评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

摘要

本方案介绍了一种优化的离体叶片生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜（Lipaphis erysimi (Kalt.)）的防治效果。该方法详细说明了在培养皿实验过程中的数据采集流程，使研究人员能够持续一致地测定EPF对芥菜蚜及其他孤雌生殖昆虫的毒力。

摘要

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种危害多种十字花科作物并传播植物病毒的害虫。为实现环境友好的害虫治理，昆虫病原真菌（EPF）可作为潜在的微生物防治制剂用于控制该害虫。因此，在田间应用前，有必要在培养皿条件下对EPF菌株进行毒力筛选。然而，芥菜蚜虫为孤雌生殖昆虫，这使得在培养皿实验中记录数据较为困难。为此，本研究开发了一种改良的离体叶片生物测定系统，采用微型喷雾器将分生孢子接种至蚜虫体表，并通过促进孢子悬浮液的空气干燥以防止蚜虫溺亡。该系统在整个观察期间维持了较高的相对湿度，且叶片圆片在十天以上仍保持新鲜，支持蚜虫的孤雌生殖繁殖。为防止后代积累，采用画笔每日清除子代蚜虫。本方案展示了一种稳定评估EPF菌株对芥菜蚜虫或其他蚜虫毒力的系统，可用于筛选具有应用潜力的菌株以实现蚜虫防控。

引言

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种臭名昭著的害虫，可侵袭多种十字花科作物，造成严重的经济损失¹。尽管已推荐使用多种系统性杀虫剂来防治蚜虫侵害，但频繁使用这些杀虫剂引发了对农药抗药性的担忧^2,3。因此，从环境友好型害虫管理的角度来看，昆虫病原真菌（EPF）可作为一种合适的替代防控策略。EPF 是一类能够通过穿透寄主表皮感染昆虫的病原体，因而对控制蚜虫及其他刺吸式口器害虫具有较强效力⁴。此外，EPF 已被证明是一种可行且可持续的害虫管理技术，具有拮抗植物病原菌和促进植物生长等多重优势⁵。

EPF 可通过昆虫-土壤诱捕法获得，或从田间昆虫尸体中分离得到^6,7。然而，在进一步使用真菌分离物之前，必须进行致病性筛选。已有许多研究探讨了EPF对蚜虫的防治效果，蚜虫是重要的农作物害虫，可造成严重危害^8,9。在多种蚜虫中，芥菜蚜虫已被用于测试对多种Beauveria

方案

注意：完整流程图见图1。

1. 芥菜蚜虫的采集与保种

1. 芥菜蚜虫的采集
   1. 翻转叶片，目视检查田间十字花科作物上芥菜蚜虫的侵染情况。
   2. 记录采样地点信息（即，GPS坐标）及寄主植物，并向农户确认杀虫剂使用历史。
   3. 使用昆虫吸虫器或细毛笔（见材料表），从田间十字花科作物上采集约50头芥菜蚜虫至50 mL离心管中，并在3小时内将样本带回实验室。
   4. 准备一个临时饲养用培养皿，底部放置经切割的十字花科叶片和吸有水分的滤纸。
   5. 将5头蚜虫置于临时饲养培养皿中，在室温（25 ± 2 °C）、相对湿度70%、光周期12:12 h（光照:黑暗）条件下饲养14天，以确认蚜虫未受天敌感染后再进行后续扩繁。
      注：为确保野外采集的蚜虫不携带寄生蜂或昆虫病原真菌等天敌，必须在继续饲养前确认这些生物不存在。
2. 芥菜蚜虫的维持饲养
   注：维持芥菜蚜虫饲养时，应使用无农药（包括生物农药）处理的十字花科叶片。
   1. 提供稳定且充足的十字花科叶片（约25 cm²）。
      注：十字花科叶片可从市场获取或自行种植。在进行长期大规....

结果

图示流程展示了从田间采集到毒力筛选过程中芥菜蚜虫的稳定状态。通过田间采集并维持蚜虫种群，确保了在充足食物供应下蚜虫群体的稳定增长。利用分子标记（包括PCR扩增片段大小和LeCO1基因测序）对田间采集的蚜虫进行鉴定，确认其为芥菜蚜虫。采用离体叶片法进行的毒力筛选结果显示，芥菜蚜虫具有稳定的存活率，其中对照组的存活率达到85%（图4）。

在毒力筛选过程中，Cc-NCHU-213 表现出最快的杀蚜能力，接种后 3 天和 4.5 天的致死率分别达到 50% 和 90%（图 4）。然而，五株 B. bassiana 分离株之间的杀蚜能力存在差异。Bb-NCHU-141、-143 和 -153 的杀蚜能力较弱，在接种后 3 天时致死率仅为 5%，即使排除了 0.03% Tween 80 喷雾或其他致死因素的影响亦如此（图 4）。因此，采用校正死亡率公式对对照组死亡率进行标准化处理。大多数虫生真菌分离.......

讨论

芸薹属蔬菜是一类常受多种蚜虫侵扰的植物，其中包括芥菜蚜（L. erysimi）和甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）²⁶。这两种蚜虫均已有在中国台湾的报道²⁷，且有可能在同一采集地点共存。为了区分这些亲缘关系较近的蚜虫种类，本研究采用了一种基于多重引物组的分子鉴定技术²¹。通过针对芥菜蚜COI基因片段设计分子标记，我们成功鉴定了芥菜蚜，从而证实了分子标记A05Le在此用途中的可靠性²¹。

观察结果表明，仅凭体型或形态特征来区分无翅的四龄若虫与成年芥菜蚜虫，在缺乏经验的情况下具有挑战性。然而，一个关键的鉴别特征是后足胫节：四龄若虫的后足胫节呈白色，而成虫则不呈现白色（图3）。以往关于L. attenuatum、B. bassiana对抗棉蚜以及

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μL 接种环	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL 离心管	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm 培养皿	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm 昆虫吸虫器	MegaView Science	BA6001
70 mm 滤纸 NO.1	Toyo Roshi Kaisha
70% 乙醇
9 cm 培养皿	Alpha Plus Scientific	16001
琼脂	Bioman Scientific	AGR001.1	微生物学级
琼脂糖	Bioman Scientific	PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	Bioman Scientific	SDB001T
Chromas	Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin 基因组 DNA 提取试剂盒	Protech Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
血细胞计数板	Paul Marienfeld	640030
小松菜叶片（Brassica rapa var. perviridis）	泰成农场	1-010-300410
微型喷雾器
MiniAmp 热循环仪	Thermo Fisher Scientific	A37834
芥菜蚜虫（Lipaphis erysimi）
画笔	天成刷业公司	4716608400352
Parafilm M	Bemis	PM-996
研磨杵	Bioman Scientific	GT100R
沙氏葡萄糖肉汤	HiMedia	MH033-500G
SPSS Statistics	IBM
TAE 缓冲液 50x	Bioman Scientific	TAE501000
吐温 80	PanReac AppliChem	142050.1661