评估新型冷却单元处理器系统对胰岛细胞分离设施的影响

Summary

此处的协议描述了一种定制的冷却单元处理器系统，该系统与良好生产规范 （GMP） 洁净室兼容，以提高细胞活力后处理。

Abstract

标准细胞治疗设备，包括用于纯化人胰岛用于临床移植的金标准细胞处理器，很少冷藏，在离心步骤中可能会使细胞暴露在高温下。定制冷却系统对人体胰岛的活力和功能有直接的好处。本研究旨在测试新开发的、现成的冷却细胞处理器系统的有效性，该系统需要最少的修改，并评估其对人体细胞活力和 GMP 洁净室环境的影响。冷却器系统是一种设置为 -30 °C 的机械冷冻热交换器，用于通过离心机盖上钻的孔将冷却的医用级干燥空气输送到细胞处理器碗中。由于卡塔尔胰腺供体的可用性有限，因此通过对混合人骨髓血沉棕黄层进行连续密度梯度纯化进行系统验证。在 C 级和 B 级洁净室环境中测量无菌性、湍流和颗粒计数。冷却的单元处理器周围没有产生湍流，也没有根据洁净室 GMP 标准产生过量的 0.5 μm 和 5 μm 空气传播颗粒。在收集步骤的开始和结束时，非冷却细胞处理器的温度分别上升到21.50 °C±0.34 °C和21.93 °C ± 0.20 °C，而在冷却细胞处理器中，温度分别上升到10.9 °C±0.17 °C和11.16 °C±0.35 °C（p <0.05）。冷却的细胞处理器提高了单核细胞组分的回收率 （98%） 和后处理的活力 （100% ± 2%）。新的冷却系统有效减少了细胞处理器产生的热量，同时对 GMP 洁净室环境没有颗粒影响。这里描述的冷却单元处理器是一种廉价（16,000 美元，不包括税费、清关和运输）的微创方法，可提供强大的冷却。目前，GMP 细胞治疗设施中的这项技术正在应用于临床项目的人胰岛细胞分离和移植。

Introduction

严重 1 型糖尿病的胰岛移植可以恢复内源性胰岛素分泌，并已成为许多国家的护理标准¹。胰岛分离是一个多步骤程序，包括胰腺的温酶和机械消化，然后是冷却阶段以回收消化的组织，并在细胞处理器上以连续或不连续的密度梯度纯化胰岛。快速冷却可减慢酶消化阶段，并保护胰岛免受污染腺泡细胞释放的消化酶的影响。细胞处理器最初设计用于在环境温度下分离细胞血液成分²。它在 1989 年被重新用于纯化朗格汉斯的人类胰岛³。三十年来，人胰岛已被纯化用于临床试验，最近，无论是在具有不连续梯度的细胞处理器中⁴，还是在连续密度梯度处理器中¹ 使用梯度生成器¹ 或等效的计算机作混合器^5，6，7.其他小组报道了使用大型圆柱形塑料瓶从大型哺乳动物和人类中纯化胰岛^8，7，9，这大大提高了净化效率和胰岛质量。

事实上，考虑到用于临床移植的纯化人胰岛的黄金标准^10，11，制造的细胞处理器没有冷藏。由于缺乏冷藏，胰岛在纯化步骤中暴露在升高的温度下。在离心过程中，由于转子的机械摩擦^{12，13 会不受控制地升高}温度。细胞处理器在胰岛分离中心配备了冷却系统，该系统在统计学上增加了葡萄糖诱导的胰岛素分泌和细胞活力，证实了在纯化过程中将胰岛保持在低温下的优势^14，15。

应该注意的是，在 1980 年代后期，建造了 10 个制冷原型以减少密度梯度纯化过程中对胰岛的损伤，但没有得到进一步的关注。细胞处理器原型基于使用冷却聚乙二醇的转子和碗冷却。特别是，当在室温或室温以上使用时，胰岛纯化溶液（包括器官保存溶液和多糖密度梯度）可能对胰岛活力有害^16，17，18。评估了用于胰岛细胞纯化的细胞处理器与原始非制冷细胞处理器的不同冷却策略的比较，以对抗由于转子摩擦而发生的不受控制的温度升高。在人胰岛纯化过程中，已经进行了几次尝试来冷却细胞处理器。细胞处理器可以临时或永久地安装在专门设计的冷藏室中，以在梯度离心过程中保持 0-8 °C 的温度¹⁹，目前在伊利诺伊大学芝加哥分校的胰岛分离中心使用¹⁹，迈阿密大学¹⁴，牛津大学设施¹⁵和旧金山大学（定制的冷却装置包裹着单元处理器）。另一项修改包括在日内瓦、瑞典和捷克共和国使用电子控制液氮冷却的冷却系统对电池处理器主轴进行核心冷却^15，19。2000 年中期的另一种选择是使用空调单元^{12 对单元处理器进行核心冷却}，或者在里尔大学通过轴的液体冷却。

单元处理器的冷却改造并不容易获得，并且在 GMP 洁净室环境中存在风险（湿度、冷凝水积聚），包括失去保修和建造商拒绝维修机器。因此，一些胰岛中心，包括意大利米兰、挪威奥斯陆和苏格兰爱丁堡，在胰岛净化过程中不使用细胞处理器的冷却系统¹⁵。

