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方法文章

新型冷却细胞处理系统对胰岛细胞分离实验室影响的评估

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DOI：

10.3791/65321

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2023年8月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

本文内容

摘要

本方案描述了一种定制的细胞冷却处理系统，该系统可与符合药品生产质量管理规范（GMP）的洁净室兼容，以提高细胞处理后的存活率。

摘要

标准的细胞治疗设备，包括用于临床移植中纯化人胰岛细胞的金标准细胞处理仪，通常不具备制冷功能，可能导致细胞在离心过程中暴露于较高温度。定制的冷却系统可直接提升人胰岛细胞的存活率与功能。本研究旨在评估一种新开发的、易于获取且仅需最小化改装的制冷型细胞处理系统的有效性，并考察其对人细胞存活率以及GMP洁净室环境的影响。 该冷却系统采用机械制冷的热交换器，设定温度为-30 °C，通过在离心机盖上钻孔，将冷却的医用级干燥空气输送至细胞处理碗中。鉴于卡塔尔胰腺供体资源有限，系统验证采用 pooled human bone marrow buffy coat（人骨髓富集单个核细胞层）进行连续密度梯度纯化。在C级和B级洁净室环境中测量了无菌性、气流扰动及颗粒物数量。冷却型细胞处理仪周围未产生湍流，且未超出GMP洁净室标准规定的0.5 µm和5 µm空气悬浮颗粒限值。在非制冷细胞处理仪中，收集步骤开始和结束时温度分别上升至21.50 °C ± 0.34 °C和21.93 °C ± 0.20 °C；而在制冷型细胞处理仪中，温度仅升至10.9 °C ± 0.17 °C和11.16 °C ± 0.35 °C（p <0.05）。制冷型细胞处理仪显著提高了单个核细胞组分的回收率（98%）以及处理后的细胞活力（100% ± 2%）。新型冷却系统能有效降低细胞处理仪运行过程中产生的热量，同时对GMP洁净室环境的颗粒物水平无不良影响。本文所述的制冷型细胞处理仪是一种低成本（不含税、清关及运输费用时为16,000美元）、侵入性极小且高效的冷却解决方案。目前，该技术已在中国台湾GMP细胞治疗设施 中应用于临床项目的人胰岛细胞分离与移植。

引言

对于重度1型糖尿病患者，胰岛移植可恢复内源性胰岛素分泌，已在多个国家成为标准治疗方案1胰岛分离是一种多步骤操作，包括胰腺的温热酶解和机械消化，随后进行冷却阶段以恢复已消化的组织，并利用细胞分离仪通过连续或非连续密度梯度对胰岛进行纯化。快速降温可减缓酶解过程，并保护胰岛免受腺泡细胞释放的消化酶的损伤。细胞分离仪最初设计用于在室温下分离血液中的细胞成分。21989年，该方法被重新用于纯化人胰腺朗格汉斯岛。3三十年来，人类胰岛已通过细胞处理仪中的不连续梯度离心法，用于临床试验，以及近期的标准治疗。4 或连续密度梯度1 使用梯度生成器制备1 或同等的计算机控制混合器5,6,7其他研究团队已报道使用大型圆柱形塑料瓶从大型哺乳动物和人类中分离胰岛8,7,9显著提高了纯化效率和胰岛质量。

事实上，考虑到临床移植中纯化人胰岛的金标准10,11，当时制造的细胞处理仪并未配备制冷装置。由于缺乏制冷，胰岛在纯化过程中暴露于逐渐升高的温度下。在离心过程中，转子的机械摩擦会导致温度不受控制地上升12,13。后来，胰岛分离中心对细胞处理仪加装了冷却系统，结果显著提高了葡萄糖诱导的胰岛素分泌能力和细胞活力，证实了在纯化过程中维持胰岛低温的优势14,15。

