方法文章

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

DOI：

10.3791/65316

⸱

2023年4月21日

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

时空特异性的基因转录受到远端调控元件（如增强子和沉默子）的严格调控，这些元件依赖于与靶基因启动子的物理邻近来控制转录。尽管这些调控元件易于识别，但其靶基因却难以预测，因为大多数调控元件具有细胞类型特异性，并且在线性基因组序列中可能与靶基因相距数十万碱基对，中间跨越了多个非靶基因。多年来，启动子捕获高通量染色体构象捕获技术（Promoter Capture Hi-C, PCHi-C）一直是将远端调控元件与其靶基因关联的金标准。然而，PCHi-C 需要数百万个细胞，限制了其在稀有细胞群体（例如常从原代组织中获得的细胞）研究中的应用。为了克服这一限制，已开发出一种低成本且可定制的低起始量捕获 Hi-C 技术（low input Capture Hi-C, liCHi-C），用于鉴定调控基因组中每个基因的远端调控元件谱。liCHi-C 采用与 PCHi-C 相似的实验和计算框架，但通过尽量减少管转移步骤、调整 试剂浓度和体积，以及替换或省略某些步骤，最大限度地减少了文库构建过程中的样本损失。 总体而言，liCHi-C 使得在发育生物学和细胞功能背景下研究基因调控及基因组的时空组织成为可能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因的时间特异性表达驱动细胞分化，并最终影响生物体的发育，其表达模式的改变与多种疾病密切相关1,2,3,4,5。基因转录受到调控元件的精细调控，这些元件可分为近端调控元件（如基因启动子）和远端调控元件（如增强子或沉默子），后者通常位于其靶基因较远的位置，并通过染色质成环结构与靶基因发生物理相互作用，从而调控基因表达6,7,8。

基因组中远端调控区域的鉴定是一个广受认可的研究方向，因为这些区域含有特定的组蛋白修饰9,10,11，并包含特定的转录因子识别基序，可作为转录因子的招募平台12,13,14。此外，对于增强子和超级增强子15,16而言，它们还表现出核小体占据率较低17,18，并可转录生成非编码的eRNA19,20。

然而，每个远端调控元件的靶基因更难以预测。远端调控元件与其靶基因之间的相互作用通常具有细胞类型和刺激特异性21,22，跨度可达数百千碱基，可跨越任意方向上的其他基因23,24,25，甚至可能位于其靶基因或其他非邻近基因的内含子区域内部26,27。此外，远端调控元件也可同时调控多个基因，反之亦然28,29。这种位置上的复杂性阻碍了它们之间调控关系的精确定位，因此，在每种细胞类型中，大多数调控元件的靶基因仍不明确。

近年来，染色体构象捕获（3C）技术在研究染色质相互作用方面得到了显著发展。其中应用最广泛的是Hi-C技术，它能够生成细胞基因组各个片段之间所有相互作用的图谱30。然而，要在限制性酶切片段水平上检测到显著的相互作用，Hi-C依赖于超深度测序，这使其难以常规用于研究单个基因的调控图景。为了克服这一经济上的限制，多种基于富集的3C技术应运而生，例如ChIA-PET31、HiChIP32及其低起始量版本HiCuT33。这些技术依赖抗体来富集由特定蛋白介导的全基因组范围内的相互作用。然而，这些3C技术的独特优势也正是其应用中的主要局限：用户必须依赖于针对目标蛋白的高质量抗体，并且无法比较蛋白结合状态动态变化的实验条件。

启动子捕获高通量染色体构象捕获技术（Promoter Capture Hi-C, PCHi-C）是另一种基于富集的3C技术，可克服上述局限性34,35。通过采用生物素化RNA探针富集系统，PCHi-C能够生成与28,650个人源或27,595个鼠源注释基因启动子相互作用的全基因组高分辨率文库，这些文库也被称为启动子互作组。该方法能够在限制性酶切片段水平上检测活性与非活性启动子的显著长距离相互作用，并且无需依赖组蛋白修饰或蛋白质结合的动态变化，即可在不同条件下稳健地比较启动子互作组。近年来，PCHi-C已被广泛用于研究细胞分化过程中启动子互作组的重排36,37，揭示转录因子的作用机制38,39，以及通过非编码变异发现疾病中异常调控的潜在新基因和通路40,41,42,43,44,45,46,47,48，同时发现新的驱动性非编码突变49,50。此外，仅需调整捕获系统，该技术即可根据具体生物学问题进行定制，用于研究任意类型的互作组（例如增强子互作组51，或一组非编码变异的互作组41,52）。

