肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白II（“肌动蛋白-肌球蛋白收缩性”）产生的收缩力在多个尺度上对细胞和组织的形态变化至关重要，例如细胞分裂、细胞迁移、上皮折叠以及分支形态发生。要深入理解肌动蛋白-肌球蛋白收缩性在形态发生中的作用，需要能够快速失活该收缩力的技术手段，而传统的遗传学或药理学方法难以实现这一目标。本方案展示了利用基于CRY2-CIBN的光遗传二聚化系统Opto-Rho1DN来抑制肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的方法 果蝇 通过精确的时间和空间控制在胚胎中实现操作。在该系统中，CRY2 与 Rho1 的显性负性形式（Rho1DN）融合，而 CIBN 被锚定在质膜上。蓝光介导的 CRY2 与 CIBN 二聚化导致 Rho1DN 从细胞质快速转位至质膜，在此处通过抑制内源性 Rho1 使肌动球蛋白失活。此外，本文还提供了一项详细方案，介绍如何将 Opto-Rho1DN 介导的肌动球蛋白失活与激光消融技术相结合，以研究肌动球蛋白在上皮张力生成过程中的作用 果蝇 腹沟形成。该方案可应用于许多其他涉及肌动球蛋白收缩性的形态发生过程 果蝇 经过 minimal modifications 的胚胎。总体而言，这种光遗传学工具是解析肌动球蛋白收缩性在动态组织重塑过程中调控组织力学功能的有力方法。
引言
肌动球蛋白收缩力是指非肌肉肌球蛋白II（下文简称“肌球蛋白”）作用于F-肌动蛋白网络所产生的收缩力，是调控细胞形态变化和驱动组织水平形态发生过程的最重要力量之一1,2。例如，上皮细胞顶区肌动球蛋白收缩力的激活会导致顶面收缩，从而促进多种形态发生过程，包括上皮折叠、细胞挤出、去层化以及伤口愈合3,4,5,6,7。肌球蛋白的激活需要其调节轻链的磷酸化修饰。该修饰可解除肌球蛋白分子的抑制性构象，使其能够形成两端均具有多个头部结构域的双极性肌球蛋白丝束。双极性肌球蛋白丝可驱动肌动蛋白丝的反向平行运动，从而产生收缩力1,8,9。
进化上保守的Rho家族 小GTP酶RhoA（在Drosophila中为Rho1） 在多种细胞环境中....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 设置遗传杂交并准备收卵杯
- 在立体显微镜下，从光遗传学品系 UASp-CIBNpm (I)；UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) 中选取雌性果蝇（处女蝇），置于 CO2 垫上，并与母源 GAL4 驱动品系 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP 的雄性果蝇进行杂交。
注意：67 和 15 分别代表插入第二 (II) 和第三 (III) 染色体的母源 Tubulin-GAL452。本实验方案所用的 GAL4 品系还表达带有 mCherry 标签的肌球蛋白调节轻链 Sqh（Spaghetti squash）37 以及带有 GFP 标签的 E-cadherin53。光遗传学品系的果蝇可能仍携带 FM7 和 TM6 平衡染色体。母源 GAL4 驱动品系的果蝇可能仍携带 CyO 和 TM3 平衡染色体。 - 约 10 天后，选取具有以下基因型的 F1 代雌性果蝇：UASp-CIBNpm/+; 67 Sqh-mCherry/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry。将这些雌蝇与雄蝇一起设置卵收集杯。
- 确保所选 F1 代雌蝇不携带任何平衡染色体（即不应具有卷翅 [
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在未受刺激且正在进行顶端收缩的胚胎中，Sqh-mCherry 在腹侧中胚层细胞的中顶端区域富集，而 CRY2-Rho1DN-mCherry 则位于细胞质中（图 1A）。在收缩区域内进行激光消融导致组织沿前后轴（A-P轴）迅速回缩（图 1B、C）。在受刺激的胚胎中，CRY2-Rho1DN-mCherry 信号定位于质膜，而 Sqh-mCherry 的中顶端信号则完全消失（图 1A）。在受刺激胚胎中进行激光消融未引起明显的组织回缩，如 图 1B、C 所示，并在 图 1D 中进行了量化。