需要注意的是，在20世纪80年代末，曾研制出10台带制冷功能的原型机，旨在降低密度梯度纯化过程中胰岛细胞的损伤，但此后未受到进一步关注。这些细胞处理仪原型机采用纺锤轴和转碗冷却方式，并使用冷却的聚乙二醇。特别是，胰岛纯化溶液（包括器官保存液和多糖密度梯度溶液）在室温或高于室温条件下使用时，可能对胰岛细胞的活力产生不利影响16,17,18。为应对转子摩擦导致的温度不受控上升问题，研究人员评估了多种用于胰岛细胞纯化的细胞处理仪冷却策略，并与原始的非制冷型细胞处理仪进行了比较。在人类胰岛纯化过程中，已有多种尝试用于降低细胞处理仪的温度。细胞处理仪可临时或永久安置于专门设计的冷藏室中，以在梯度离心期间维持0–8 °C的温度19，该方法目前在伊利诺伊大学芝加哥分校19、迈阿密大学14、牛津大学设施15以及旧金山大学（定制冷却装置包裹整个细胞处理仪）的胰岛分离中心使用 。另一种改进方案包括在日内瓦、瑞典和捷克共和国采用电子控制的液氮冷却系统对细胞处理仪的纺锤轴进行核心冷却15,19。2000年代中期的另一种替代方案是在里尔大学通过空调单元对细胞处理仪进行核心冷却12，或通过液体冷却轴实现降温。

在GMP洁净室环境中，细胞处理器的冷却改装不易获得，且存在风险（如湿度、冷凝水积聚），并可能导致保修失效以及制造商拒绝提供设备维护服务。因此，一些胰岛分离中心（包括意大利米兰、挪威奥斯陆和苏格兰爱丁堡）在胰岛纯化过程中不使用细胞处理器的冷却系统15。

本研究旨在评估一种新开发的、易于获取的冷却装置与经过最小化改造的细胞处理系统联合使用的有效性。简而言之，此处所述的气冷式冷却器是一种机械制冷的热交换器，可将每分钟1标准立方英尺（SCFM）干燥气体的温度控制在-40 °C至-100 °C之间。该冷却系统需要供应干燥的医用空气。空气将流经管路和热交换器，并通过一个（7.9 mm）喷嘴排出。喷嘴内部设有加热器，用于调节气流温度。另购得一个备用的实心塑料离心盖，并进行了最小程度的改造：在盖子上钻出一个直径为13.3 mm的孔，通过该孔将冷却器喷嘴产生的冷空气输送至细胞处理系统。经调节温度的冷医用空气被注入细胞处理系统的离心碗内部，从而持续控制液体或密度梯度的温度。

我们评估了冷却细胞处理器的技术性能以及冷却元件对GMP洁净室环境的影响。主要目标是在人胰岛纯化过程中实现稳定且较低（<10 °C）的温度，以维持细胞活性。通过采用血沉棕黄层密度分离作为胰岛分离的替代模型，我们确定了该冷却方案对细胞活力的有效性。

