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方法文章

评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

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DOI：

10.3791/65312

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2023年7月21日

 , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种优化的离体叶片生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜（Lipaphis erysimi (Kalt.)）的防治效果。该方法详细说明了在培养皿实验过程中的数据采集流程，使研究人员能够持续一致地测定EPF对芥菜蚜及其他孤雌生殖昆虫的毒力。

摘要

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种危害多种十字花科作物并传播植物病毒的害虫。为实现环境友好的害虫治理，昆虫病原真菌（EPF）可作为潜在的微生物防治制剂用于控制该害虫。因此，在田间应用前，有必要在培养皿条件下对EPF菌株进行毒力筛选。然而，芥菜蚜虫为孤雌生殖昆虫，这使得在培养皿实验中记录数据较为困难。为此，本研究开发了一种改良的离体叶片生物测定系统，采用微型喷雾器将分生孢子接种至蚜虫体表，并通过促进孢子悬浮液的空气干燥以防止蚜虫溺亡。该系统在整个观察期间维持了较高的相对湿度，且叶片圆片在十天以上仍保持新鲜，支持蚜虫的孤雌生殖繁殖。为防止后代积累，采用画笔每日清除子代蚜虫。本方案展示了一种稳定评估EPF菌株对芥菜蚜虫或其他蚜虫毒力的系统，可用于筛选具有应用潜力的菌株以实现蚜虫防控。

引言

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种臭名昭著的害虫，可侵袭多种十字花科作物，造成严重的经济损失1。尽管已推荐使用多种系统性杀虫剂来防治蚜虫侵害，但频繁使用这些杀虫剂引发了对农药抗药性的担忧2,3。因此，从环境友好型害虫管理的角度来看，昆虫病原真菌（EPF）可作为一种合适的替代防控策略。EPF 是一类能够通过穿透寄主表皮感染昆虫的病原体，因而对控制蚜虫及其他刺吸式口器害虫具有较强效力4。此外，EPF 已被证明是一种可行且可持续的害虫管理技术，具有拮抗植物病原菌和促进植物生长等多重优势5。

EPF 可通过昆虫-土壤诱捕法获得，或从田间昆虫尸体中分离得到6,7。然而，在进一步使用真菌分离物之前，必须进行致病性筛选。已有许多研究探讨了EPF对蚜虫的防治效果，蚜虫是重要的农作物害虫，可造成严重危害8,9。在多种蚜虫中，芥菜蚜虫已被用于测试对多种Beauveria spp.、Metarhizium spp.、Lecanicillium spp.、Paecilomyces spp.菌株的敏感性，甚至包括Alternaria——该真菌主要被视为腐生性及植物病原真菌，但也显示出对芥菜蚜虫一定的致死作用10,11,12。

为了在实验室条件下评估杀虫真菌（EPF）对蚜虫的防治效果，生物测定可分为两个主要部分：接种室的建立和真菌接种。本方案描述了接种室的构建方法，其中可通过多种方式维持蚜虫的存活，例如使用叶柄包裹湿润棉絮的离体叶片、置于铺有湿润滤纸的培养皿中的离体叶盘、直接在盆栽植株上饲养，或在培养皿或容器中将离体叶盘嵌入水琼脂中10,11,13。常见的真菌接种方法包括分生孢子喷雾法、将蚜虫浸入分生孢子悬浮液、将叶片浸入分生孢子悬浮液以及植物内生菌接种法11,14,15,16。尽管存在多种接种方法，生物测定应尽可能模拟田间施用条件。例如，在叶片浸渍法12,17中，虽可评估EPF的效力，但由于蚜虫取食带有真菌的叶片，其背部（真菌优先侵入部位）通常无法充分接触真菌。

为了在实验室条件下评估虫生真菌（EPF）对蚜虫的杀虫效果，本方案建议采用Yokomi和Gottwald18描述的离体叶片法并进行部分修改，随后使用微型喷雾器进行分生孢子接种。该方法可在生物测定培养皿中维持约100%的湿度，至少持续七天，无需额外补充水分18,19。此外，将蚜虫限制在单一表面可确保其充分接触分生孢子喷雾，并便于后续观察20。然而，蚜虫在接种培养皿内活动时，可能会粘附在暴露的琼脂表面。另外，由于芥菜蚜虫属于孤雌生殖昆虫，发育和繁殖迅速，在培养皿实验中记录数据可能存在困难。若不进行移除，很难区分接种的成虫与其后代。关于如何执行该步骤的具体操作细节在文献中鲜有提及，一些不一致的因素（如叶片取食面积）仍需进一步优化。