然而，PCHi-C 技术至少需要 2000 万个细胞才能实施，这限制了对稀有细胞群体的研究，而这类细胞群体在发育生物学和临床应用中常常被使用。为此，我们开发了低起始量捕获 Hi-C（liCHi-C），这是一种基于 PCHi-C 实验框架的新方法，具有成本低、可定制的特点，可用于以少量细胞输入生成高分辨率的启动子互作组。通过尽量减少实验过程中的管转移、替换或省略原始 PCHi-C 方案中的步骤、大幅降低反应体积以及调整试剂浓度，最大限度地提高了文库复杂度，仅需低至 50,000 个细胞即可构建高质量文库53。

低输入量捕获Hi-C（liCHi-C）已与PCHi-C进行过性能比较，并被用于阐明人类造血细胞分化过程中启动子相互作用组的重连、发现由非编码变异导致失调的潜在新疾病相关基因和通路，以及检测染色体异常53。本文详细描述了该技术的逐步操作流程以及各个环节的质量控制，直至最终文库的构建及其计算分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为尽量减少材料损失，（1）使用低吸附DNA的离心管和吸头（参见材料表）；（2）将试剂加至管壁，避免将吸头插入样品内部；（3）如有可能，通过倒置混匀样品而非反复吹打，随后离心收集样品。

1. 细胞固定

  1. 悬浮生长的细胞
    1. 收集 50,000 至一百万个细胞，并将其置于一个 DNA 低吸附性的 1.5 mL 离心管中。
      注意：本研究所用的细胞类型详见代表性结果部分。
    2. 使用固定角转子离心机在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟，并用移液器吸除上清液。
    3. 在室温下，用 1 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基重悬细胞。
    4. 加入 143 µL 无甲醇的 16% 甲醛，使终浓度达到 2%，并混匀。
    5. 在室温下旋转孵育 10 分钟，以固定细胞。
      注意：请尽可能准确控制 10 分钟的孵育时间。细胞固定过度或不足均可能导致文库质量下降。
    6. 加入 164 µL 冰冷的 1 M 甘氨酸以终止反应，并混匀。在室温下旋转孵育 5 分钟。
    7. 将细胞进一步在冰上孵育 15 分钟，每隔约 5 分钟轻轻颠倒混匀一次。
    8. 使用固定角转子离心机在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 10 分钟，并去除上清液。
    9. 用 1 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，洗涤细胞。
    10. 在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 10 分钟，并去除上清液。
      ​注意：细胞沉淀可用液氮或干冰速冻，并于 -80 °C 保存。
  2. 贴壁细胞
    1. 用 1× PBS 清洗培养皿中的细胞。
    2. 在室温下准备足量的 RPMI 1640 培养基，其中添加 10% FBS 和无甲醇的 2% 甲醛，足以覆盖整个培养皿。
    3. 将添加了补剂的培养基加入含有细胞的培养皿中，在室温下轻轻摇动孵育 10 分钟，以固定细胞。
      ​注意：请尽可能准确控制 10 分钟的孵育时间。细胞固定过度或不足均可能导致文库质量下降。
    4. 加入 1 M 甘氨酸至终浓度为 0.125 M，通过轻轻摇动混合以终止反应。
    5. 在室温下轻轻摇动孵育 5 分钟。
    6. 将细胞进一步在 4 °C 下孵育 15 分钟，每隔 3–4 分钟轻轻摇动混合一次。
    7. 移除培养基，并用冰冷的 1× PBS 洗涤细胞。
    8. 用细胞刮刀刮下细胞并转移至一个 1.5 mL DNA 低吸附性离心管中。用 0.5–1 mL 冰冷的 1× PBS 擦洗培养皿，确保细胞完全转移。
    9. 使用固定角转子离心机在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 10 分钟，并去除上清液。细胞沉淀可用液氮或干冰速冻，并于 -80 °C 保存。

