量方面是可靠的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 kDa 分子量截留值 Amicon 滤膜，0.5 mL	Merck	UFC5100BK
10x TAE 缓冲液（0.4 M Tris，0.2 M 乙酸，0.01 M EDTA）	SIGMA Aldrich	T9650
60 nm 金纳米球，裸球（柠檬酸盐）	NanoComposix	AUCN60
ACCESS-NC-A 原子力显微镜探针	SCHAEFER-TEC
琼脂糖粉末	SIGMA Aldrich	9012-36-6
AuNP DNA 包被链	IDT
AuNP DNA 包被链（TAMRA）	SIGMA Aldrich
甘油	SIGMA Aldrich	56-81-5
Heraeus Fresco 17 离心机	Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope 配备 LabRAM HR evolution	HORIBA
氯化镁	SIGMA Aldrich	7786-30-3
纳米叉 DNA 桥链（TAMRA）	Metabion
纳米叉 DNA 支架链	SIGMA Aldrich
ParafilmM	Carl Roth	CNP8.1
Primus 25 梯度 PCR 仪	Peqlab/VWR
硅晶圆	Siegert wafer	BW14076
单链支架 DNA，p7249 型（M13mp18）	Tilibit nanosystems
TCEP 溶液	SIGMA Aldrich	51805-45-9