本方案展示了一种稳定的系统，用于筛选球孢白僵菌（EPF）分离株对芥菜蚜虫的毒力，从而能够从大量的EPF菌株库中选择出对多种蚜虫具有潜力的分离株。通过该方法，可对田间采集的蚜虫进行鉴定，并在实验室建立足够数量的芥菜蚜虫种群，以采用简便且可行的技术评估不同真菌分离株的杀蚜效果，并获得一致的结果。在农业生态系统中，蚜虫因长期且反复受到人为干预的压力，已进化出多种适应机制，这对粮食安全构成了挑战9。因此，本研究所描述的方法可进一步推广应用于评估潜在EPF分离株对多种蚜虫物种的防治效果。

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方案

注意：完整流程图见图1。

1. 芥菜蚜虫的采集与保种

  1. 芥菜蚜虫的采集
    1. 翻转叶片，目视检查田间十字花科作物上芥菜蚜虫的侵染情况。
    2. 记录采样地点信息（即，GPS坐标）及寄主植物，并向农户确认杀虫剂使用历史。
    3. 使用昆虫吸虫器或细毛笔（见材料表），从田间十字花科作物上采集约50头芥菜蚜虫至50 mL离心管中，并在3小时内将样本带回实验室。
    4. 准备一个临时饲养用培养皿，底部放置经切割的十字花科叶片和吸有水分的滤纸。
    5. 将5头蚜虫置于临时饲养培养皿中，在室温（25 ± 2 °C）、相对湿度70%、光周期12:12 h（光照:黑暗）条件下饲养14天，以确认蚜虫未受天敌感染后再进行后续扩繁。
      注：为确保野外采集的蚜虫不携带寄生蜂或昆虫病原真菌等天敌，必须在继续饲养前确认这些生物不存在。
  2. 芥菜蚜虫的维持饲养
    注：维持芥菜蚜虫饲养时，应使用无农药（包括生物农药）处理的十字花科叶片。
    1. 提供稳定且充足的十字花科叶片（约25 cm2）。
      注：十字花科叶片可从市场获取或自行种植。在进行长期大规模饲养前，可测试多种不同十字花科植物以筛选适宜种类。一旦确定所用十字花科叶片种类，不应更换。本研究中采用6-7叶期的小松菜（Brassica rapa var. perviridis）（见材料表）。此外，需清除最老的2-3片叶。
    2. 在底部滤纸完全干燥前及时补充水分。
    3. 每日观察芥菜蚜虫的种群密度。通常7天后种群数量应增长至原来的2-3倍。
    4. 当蚜虫数量增加时，将原有带蚜虫的切叶分割为4-6个小片，每片带蚜虫的小叶转移至一个新的培养皿中，并加入新鲜切叶和吸有水分的滤纸。
    5. 将培养皿置于25 °C、光周期12:12 h（光照:黑暗）的培养箱中，每日观察芥菜蚜虫的种群密度。
    6. 在原有切叶腐烂前，待大部分蚜虫迁移至新鲜切叶后，移除原有切叶。

2. 芥菜蚜虫的分子鉴定

注意：为了确认田间采集的芥菜蚜虫的物种，使用了两个分子标记进行分子鉴定：基于 Lu 等人设计的 A05Le 的序列特征扩增区域（SCAR）21，以及芥菜蚜虫细胞色素氧化酶亚基 1（COI）区域。