2. 裂解与消化

  1. 用1 mL冷裂解缓冲液（表1）重悬细胞，以破坏细胞膜。仅加入缓冲液通常足以重悬细胞，但如有必要，可通过轻微涡旋进一步重悬。
  2. 冰上孵育30分钟，每约5分钟轻柔翻转混匀一次。在4 °C下以1,000 × g离心10分钟，弃上清。用500 µL冷的1.25× HindIII限制性酶缓冲液2重悬细胞核（见材料表）。
  3. 在4 °C下以1,000 × g离心10分钟，弃上清。将细胞核重悬于179 µL的1.25× HindIII限制性酶缓冲液2中。
  4. 加入5.5 µL的10%十二烷基硫酸钠（SDS；见材料表）并混匀。细胞可能形成团块，此现象正常，需尽可能通过涡旋分散。将样品置于恒温金属浴中，37 °C孵育1小时，同时以950 rpm振荡。
  5. 通过加入37.5 µL的10% Triton X-100淬灭SDS，并混匀。将样品置于恒温金属浴中，37 °C孵育1小时，同时以950 rpm振荡。
  6. 加入7.5 µL HindIII（100 U/µL；见材料表）以消化染色质，并混匀。将样品置于恒温金属浴中，37 °C过夜孵育，同时以950 rpm振荡。
  7. 次日早晨，额外加入2.5 µL HindIII（100 U/µL），继续在恒温金属浴中37 °C孵育1小时，同时以950 rpm振荡，以确保染色质充分消化。
    注意：作为消化效率对照的一部分（见步骤5.1），转移相当于20,000至40,000个细胞核的样品至另一管中，作为未消化对照。消化完成后，再次转移相同数量的细胞至另一管中，作为已消化对照。若起始材料有限，建议将消化效率检测作为独立实验进行。

3. 连接与解交联

  1. 将样品置于冰上冷却。配制预混液，并加入以下试剂以填补并生物素标记限制性片段的突出末端：3 µL 10x 限制性内切酶缓冲液 2、1 µL 无核酸酶水、0.75 µL 10 mM dCTP、0.75 µL 10 mM dTTP、0.75 µL 10 mM dGTP、18.75 µL 0.4 mM 生物素-14-dATP 以及 5 µL 5 U/µL Klenow 酶（参见材料表）。37 °C 孵育 75 分钟，每隔约 15 分钟轻柔颠倒混匀一次。
  2. 将样品置于冰上冷却。配制预混液，并加入以下试剂以连接已填补的 DNA 末端：50 µL 10x 连接缓冲液、2.5 µL 20 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、12.5 µL 1 U/µL T4 DNA 连接酶以及 173 µL 无核酸酶水（参见材料表）。
  3. 16 °C 孵育 4–6 小时，每隔约 1 小时轻柔颠倒混匀一次。随后在室温孵育 30 分钟。加入 30 µL 10 mg/mL 蛋白酶 K 以解除染色质交联，并混匀。65 °C 孵育过夜。
  4. 次日早晨，额外加入 15 µL 10 mg/mL 蛋白酶 K，继续在 65 °C 孵育 2 小时，以确保染色质充分解除交联。

4. DNA 纯化

  1. 将样品冷却至室温，并转移至适合进行苯酚-氯仿纯化的合适离心管中。
  2. 加入1体积（545 µL）苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），用于纯化DNA，并通过剧烈振荡混匀。
  3. 在室温下以12,000 × g 离心5分钟，将上层水相（545 µL）转移至2 mL低吸附DNA离心管中。
  4. 加入以下试剂以沉淀DNA：1,362.5 µL预冷至-20 °C的100%乙醇、54.5 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）以及2 µL 15 mg/mL糖原作为共沉淀剂。
  5. 在-80 °C孵育1小时，或在-20 °C过夜。
  6. 在4 °C以16,000–21,000 × g 离心30分钟，弃去上清液。DNA沉淀应可见。
  7. 加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，涡旋混匀后在室温下以16,000–21,000 × g 离心10分钟。
  8. 弃去上清液，让沉淀在空气中自然干燥。将DNA沉淀重悬于130 µL无核酸酶水中。
  9. 通过荧光定量法测定浓度（参见材料表）。纯化的3C样品可在-20 °C保存数月，之后继续进行后续实验步骤。