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方案

本方案使用了根据机构废弃指南判定为不适合使用的废弃全血。无需机构审查委员会（IRB）批准和知情同意。

1. 冷却细胞处理器的设置

注意：所有操作必须在洁净室环境中进行，且工作人员必须遵守洁净室着装规程。

  1. 设备采购
    1. 购买一个备用的有机玻璃盖。购买冷却设备系统，包括机械制冷气体流温控器、空气干燥器、压力和流量调节器，以及保修服务（可选）。参考材料见材料表。
      注：总费用为16,133美元，不含运输或海关费用。
    2. 订购医用干燥空气，即符合标准等级（欧洲药典参考1238）的压缩医用气体，由当地医用气体供应商提供。购买2个容量为6.8 m3 的气瓶（47 L：直径23 cm × 长度153 cm）。
  2. 设备安装（图1 和 图2）
    1. 将设备搬入GMP洁净室（进入洁净室前需按照GMP规程进行消毒）。
    2. 对于医用级压缩空气，应安装气体管道，避免将气瓶直接放置在洁净室内。
  3. 对细胞处理器进行冷却改造
    1. 首先取下有机玻璃罩。保留原始的有机玻璃罩，以防保修出现问题。在备用盖板上钻一个孔，其直径应与冷却装置喷嘴的外径相匹配，以防止离心机盖破裂（推荐直径为13.3 mm）。
    2. 使用泡沫圆片固定支架。此举可防止盖板破损或刮伤，确保冷却喷嘴在细胞处理器上方位置固定，防止因注入空气压力过高导致盖板过度弯曲，支撑喷嘴重量，并最终保障操作人员在实验过程中能安全、自由地访问细胞处理器的所有必要功能。
    3. 通过将冷却喷嘴插入有机玻璃盖上的孔，将冷却系统连接至细胞处理器，并用支架和泡沫垫固定。
    4. 将制冷主机放置在距离喷嘴最远8英尺（2.44 m）的位置。将温控器置于独立机柜中，并放置在距离制冷主机不超过6英尺（1.83 m）的范围内。
    5. 将冷却器设定温度设为-40 °C，用于冷却气流。出口空气温度在数字显示器上持续显示，分辨率为0.1 °C。通过温控器将出口温度数字设定为0.1 °C。
    6. 在气体进入冷却器之前，通过压力和流量调节模块（图2）调节空气供应的压力和流速，分别设定为55 psi和4 SCFM，以实现在-30 °C ± 2 °C条件下气流的最佳状态。
    7. 确认医用气源输出压力调节至5 bar，且可持续供应至少90分钟，以确保压缩空气可冷却至-30 °C。
      ​注：医用干燥空气为压缩医用气体，完全加压的干燥空气符合标准等级。
    8. 通过离心机盖上钻出的孔，将连接至细胞处理器盖的冷却喷嘴输出5 bar压力的气体。将冷却后的医用空气注入细胞处理器的离心碗内（图2）。选择空气注入位置时，应使冷却空气垂直吹向离心转子的铝制边缘。
    9. 准备细胞处理器时，确保转子处于室温（18 °C）。将冷却系统的自动温控器设定为-30 °C，并向转子注入冷空气。
      注：已测试不同试验条件，以达到+4 °C的最佳温差，这是克服细胞处理器细胞分离系统的热阻以及离心过程中转子发热所必需的。程序设定的温控器将在操作过程中，特别是在离心阶段，在洁净室温度为+18 °C的条件下，维持细胞处理机内部的最佳目标温度。
      1. 设置细胞处理器的预冷却阶段：第一阶段为在无细胞处理器套件的情况下将设备冷却至+3 °C，持续30至45分钟；第二阶段为安装套件后，在+4 °C条件下以134 × g 离心5分钟。

2. 空气中颗粒物计数

  1. 根据 ISO 14644-1 标准评估冷却设备在 GMP 洁净室环境中的合规性，以评价操作阶段热源设备的影响。
  2. 使用粒子计数监测，证明在静态和动态条件下，关键控制点均达到所需的洁净度水平。
    1. 最少采样点数量取决于所测量的面积。使用以下公式计算：
      figure-protocol-1
      ​其中 A 为洁净室或受控洁净空气区域的面积，单位为 m2，NL 为采样点数量，向上取整为整数。
    2. 空气采样体积是指每个采样点的最小采样量。确保空气体积足够大，以便能够计数到最大粒径粒子的 20 个颗粒。通过以下公式计算空气采样体积：
      V = 20/C × 1000
      其中 V 为每个采样点的最小单次采样体积，单位为 L；C 为洁净度等级限值（单位：颗粒数/m3）。
    3. 根据面积大小，在每个采样点使用一个或多个样品。确保每个采样点的最小采样体积为 2 L，最小采样时间至少为 1 min。
  3. 采样前，使用吹扫过滤器对粒子计数器进行吹扫。移除过滤器，并将其与等动力采样探头一起用于采样。
  4. 将粒子计数器放置在已确定的采样位置。通过粒子计数器设备的主屏幕启动采样。
  5. 完成采样后，将粒子计数器移至下一个采样点。当所有采样点均完成采样后，查看数据并打印报告。
  6. 当该区域所有采样点的平均粒子浓度低于表 1中规定的等级限值时，可认为该房间的粒子浓度符合允许标准。