  1. 芥菜蚜虫基因组DNA的提取
    1. 将约50只蚜虫收集至1.5 mL离心管中。
      注意：用于分子鉴定的蚜虫应为单个蚜虫的后代，不同发育阶段的个体也可混合于同一管中进行DNA提取。
    2. 使用研磨杵将蚜虫组织匀浆，并按照Gene-Spin基因组DNA提取试剂盒的说明书操作提取DNA（见材料表）。
    3. 用50 µL预热的无核酸酶水洗脱基因组DNA。
  2. PCR扩增与DNA测序
    1. 使用PCR Master Mix（2×）及引物对A05LeF/A05LeR和LeCO1F/LeCO1R，对蚜虫基因组DNA中的目标DNA序列进行PCR扩增（表1），采用不同的PCR程序21。
      注意：总体积为20 µL的PCR反应体系包含2 µL蚜虫基因组DNA模板、1 µL正向引物、1 µL反向引物、10 µL PCR Master Mix（见材料表）以及6 µL ddH2O。
    2. 在PCR仪（见材料表）中按以下程序进行PCR扩增：94 °C预变性5 min；随后进行25个循环，每个循环包括94 °C变性45 s、61 °C（A05LeF/A05LeR）或58 °C（LeCO1F/LeCO1R）退火45 s、72 °C延伸1 min；最后72 °C终延伸5 min。
    3. 通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以确认芥菜蚜虫的身份（图2）。
      ​注意：若引物对A05LeF/A05LeR成功扩增出正确大小的DNA片段，则可明确鉴定野外采集的蚜虫为芥菜蚜虫21。引物对列于表2中。
    4. 使用市售的凝胶/PCR产物纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化芥菜蚜虫COI扩增产物（见材料表），并送商业测序服务机构进行测序。
  3. 序列分析
    注意：根据Lu等21的研究，A05Le的DNA弯曲区是芥菜蚜虫特有的DNA片段；因此，A05Le的PCR产物无需进一步测序。
    1. 获得LeCO1序列后，使用Chromas软件（见材料表）检查测序读段质量。
    2. 打开fasta（或txt）文件，直接切除上下游低质量读段。
    3. 将修剪后的序列提交至NCBI在线BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用默认参数进行比对。 
      ​注意：若A05Le和LeCO1引物组扩增的产物大小正确，则理论上该序列在NCBI标准数据库中的BLAST比对结果必须与芥菜蚜虫匹配。

3. 昆虫病原真菌的制备

注意：本研究中使用的EPF见表1。

  1. 从真菌文库中复苏EPF
    1. 从-80 °C冰箱中取出保存的真菌菌种（孢子悬浮于30%甘油中），解冻。
    2. 在超净工作台中，用接种环取少量（约10 µL）孢子悬液转移至6 cm的¼沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板（每100 mL ddH2O中含0.75 g沙氏葡萄糖肉汤和1.5 g琼脂），并用涂布棒均匀涂布。
    3. 用封口膜密封培养皿，于25 °C黑暗条件下培养10–14天。
    4. 将真菌菌落通过划线法转接至新的¼ SDA平板，于25 °C黑暗条件下培养10–14天后收集孢子22。
      注意：真菌培养物应在接种蚜虫前约10天使用。不建议使用培养超过14天的EPF菌株进行毒力测定。
  2. 孢子悬液的制备
    1. 在¼ SDA平板上培养10–14天的真菌培养物中，加入2–3 mL 0.03% Tween 80（见材料表），用接种环刮取孢子。
    2. 将真菌悬液收集至离心管中。
    3. 在最高转速下涡旋振荡，使用血细胞计数板在光学显微镜下计数孢子数量，并将孢子悬液浓度调整至108 个孢子/mL。
    4. 将孢子悬液转移至经紫外灭菌的微型喷雾器中。
      ​注意：转移前需再次涡旋振荡孢子悬液，因孢子易发生沉淀。微型喷雾器在使用前应在超净工作台中接受紫外线照射30分钟。