5. 可选的质量控制

  1. 评估消化效率。按照之前所述方法，对步骤2.13中获得的未消化和已消化的对照样品进行解交联及苯酚:氯仿DNA纯化。将DNA沉淀重悬于10 µL无核酸酶水中。测定浓度，必要时将所得DNA稀释至4 ng/µL。
  2. 使用4 ng未消化和已消化的对照DNA进行定量PCR，引物应跨越含有和不含HindIII靶点的开放染色质位点（参见 表2 用于引物设计）。根据先前发表的报告计算消化效率35.
    注意：连接效率通过以下公式以百分比形式计算：连接效率 (%) = 100 - 100/(2^[(HindIII 消化组的 Ct 值 - 未消化组的 Ct 值) - (HindIII 对照组的 Ct 值 - 无 HindIII 对照组的 Ct 值)]) （参见 表3），该方法考虑了每对引物在未消化和消化对照样本中获得的Ct值差异。
  3. 通过常规聚合酶链式反应（PCR）（0.2 mM dNTP，0.4 µm 正向和反向引物，0.1 和 U/µL 热启动聚合酶）检测相互作用的灵敏度，使用跨越长距离和短距离细胞不变相互作用的引物（参见 表 2 用于引物设计）。使用50-100 ng的3C材料（分别用于短程和长程相互作用），并在以下条件下进行扩增：98 °C预变性15 min，随后进行37个循环（98 °C变性30 s、60 °C退火1 min、72 °C延伸1 min），最后72 °C延伸10 min，反应结束后置于4 °C保存。
    注意：如果获得的 DNA 量少于 2 µg，则仅需检测一个长距离和一个短距离相互作用，而非整个相互作用面板。
  4. 使用1.6%琼脂糖凝胶在1×TBE缓冲液中电泳分离产物，并检测相应PCR扩增片段的存在54.
    注意：由于不可预测性 "剪切与粘贴" 基因组中可能出现非特异性条带。只要观察到正确大小的条带，即视为正确。
  5. 通过使用 HindIII 和 NheI 对短片段 PCR 产物进行差异性消化，评估生物素填补和连接的效率（参见 材料表），两种酶都加或都不加（水），并将产物在1×TBE 1.6%琼脂糖凝胶上电泳。正确的补平和连接会消除原有的HindIII酶切位点并创建一个新的NheI酶切位点，因此扩增产物仅在存在NheI时被切割。
    ​注意：为尽量减少材料损失，从相互作用对照中取出2.5 µL短片段PCR产物，进行5次重扩增，用于后续填补和连接对照实验。

6. 超声处理

  1. 将130 µL样品（若部分样品已用于对照，则用无核酸酶水补足）转移至适合超声处理的比色皿中。
  2. 设置水浴超声仪，并使用以下参数进行超声处理（参数已针对材料表中所述型号和比色皿优化）：工作周期：20%；峰值入射功率：50；每脉冲循环次数：200；时间：65 s；温度范围：6–10 °C（最佳温度为8 °C）。
  3. 将样品转移至新的1.5 mL低吸附DNA管中。

7. 末端修复

  1. 配制主混合液，并加入以下试剂，以修复超声处理过程中产生的DNA片段不平整末端：18 µL 10x连接缓冲液、每种18 µL的2.5 mM dNTP混合液、6.5 µL 3 U/µL T4 DNA聚合酶、6.5 µL 10 U/µL T4多核苷酸激酶（PNK）以及1.3 µL 5 U/µL Klenow酶（参见材料表）。
  2. 在20 °C条件下孵育样品30分钟，然后用Tris-低EDTA（TLE）缓冲液（参见表1）补足至300 µL。

8. 生物素拉下实验

  1. 每个样本取 150 µL C1 链霉亲和素磁珠（参见材料表），转移至 1.5 mL 离心管中，将离心管置于 1.5 mL 管磁力架上，静置 2–3 分钟，或直至所有磁珠吸附至管壁。弃去上清液，保留磁珠。
  2. 用 400 µL 1× 吐温缓冲液（TB；参见表 1）洗涤磁珠。洗涤时加入缓冲液，并通过轻柔涡旋重悬磁珠。将离心管重新放回磁力架，静置 2–3 分钟，或直至所有磁珠吸附至管壁。弃去上清液，保留磁珠。
  3. 用 300 µL 1× 无吐温缓冲液（NTB；参见表 1）洗涤磁珠。将磁珠重悬于 300 µL 2× NTB（参见表 1）中。
    注意：使用不含去污剂的缓冲液洗涤时，磁珠可能在管壁周围形成一层类似粉尘的薄层。此现象属正常，不影响实验结果。
  4. 将上述含 300 µL 磁珠的 2× NTB 溶液与 300 µL 样本混合。室温下旋转孵育 15 分钟，以富集含生物素的有信息价值的 DNA 片段。此时文库已结合至 C1 链霉亲和素磁珠上。
  5. 用 400 µL 1× NTB 缓冲液洗涤磁珠。再用 100 µL TLE 缓冲液洗涤磁珠，随后将其重悬于 35.7 µL TLE 缓冲液中。