3. 梯度制备与细胞分离处理

  1. 实验前，将高密度和低密度梯度液以及细胞处理器试剂盒在 +4 °C 冰箱中预冷过夜。
  2. 将细胞处理器在静置状态下预冷 45 分钟（即使用前开启细胞处理器），保持温度在 +2 °C 至 +5 °C 之间。插入已在 +4 °C 预冷的细胞处理器试剂盒。
  3. 对于标准乙醇冷却双夹套梯度混合器（可选；图3），连接两个玻璃腔室并将其置于磁力搅拌器上。用夹子夹住两个腔室之间的管路。使用乙醇循环冷却器在 0 °C 下冷却梯度混合器。
  4. 首先，准备将高密度梯度液（HD；1.087 g/mL）通过泵以 150 mL/min 的流速注入袋底部，形成底层。先向腔室中加入 130 mL 高密度梯度液。
  5. 当高密度梯度液进入袋中后，向前方烧杯中加入 130 mL 高密度（HD）梯度液，向后方烧杯（夹闭状态）中加入 140 mL 低密度（LD；1.063 g/mL）梯度液。
  6. 松开两个腔室之间的止血夹/夹子，以 50 mL/min 的泵速生成连续梯度。
  7. 提前准备用于纯化的人类单个核细胞富集白膜层细胞，来源为多个匿名混合白膜层（来自全血废弃物），具体用量根据血库供应情况而定（每 10 个白膜层袋中加入 40 mL 至 60 mL 全血）。
    1. 单个核细胞分离
      1. 采用密度梯度离心法分离低密度人单个核细胞。请按以下步骤操作。
      2. 进行细胞准备时，计算血液体积（抗凝全血或悬浮白膜层）。用 2–4 倍体积的缓冲液通过倒置混匀稀释血液。血液稀释程度越高，单个核细胞纯度越好。
      3. 通过将磷酸盐缓冲液与抗凝剂混合配制缓冲液。根据血液体积除以 35 mL 计算所需试管数量，并在每支试管中加入 15 mL 密度为 1.073 的梯度溶液。
      4. 使用连接针头的 60 mL 注射器，将 35 mL 稀释后的血液悬液沿梯度液表面缓慢铺加在密度梯度上层；小体积时可使用移液器。注意不要破坏界面，否则将导致单个核细胞层不理想。
      5. 在 20 °C 下以 400 x g 离心 20 分钟，不得设置刹车（加速度 0，减速度 0）。离心后，用无菌移液管小心吸取界面处的单个核细胞层，并转移至另一个新的 50 mL 圆锥形离心管中。
      6. 用缓冲液（含抗凝剂的 PBS）洗涤细胞两次。第一次洗涤时，将含细胞的离心管加缓冲液至 50 mL。在 20 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟使细胞成团（加速度 9，减速度 0），然后小心彻底去除上清液。
      7. 进行第二次洗涤以去除血小板。用缓冲液将细胞沉淀重悬至 50 mL 体积，在 20 °C 下以 200–300 x g 离心 10 分钟（加速度 9，减速度 0）。
      8. 将细胞重悬至终体积为 5 mL，这些细胞的比重应接近低密度单个核细胞（<1.073）。使用密度计测量梯度液的比重。
      9. 在转移袋中，用 95 mL 高密度梯度介质（1.083 g/mL）将细胞沉淀重悬至终体积为 100 mL。将此产物用于细胞分离器纯化。最终 100 mL 体积包含细胞和 1.083 高密度梯度介质。
        注：白膜层可在含 0.5% BSA 或自体血浆的 PBS 中于冰箱内保存过夜。白膜层也可进行洗涤处理。
  8. 使用蠕动泵以 25 mL/min 的流速，将最多 30 mL 来自白膜层、悬浮于 100 mL 浓缩保存介质中的单个核细胞加样至预形成的梯度上层。保持梯度温度为 +4 °C。
  9. 使用预先校准的热探针持续测量细胞处理器内部温度。通过连接至无菌热探针的数字热电偶，在整个过程中监测梯度液和细胞的温度。

4. 梯度加载各步骤的优化

  1. 插入预先在 +4 °C 下预冷的细胞处理器套件。在 +4.5 °C 条件下加载高密度梯度液（130 mL）。梯度液加载结束后，将离心机设置为相对较低的转速（537 × g），以尽量减少转子运转产生的热量。
  2. 关闭细胞处理器，使液压系统恢复至运行前水平并释放空气。
  3. 以 537 × g 重新启动细胞处理器，并加入高密度（130 mL）和低密度（140 mL）梯度液，在 +4.3 °C 下形成连续密度梯度，流速为 50 mL/min。
  4. 在 +6 °C 和 25 mL/min 的流速下，加载含 100 mL 冷保存液的血沉棕黄层（30 mL），并加入 50 mL（25 mL × 2）洗涤液。
  5. 在 +5 °C 下持续 5 分钟后，以 100 mL/min 的流速将离心后的梯度液收集至 12 个瓶中。
  6. 用洗涤培养基（M199 + 20% 人血清白蛋白 + 10% 青霉素-链霉素）填充各管。第 1 管加入 100 mL 洗涤培养基和 150 mL 细胞，第 2–12 管每管加入 225 mL 洗涤培养基和 25 mL 细胞。