这些结果表明，组织张力的产生依赖于顶端肌动球蛋白的主动收缩力；当 Rho1 被抑制导致肌动球蛋白失活时，顶端组织张力也随之减弱41。这些观察结果与先前.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案描述了结合光遗传学与激光消融技术，用于探测肌动球蛋白收缩力失活后组织张力的即时变化。此处所述的光遗传学工具利用Rho1的显性负性形式（Rho1DN），以急性抑制内源性Rho1及其依赖的肌动球蛋白收缩力。先前在果蝇（Drosophila）腹沟形成背景下对Opto-Rho1DN的研究表明，该工具可通过同时抑制肌球蛋白活性并促进肌动蛋白解聚，高效介导顶端肌动球蛋白收缩力的快速失活41。特别是，在顶端收缩发生时刺激胚胎，可在60秒内显著降低正在进行顶端收缩的细胞中顶端肌球蛋白信号强度41。Rho1抑制后皮层肌球蛋白的快速消失，可能是由于Rho1及其下游肌球蛋白轻链磷酸酶分别受到GTP酶激活蛋白（GAPs）调控，导致Rho1和肌球蛋白在活性与非活性状态之间快速循环所致19,54。与对肌动球蛋白影响一致的是，将光遗传学与激光消融相结合的研究显示，在顶端收缩期间激活Opto-Rho1DN会导致胚胎腹区上皮张力立即丧失.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
作者感谢Ann Lavanway提供的成像支持。作者感谢Wieschaus实验室和De Renzis实验室分享试剂，以及Bloomington果蝇品系中心提供果蝇品系。本研究由NIGMS ESI-MIRA R35GM128745基金和美国癌症协会机构研究资助#IRG-82-003-33（资助给BH）支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-10-C | 用于样品制备 |
| 60 mm × 15 mm 带盖培养皿 | Falcon | 351007 | 用于样品制备 |
| 用于遮盖显微镜的黑色布料 | Online | NA | 用于避免不必要的光照刺激 |
| Clorox Ultra Germicidal 漂白剂（8.25% 次氯酸钠） | VWR | 10028-048 | 用于胚胎去壳 |
| CO2 垫片 | Genesee Scientific | 59-114 | 用于杂交设置 |
| ddH2O | NA | NA | 用于样品制备 |
| Dumont 5 号镊子 | VWR | 102091-654 | 用于样品制备 |
| 睫毛工具（由纯红色貂毛圆头画笔 #2 制成） | VWR | 22940-834 | 用于样品制备 |
| FluoView（软件） | Olympus | NA | 用于图像采集和光遗传学刺激 |
| Halocarbon 油 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | 用于胚胎发育阶段的观察 |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | 用于图像分析 |
| MATLAB | MathWorks | NA | 用于图像分析 |
| Nikon SMZ-745 体视显微镜 | Nikon | NA | 用于样品制备 |
| Olympus FVMPE-RS 多光子显微镜，配备 InSight DS 双线超快激光器，用于同时进行双波长多光子成像，配备 25x/NA1.05 水浸物镜（XLPLN25XWMP2）以及用于光激活/刺激的红外/可见光刺激单元。该系统还配备 TRITC 滤光片（39005-BX3；AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M）和发出白光的荧光照明单元。 | Olympus | NA | 用于图像采集和光遗传学刺激 |
| SP Bel-Art 100 孔聚丙烯冷冻储存盒（黑色避光盒，用于样品转移） | VWR | 30621-392 | 用于避免不必要的光照刺激 |
| FM1403 Fluores 紫外滤光罩（橙红色塑料罩） | Bolioptics | FM14036151 | 用于避免不必要的光照刺激 |
| VITCHELO V800 头灯，带白色和红色 LED 灯 | Amazon | NA | 用于避免不必要的光照刺激 |
参考文献
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