9. dATP加尾、接头连接和PCR扩增

  1. 准备主混合液，并向样本中加入以下试剂以对修复的DNA片段末端进行dATP加尾：5 µL 10x限制性酶缓冲液2、2.3 µL 10 mM dATP和7 µL 5 U/µL Klenow exo-。在37 °C孵育30分钟。
  2. 将样本在65 °C进一步孵育10分钟以灭活Klenow exo-，然后置于冰上冷却。用300 µL 1x TB洗涤磁珠，再用300 µL 1x NTB洗涤磁珠。
  3. 用100 µL 1x连接缓冲液洗涤磁珠，随后将其重悬于50 µL 1x连接缓冲液中。向样本中加入4 µL 15 µM预退火接头混合物（见表2）和1 µL 2,000 U/µL T4 DNA连接酶（见材料表）。
  4. 在室温下孵育2小时。用400 µL 1x TB洗涤磁珠，再用200 µL 1x NTB洗涤磁珠，最后用100 µL 1x限制性酶缓冲液2洗涤磁珠。
  5. 用50 µL 1x限制性酶缓冲液洗涤磁珠，随后将其重悬于50 µL 1x限制性酶缓冲液2中。
  6. 混合以下试剂以制备PCR反应扩增文库：含文库的磁珠50 µL、含酶的2x PCR主混合液250 µL、F+R引物各25 µM共12 µL（见表2）以及无核酸酶水188 µL。
  7. 按照以下条件进行PCR扩增（将PCR反应混合液分装为每份50 µL）：98 °C预变性40秒，随后进行X个循环（98 °C变性10秒、65 °C退火30秒、72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸10分钟，然后在4 °C保存。
    注：对于二倍体细胞，若目标是在文库捕获前获得500–1,000 ng的产量，可采用以下循环数作为优化起始点：一百万个细胞使用8个循环；25万个细胞使用10个循环；5万个细胞使用12个循环。
  8. 将同一样本的所有50 µL PCR反应产物合并至一个1.5 mL低吸附DNA管中，置于1.5 mL管磁力架上，静置2–3分钟或直至所有磁珠吸附至管壁。
  9. 将含有文库的上清液（500 µL）转移至新的1.5 mL低吸附DNA管中。若上清液有损失，可用TLE缓冲液补足至500 µL。C1链霉亲和素磁珠不再需要。
  10. 使用磁性磁珠纯化法进行双端筛选55（0.4–1体积），根据所添加磁性磁珠中聚乙二醇和盐的浓度，选择性去除过大（>1,000 bp）或过小的片段及PCR引物（<200 bp）。
  11. 向文库中加入200 µL（0.4体积）储存磁珠，涡旋混匀。在室温下旋转孵育10分钟。
  12. 将管置于磁力架上，静置2–3分钟或直至所有磁珠吸附至管壁，将含有文库的上清液（不含较大片段）转移至新的1.5 mL低吸附DNA管中。
  13. 浓缩磁珠：取750 µL储存磁珠置于1.5 mL管中，放置于磁力架上，静置2–3分钟或直至磁珠完全吸附，弃去上清液，再用涡旋法将磁珠重悬于300 µL新鲜储存磁珠中。
  14. 将此300 µL浓缩磁珠加入样本中（1体积），涡旋混匀。在室温下旋转孵育10分钟。置于磁力架上，静置2–3分钟或直至磁珠吸附完全，弃去上清液（含较小片段和PCR引物）。
  15. 用1 mL 70%乙醇洗涤磁珠三次。操作时，将乙醇加入仍处于磁力架上的管中，尽量避免扰动磁珠，静置30–60秒后，在不扰动磁珠的前提下弃去上清液。
  16. 让磁珠自然风干，随后通过涡旋将其重悬于21 µL TLE缓冲液中。
    注：磁珠过度干燥会影响DNA洗脱时的得率。建议在磁珠表面乙醇挥发、不再呈现"光亮"状态后立即用TLE缓冲液重悬。
  17. 将样本置于37 °C恒温金属块中孵育10分钟，以从磁珠上洗脱文库。将管放入磁力架，将含有文库的上清液转移至新的1.5 mL低吸附DNA管中。
  18. 通过自动化电泳测定文库大小和浓度（见材料表）。纯化的Hi-C样品可在-20 °C保存数月，之后再继续进行后续实验流程。