4. 针对芥菜蚜虫的毒力筛选

  1. 新羽化成虫的准备
    1. 将无翅型（无翅）和有翅型（具翅）成虫从饲养用培养皿转移到新鲜切取的叶片上，以繁殖同龄后代。24小时后移除成虫，以避免过度拥挤，并减少有翅型后代的产生23,24。后续实验仅使用无翅型成虫。
    2. 将后代饲养至成虫阶段，并在48小时后移除未能发育至成虫阶段的个体（图3），以防止实验中蚜虫之间出现龄期差异。此外，移除所有有翅型成虫。
  2. 接种室的制备
    注意：建议先准备好直径为9 cm的十字花科叶片，以便在琼脂凝固前将叶盘嵌入水琼脂中。
    1. 用自来水清洗十字花科叶片，去除污垢、残留物以及可能存在的其他节肢动物。
    2. 用纸巾擦去多余水分，并在体视显微镜下检查十字花科叶片表面是否存在其他节肢动物。如发现，应立即清除。
    3. 使用底部培养皿作为模具直接按压叶片，或使用剪刀切割出直径为9 cm的叶盘。
      注意：若叶片直径小于9 cm，可将数片切下的叶片拼接使用。
    4. 通过微波加热，将450 mg琼脂（见材料表）溶解于30 mL ddH2O中，为每个培养皿制备1.5%的水琼脂。
      注意：1.5%水琼脂的用量可根据实验规模进行调整。
    5. 在超净工作台中，于琼脂凝固前向9 cm培养皿中倒入30 mL 1.5%水琼脂，待其冷却至约40 °C，直至琼脂表面呈半凝固状态。
      注意：可通过轻轻水平晃动培养皿检查表面是否已半凝固。
    6. 将叶盘背面朝上放置于水琼脂表面，并将其嵌入琼脂中。
      注意：尽量减少琼脂表面的暴露面积。
    7. 待水琼脂完全凝固后，盖上培养皿盖。
      注意：若盖子内表面迅速凝结大量水滴，应打开盖子以促进水分蒸发。
    8. 在叶盘上放置20只无翅型成虫。
      注意：建议在体视显微镜下操作，以防损伤其口器。
  3. EPF接种与观察
    1. 打开接种室盖子，从距叶盘约15 cm高处，将0.3 mL分生孢子悬浮液（来自步骤3.2）直接喷洒至蚜虫和叶盘表面。
      注意：喷洒前需再次涡旋混匀分生孢子悬浮液。不同喷雾器的喷洒范围可能存在差异，建议在实验前测试喷洒区域。本实验推荐使用0.3 mL体积、距离15 cm。喷洒范围应覆盖整个叶盘，且叶盘表面应形成一层薄薄的分生孢子悬浮液。若液滴聚集成积水，则应减少接种量。接种前及使用不同菌株之间，需用70%乙醇清洁操作台面。
    2. 等待分生孢子悬浮液干燥后，盖上盖子，以防芥菜蚜虫溺亡。
      注意：蚜虫在实验过程中通常活动较少，但仍需确保其不会逃逸。
    3. 用石蜡膜密封接种室以维持高相对湿度，并将接种室置于25 °C、12:12 h（光:暗）光周期的培养箱中。
    4. 每隔12小时打开接种室盖子，在体视显微镜下统计死亡率，持续5天。
    5. 用纸巾擦拭附着在盖子上的蜜露，并用细毛笔移除新羽化的蚜虫。每24小时用自来水清洗盖子一次。
      注意：不同蚜虫种类的成虫寿命不同，观察周期可能需相应调整。
    6. 将死亡虫体保留在叶盘上，以便观察真菌定殖（mycosis），确认接种成功。
  4. 分生孢子萌发率的确认
    注意：此步骤为可选步骤。在进行毒力筛选时，可成对检测分生孢子萌发率，以确保孢子活性。
    1. 将5 µL分生孢子悬浮液滴加至¼ SDA培养基上，设三个重复。
    2. 18小时后，使用光学显微镜计算萌发率。在单个液滴中随机计数至少100个孢子，以确认真菌的萌发率。
      ​注意：通常实验所用菌株的分生孢子萌发率应高于90%。

5. 所选昆虫病原真菌分离物的生物测定

注意：从第4步中筛选出的高毒力EPF菌株，需采用4种不同浓度的分生孢子悬浮液（浓度范围为104至107个分生孢子/mL），对芥菜蚜虫进行生物测定。

  1. 分生孢子悬液的制备
    1. 重复步骤 3.1，以复苏所选的虫生真菌分离株。
    2. 重复步骤 3.2，制备四种浓度的分生孢子悬液，分别为 104、105、106, 和 107 个分生孢子/mL。
  2. 新羽化成虫的制备
    1. 重复步骤 4.1，以制备新羽化成虫。
  3. 接种室的制备
    1. 重复步骤 4.1，以制备接种室。
  4. 虫生真菌接种与观察
    1. 重复步骤 4.3，分别使用四种浓度的分生孢子悬液进行虫生真菌接种与观察。