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结果

首先量化了细胞处理器冷却系统对GMP洁净室的影响。采用标准化方法，使用粒子计数器在GMP C级和B级洁净室环境中，对靠近细胞处理器及加压空气冷却系统的若干关键点处的空气悬浮微粒污染情况进行测量。结果表明，设备周围未产生任何湍流。记录数据显示，在符合GMP C级、B级以及BSL III标准的前提下，0.5 µm和5 µm空气悬浮微粒均未超标（图4）。

所有实验均采用连续多糖密度梯度进行。首先，在冷却和非冷却的细胞处理仪中，对不含细胞的梯度溶液在6次独立运行中于不同时间点进行了温度测定。在后续研究中，使用冷却的细胞处理仪通过密度梯度纯化人源细胞。

所有数据均表示为3次独立实验的平均值±标准差（SD），并使用商业分析软件进行分析。统计学显著性设定为 p<0.05。如图5所示，在冷却和非冷却细胞处理器中，前四个步骤测得的梯度温度无显著差异；记录的温度约为+4.5 °C。然而，...

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讨论

数十年来，全球的胰岛分离机构 已普遍采用经改造的细胞处理仪进行人胰岛纯化。尽管部分胰岛制备机构仍在非冷藏型细胞处理仪中进行胰岛处理，但大多数中心已转而使用带制冷功能的细胞处理仪10,11,15。这些机构要么将细胞处理仪置于冷藏室内，但此方法的主要缺点是设备易受湿度和冷凝水影响；要么对细胞处理仪本身进行重大技术改造，包括对转轴等部件的改动，而这会直接影响设备的保修状态及其预防性维护。本文介绍的新型符合GMP标准的细胞治疗兼容细胞处理仪冷却系统，可在特定低温条件下（+ <10 °C）进行细胞处理，而使用原始细胞处理仪在室温下离心时无法达到该低温环境。

空气冷却技术最初由布鲁塞尔的研究团队使用20，并在莱顿得到应用21。需要压缩医用级空气（大多数医院环境中均可提供）的新版冷却系统，已在卡塔尔...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢欧洲糖尿病基因组学研究所（ANR-10-LABEX-0046，资助给FP）以及卡塔尔代谢研究所—哈马德医疗公司，卡塔尔。作者同时感谢 哈马德医疗公司医学研究中心  文章处理费用支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
空气粒子计数器Lasair III 
AirJet XR40 SP ScientificFTS system XR40
生物安全柜Thermo ScientificEQ-1301
循环冷却水浴机JulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
锥形冷却盘BiorepCCT-01
双夹套梯度混合器 实验室自制
KJT-热电偶温度计Hanna InstrumentsHI93551N用于测量液体温度
磁力搅拌器 Thermo Scientific88880014
蠕动泵 MasterFlexMK-77921-79
温度计 Extech InstrumentsRMS 430用于测量COBE温度
无水珠浴恒温器Cole-Parmer10122-00
材料与试剂
BD干细胞计数试剂盒BD Biosciences 344563
COBE 2911管路套件Terumo BCT90819
250 ml锥形离心管Corning430776
密度梯度液 1.1Biochrom L6155
带刻度一次性塑料瓶Thermo fisher382019-1000
人血清白蛋白 20% Kedrion Biopharma 8091600
M199洗涤液 Corning 99-784-CM 
Masterflex管路Masterflex96400-6
医用干燥空气Linde HealthcareMedi On 22
青霉素-链霉素 Gibco 15140122
热探针BiorepTC-02温度传感器
台盼蓝 Sigma Aldrich15250061
威斯康星大学Belzer（UW）保存液 Bridge of Life RM/N 4055保存液

参考文献

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