10. 文库捕获

  1. 使用 500–1,000 ng 的文库。通过真空浓缩仪干燥 DNA 以浓缩文库，然后将沉淀物重悬于 3.4 µL 无核酸酶水中。
  2. 向样品中加入靶向富集试剂盒中的以下阻断剂（参见材料表）：2.5 µL 阻断剂 1、2.5 µL 阻断剂 2 和 0.6 µL 针对接头的定制寡核苷酸阻断剂。
  3. 充分重悬后，将溶液转移至 0.2 mL PCR 条管中，在热循环仪中于 95 °C 孵育 5 分钟，随后在 65 °C 孵育 5 分钟（使用加热盖）。孵育完成后，将反应管继续保留在 65 °C 条件下。
  4. 按每个样品（共 13 µL）配制杂交溶液，混合靶向富集试剂盒中的以下试剂（参见材料表），并在室温下置于实验台上备用：6.63 µL 杂交液 1、0.27 µL 杂交液 2、2.65 µL 杂交液 3 和 3.45 µL 杂交液 4。
  5. 每个样品使用 1.5 µL 无核酸酶水稀释 0.5 µL 的 RNase 阻断剂（来自靶向富集试剂盒）。将每个样品所需的 5 µL 生物素化 RNA 置于冰上解冻，并加入 2 µL 稀释后的 RNase 阻断剂。混合后置于实验台上室温保存。
  6. 将 13 µL 杂交溶液加入含 RNase 阻断剂的 7 µL 生物素化 RNA 中，充分混匀。
  7. 在热循环仪保持 65 °C 的条件下，将含生物素化 RNA 的杂交溶液（共 20 µL）转移至已加阻断剂的文库中。牢固关闭管盖，并在热循环仪中于 65 °C 过夜孵育。
    ​注意：当同时处理多个样品时，为尽量减少样品蒸发（蒸发可能导致 RNA-DNA 杂交效率降低），建议使用多通道移液器同时将生物素化 RNA 加入各个文库中。

11. 生物素拉下实验与PCR扩增

  1. 将每份样品的 50 µL T1 链霉亲和素磁珠转移至 1.5 mL DNA 低吸附离心管中，置于 1.5 mL 管磁力架上，静置 2–3 分钟或直至所有磁珠吸附至管壁。弃去上清液，保留磁珠。使用靶向富集试剂盒中的结合缓冲液，以每次 200 µL 洗涤磁珠三次。
  2. 将磁珠重悬于 200 µL 结合缓冲液中。在热循环仪中于 65 °C 条件下，将样品转移至重悬的 T1 链霉亲和素磁珠中，室温旋转孵育 30 分钟。
  3. 使用靶向富集试剂盒中的洗涤缓冲液 1，以 200 µL 洗涤磁珠一次，室温旋转孵育 15 分钟。随后使用预热至 65 °C 的洗涤缓冲液 2，以每次 200 µL 洗涤磁珠三次。每次洗涤之间，在 65 °C 热块中孵育 10 分钟，以 300 rpm 震荡。
  4. 使用 200 µL 1× 限制性酶切缓冲液 2 洗涤磁珠，随后将磁珠重悬于 30 µL 1× 限制性酶切缓冲液 2 中。
  5. 混合以下试剂以制备用于扩增文库的 PCR 反应体系：含文库的磁珠 30 µL、含酶的 2× PCR 预混液 150 µL、F + R 引物（各 25 µM）7.2 µL（参见 表 2）、无核酸酶水 112.8 µL。
  6. 按以下条件进行 PCR 扩增（将 PCR 反应混合物分装为每管 50 µL）：98 °C 预变性 40 秒，随后进行 4 个循环（98 °C 变性 10 秒，65 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），最后 72 °C 延伸 10 分钟，4 °C 保存。
  7. 将同一份样品的所有 50 µL PCR 反应产物合并至一个 1.5 mL DNA 低吸附离心管中，置于 1.5 mL 管磁力架上，静置 2–3 分钟或直至所有磁珠吸附至管壁。
  8. 将含有文库的上清液（300 µL）转移至新的 1.5 mL DNA 低吸附离心管中。若上清液有损失，用 TLE 缓冲液补足至 300 µL。T1 链霉亲和素磁珠不再需要。
  9. 使用磁性磁珠（0.9 倍体积；参见 材料表）进行 DNA 纯化。向样品中加入 270 µL 原液磁珠，并通过涡旋充分混匀。
  10. 室温旋转孵育 10 分钟。
  11. 将离心管置于磁力架上，静置 2–3 分钟或直至所有磁珠吸附至管壁，随后弃去上清液。
  12. 使用 1 mL 70% 乙醇洗涤磁珠三次。操作时，将乙醇加入仍置于磁力架上的离心管中，注意避免扰动磁珠，静置 30–60 秒后，在不扰动磁珠的前提下弃去上清液。
  13. 让磁珠自然风干，随后通过涡旋将其重悬于 21 µL TLE 缓冲液中。
    注：磁珠过度干燥可能降低 DNA 洗脱得率。建议在磁珠表面乙醇挥发、不再呈现"光亮"状态后立即进行重悬。
  14. 将样品置于热块中，37 °C 孵育 10 分钟，以从磁珠上洗脱文库。
  15. 将离心管置于磁力架上，将含有文库的上清液转移至新的 1.5 mL DNA 低吸附离心管中。
  16. 通过自动化电泳测定文库的片段大小与浓度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C 仅需 50,000 个细胞即可构建高质量、高分辨率的全基因组启动子互作图谱文库53。这得益于在实验流程中大幅减少反应体积、全程使用低吸附DNA塑料耗材，并从原始方案中去除了多个导致样本显著损失的非必要步骤。这些步骤包括解交联后的苯酚纯化、生物素去除，以及后续的苯酚-氯仿纯化和乙醇沉淀。此外，通过重新组织 Hi-C 文库构建步骤（包括生物素富集、A尾加接、接头连接、PCR 扩增和双端磁珠筛选，以及PCR产物纯化），我们进一步省去了一步不必要的DNA纯化操作。实验流程概览见图1A。