6. 统计分析

  1. 校正死亡率的计算
    1. 使用Abbott公式计算校正死亡率25，如下所示：
      校正死亡率（%）= [(MT− MC) × 100%] / (100− MC)
      MT 表示处理组的死亡率，而 MC 表示对照组的死亡率。
      ​注意：对照组的死亡率不应高于20%。
    2. 打开SPSS软件平台（参见 材料表），创建变量，包括 "治疗" 和 "cor_mor" （表示校正死亡率），并输入在相同时间点以相同接种浓度接种不同分离株的计算结果。
    3. 选择 分析、比较均值与比例、独立样本T检验 在 SPSS 中用于独立样本 t检验 分析。
    4. 在 SPSS 中输入 治疗 进入 "分组变量" 盒，和 cor_mor 到……中 "测试变量". 根据不同真菌分离株定义分组。按压 好的 进行分析。
  2. 中位致死时间（LT）的计算50）和半数致死浓度（LC50)
    1. 打开 SPSS，创建变量 "总计", "反应" 和 "持续时间"/"浓度"，并将记录的结果输入电子表格中。
    2. 选择 分析，回归，概率单位 在 SPSS 中计算 LT50 和/或液相色谱50.
      注意：如果累积死亡率最终未超过50%，则LT50 和/或液相色谱50 无法估计。
    3. 输入 总计 到……中 "总观察数" 盒 反应 进入 "反应频率" 盒 持续时间/浓度 进入 "协变量" 盒。按压 好的 进行分析。
      注意：通常情况下，按压 选项 并设置 "异质性因子应用的显著性水平" 到 0.05.

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结果

图示流程展示了从田间采集到毒力筛选过程中芥菜蚜虫的稳定状态。通过田间采集并维持蚜虫种群，确保了在充足食物供应下蚜虫群体的稳定增长。利用分子标记（包括PCR扩增片段大小和LeCO1基因测序）对田间采集的蚜虫进行鉴定，确认其为芥菜蚜虫。采用离体叶片法进行的毒力筛选结果显示，芥菜蚜虫具有稳定的存活率，其中对照组的存活率达到85%（图4）。

在毒力筛选过程中，Cc-NCHU-213 表现出最快的杀蚜能力，接种后 3 天和 4.5 天的致死率分别达到 50% 和 90%（图 4）。然而，五株 B. bassiana 分离株之间的杀蚜能力存在差异。Bb-NCHU-141、-143 和 -153 的杀蚜能力较弱，在接种后 3 天时致死率仅为 5%，即使排除了 0.03% Tween 80 喷雾或其他致死因素的影响亦如此（图 4）。因此，采用校正死亡率公式对对照组死亡率进行标准化处理。大多数虫生真菌分离...

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讨论

芸薹属蔬菜是一类常受多种蚜虫侵扰的植物，其中包括芥菜蚜（L. erysimi）和甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）26。这两种蚜虫均已有在中国台湾的报道27，且有可能在同一采集地点共存。为了区分这些亲缘关系较近的蚜虫种类，本研究采用了一种基于多重引物组的分子鉴定技术21。通过针对芥菜蚜COI基因片段设计分子标记，我们成功鉴定了芥菜蚜，从而证实了分子标记A05Le在此用途中的可靠性21。

观察结果表明，仅凭体型或形态特征来区分无翅的四龄若虫与成年芥菜蚜虫，在缺乏经验的情况下具有挑战性。然而，一个关键的鉴别特征是后足胫节：四龄若虫的后足胫节呈白色，而成虫则不呈现白色（图3）。以往关于L. attenuatum、B. bassiana对抗棉蚜以及

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披露

作者声明本工作中不存在利益冲突。

致谢

本研究由台湾科技事务主管部门（MOST）资助，项目编号为109-2313-B-005 -048 -MY3。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 μL 接种环NEST Scientific718201
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 mL 离心管Bioman ScientificET5050-12
6 cm 培养皿Alpha Plus Scientific16021
6 mm 昆虫吸虫器MegaView ScienceBA6001
70 mm 滤纸 NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% 乙醇
9 cm 培养皿Alpha Plus Scientific16001
琼脂Bioman ScientificAGR001.1微生物学级
琼脂糖Bioman ScientificPB1200
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin 基因组 DNA 提取试剂盒Protech TechnologyPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
血细胞计数板Paul Marienfeld640030
小松菜叶片（Brassica rapa var. perviridis）泰成农场1-010-300410
微型喷雾器
MiniAmp 热循环仪Thermo Fisher ScientificA37834
芥菜蚜虫（Lipaphis erysimi）
画笔天成刷业公司4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
研磨杵Bioman ScientificGT100R
沙氏葡萄糖肉汤HiMediaMH033-500G
SPSS StatisticsIBM
TAE 缓冲液 50xBioman ScientificTAE501000
吐温 80PanReac AppliChem142050.1661

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