为评估文库质量，需在整个实验流程中设置多个对照，其中第一个是计算基因组消化效率；通常认为消化效率超过80%即为合格（表3）。建议在单独的实验中检测该细胞类型的消化效率，以避免在单次liCHi-C实验中损失大量样本材料。第二，在超声打断和末端修复之前，建议通过常规PCR扩增细胞类型不变的染色质相互作用，以检测相互作用检测的灵敏度（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C 能够利用与 PCHi-C 相似的实验框架，但所需细胞数量显著减少，从而生成高分辨率的启动子互作组图谱文库。这一优势主要通过省略不必要的步骤实现，例如苯酚纯化和生物素去除。在经典的细胞核内连接 Hi-C 协议57 及其衍生技术 PCHi-C 中，需将未连接的限制性酶切片段上的生物素去除，以避免富集后续无信息价值的 DNA 片段。跳过该步骤及其后续的 DNA 纯化过程，并不会显著降低有效读段的比例（图 3A），同时避免了可能造成 DNA 损失的纯化步骤。在超声破碎后的 Hi-C 文库构建过程中重新设计流程，可通过双端筛选直接作为纯化步骤，从而省去另一次不必要的纯化。所有这些改进通过最大限度减少离心管转移操作，结合反应体系体积的缩小、试剂浓度的优化以及低吸附 DNA 塑料耗材的使用，使得仅用 50,000 个细胞即可构建高质量文库成为可能。需要谨记的是，起始细胞数量在一定程度上决定了文库复杂性，从而影响显著互作的数量。尽管使用 50,000 个细胞构建的文库仍保留了细胞类型特异性和稳定的拓扑结构特征

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Javierre实验室其他成员对本手稿提供的反馈意见。感谢CERCA项目、加泰罗尼亚自治区政府以及Josep Carreras基金会提供的机构支持。本研究由欧洲区域发展基金/西班牙科学与创新部（RTI2018-094788-A-I00）、欧洲血液学协会（4823998）以及西班牙抗癌协会（AECC）（项目编号LABAE21981JAVI）提供资金支持。BMJ由La Caixa银行基金会Junior Leader项目（LCF/BQ/PI19/11690001）资助，LR由AGAUR FI博士后奖学金（2019FI-B00017）资助，LT-D由FPI博士后奖学金（PRE2019-088005）资助。我们感谢巴塞罗那自治大学生物化学与分子生物学博士项目提供的支持。 所有资助方均未参与实验设计或手稿撰写的任何环节。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4 mM 生物素-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002S在文稿中称为限制性酶切缓冲液2
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA连接酶反应缓冲液New England BiolabsB0202S
16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇Thermo Scientific28908
20 mg/mL 牛血清白蛋白New England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light 管Qiuantabio2302820用于第4节中的酚-氯仿纯化（DNA纯化）。Phase Lock Gel管是一种商业化的专用离心管，设计用于在酚-氯仿纯化后最大化DNA回收率，同时通过含有中等密度的树脂将有机相与水相分隔开来，防止有机相中的污染物残留。使用前应以12,000 × g离心30秒，确保树脂充分沉降至管底
文库扩增用接头和PCR引物Integrated DNA Technologies-作为单个引物购买，经PAGE纯化用于NGS
细胞刮刀Nunc179693或任何其他品牌
离心机（适用于1.5 mL离心管的固定角转子）任何品牌
CHiCAGO R软件包1.14.0
CleanNGS磁珠CleanNACNGS-0050
dATP、dCTP、dGTP、dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123A或任何其他品牌
DNA LoBind管，1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind管，2 mLEppendorf30108078
DNA聚合酶I大片段（Klenow）5000单位/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠Invitrogen65002用于第8节中预捕获文库的生物素富集（生物素富集）
Dynabeads MyOne 链霉亲和素T1磁珠Invitrogen65602用于第11节中后捕获文库的生物素富集（生物素富集和PCR扩增）
DynaMag-2Invitrogen12321D或任何适用于1.5 mL离心管的磁力架
无水乙醇VWR20821.321
经认证的胎牛血清（FBS）Gibco10270-106或任何其他品牌
甘氨酸Fisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue共沉淀剂InvitrogenAM9515用于第4节中的DNA共沉淀（DNA纯化）
HiCUP0.8.2
HindIII，100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000单位/mLNew England BiolabsM0212L
低吸附滤芯吸头 (10 µL, 20 µL, 200 µL 和 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 聚焦超声破碎仪Covaris500295
Micro TUBE AFA Fiber 预切裂口卡扣盖 6 x 16 mm 管Covaris520045用于第6节中的超声处理（超声处理）
NheI-HF，100 U/µLNew England BiolabsR3131M
无核酸酶分子生物学级水Sigma-AldrichW4502
用于质量控制的PCR引物Integrated DNA Technologies-
PCR排管 和管盖Agilent Technologies410022, 401425
酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA的溶液饱和Sigma-AldrichP3803
Phusion 高保真PCR预混液（含HF缓冲液）New England BiolabsM0531L用于第9节中文库扩增（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）
和第11节（生物素富集和PCR扩增）
蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）Roche11873580001
重组蛋白酶K，PCR级Roche3115836001
Qubit 1x dsDNA 高灵敏度检测试剂盒InvitrogenQ33230用于第4节中沉淀后DNA的定量（DNA纯化）
Qubit检测管InvitrogenQ32856
rCutsmart缓冲液New England BiolabsB6004S
RPMI 1640培养基 1x + GlutaMAXGibco61870-010或任何其他品牌
SDS - 分子生物学用10%溶液PanReac AppliChemA0676
乙酸钠 pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect 定制3-5.9 Mb文库Agilent Technologies5190-4831定制的小鼠或人源捕获系统，用于靶向捕获
SureSelect 靶向富集试剂盒Box 1Agilent Technologies5190-8645用于靶向捕获
SureSelect 靶向富集试剂盒 ILM PE 全接头Agilent Technologies931107用于靶向捕获
T4 DNA连接酶 1 U/µLInvitrogen15224025用于第3节中的连接反应（连接与去交联）
T4 DNA连接酶 2000000/mLNew England BiolabsM0202T用于第9节中的连接反应（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）
T4 DNA聚合酶 3000单位/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000单位/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200仪器Agilent Technologies用于第9节中的自动化电泳（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）和
第11节（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用
Tapestation试剂Agilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,用于第9节中的自动化电泳（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）和
第11节（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用
分子生物学级Triton X-100PanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16(2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384(2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610(2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161(2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121(2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222(2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923(2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165(2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526(2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154(2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615(2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81(2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268(2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923(2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86(2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310(2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175(2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127(2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859(2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924(2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938(2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Hi C Hi C DNA

相关文章