目前的研究旨在测试新开发的现成冷却器与最小修改的细胞处理器系统相结合的有效性。简而言之，这里描述的空气冷却器是一种机械冷冻热交换器，可将干燥气体的温度控制在 -40 °C 至 -100 °C 之间，每分钟 1 标准立方英尺 （SCFM）。这种冷却系统需要干燥的医用空气供应。空气将流经管路和热交换器，并通过 （7.9 mm） 喷嘴流出。位于喷嘴内的加热器提供热量以控制气流的温度。购买了一个备用的实心塑料离心机盖，并进行了最少的修改。在盖子上钻一个直径为 13.3 mm 的孔，冷却空气通过离心机盖上的孔从冷却器喷嘴输送到细胞处理器。将冷却的医用空气注入细胞处理器的离心转鼓内，并持续控制液体的温度或密度梯度。

我们评估了冷却单元处理器的技术性能以及冷却元件对 GMP 洁净室环境的影响。主要重点是在人胰岛纯化过程中实现稳定的低温 （<10 °C） 以保持活力。使用血沉棕黄层密度分离作为胰岛分离的代理，我们确定了这种冷却方案对细胞活力的功效。

Protocol

该方案使用了不适合根据机构丢弃指南使用的丢弃全血。IRB 批准和知情同意不适用。

1. 冷却单元处理器设置

注意：所有程序必须在洁净室环境中进行，工作人员必须遵守洁净室服装程序。

1. 设备采购
   1. 购买备用有机玻璃盖。购买冷却设备系统、带机械冷冻气流温度控制器的冷却器、空气干燥器、压力和流量调节器以及保修（可选）。参考资料见材料表.
      注意：总费用为 16,133 美元，不含运费或海关费用。
   2. 从当地医用气体供应商处订购医用干燥空气，这是一种符合标准等级（欧洲药典参考 1238）的压缩医用气体。购买 2 个 6.8 m³ 的圆筒（47 L：23 cm x 153 cm;直径 x 长度）。
2. 设备设置（图 1 和 图 2）
   1. 在 GMP 洁净室中进入设备（根据 GMP 程序在进入洁净室前进行消毒。
   2. 对于医用级压缩空气，请安装气体管线，而不是将气瓶直接放置在洁净室中。
3. 改造电池处理器以进行冷却
   1. 首先，取下有机玻璃盖。保留原来的有机玻璃盖，以防保修出现问题。在细胞处理器的备用盖子上钻一个直径匹配的孔，并适合冷却装置喷嘴尖端的外径，以防止离心机盖破裂（推荐 13.3 mm）。
   2. 将托槽与一块圆形泡沫固定在一起。这样做是为了防止盖子破损和/或划伤，将冷却器喷嘴固定在细胞处理器上方，保护盖子因注入空气的高压而过度弯曲，支撑喷嘴的重量，最后确保作员在实验过程中可以自由安全地访问所有必需的细胞处理器功能。
   3. 通过将冷却喷嘴连接到有机玻璃上的孔，将冷却系统连接到单元处理器。用支架和泡沫垫固定它。
   4. 将冷藏箱放置在距离喷嘴最远 8 英尺 （2.44 m） 的地方。将温度控制器放在单独的机柜中，并将其放置在距离冷藏箱 6 英尺 （1.83 m） 的范围内。
   5. 将冷却器设定点设置为 -40 °C，以冷却冷却器上的气流。排气温度在数字指示器上连续显示，分辨率为 0.1 °C。使用温度控制器将出口温度以数字方式设置为 0.1 °C。
   6. 在送入冷却器之前，控制压力和流量调节器模块（图 2）上的空气供应压力和流量。将它们分别设置为 55 psi 和 4 SCFM 流速，以在 -30 °C ± 2 °C 冷却的气流上达到最佳条件。
   7. 验证医用气体供应是否在 5 bar 的出口压力下进行调节，并且可以持续至少 90 分钟，因为这是压缩空气达到 -30 °C 所必需的><。 注意：医用干燥空气是压缩的医用气体，完全加压的干燥空气符合标准等级。
   8. 从连接到细胞处理器盖的冷却器喷嘴通过离心机盖上的钻孔输送 5 bar。将冷却的医用空气注入细胞处理器的离心碗内（图 2）。选择空气喷射的位置，使冷却空气垂直于离心机转子的铝制边缘。
   9. 准备细胞处理器时，确保转子处于室温 （18 °C）。将冷却系统的自动温度调节器设置为 -30 °C，并将冷空气喷射到转子上。
      注：测试了不同的试验条件以达到 +4 °C 的最佳温度梯度，这对于克服细胞处理器细胞分离器系统的热阻和离心过程中转子的加热是必要的。编程的热调节器将在 +18 °C 的洁净室温度下，特别是在离心过程中保持细胞处理机内的最佳目标温度。
      1. 使用第一个预冷阶段设置细胞处理器，以将处理器（不含细胞处理器套件）在 +3 °C 下冷却 30 至 45 分钟，运行细胞处理器的第二个预冷阶段应在 +4 °C 下以 134 x g 的速度预冷套件 5 分钟。

2. 空气中的颗粒物计数

1. 根据 ISO 14644-1 标准评估冷却设备与 GMP 洁净室环境的合规性，以评估加热设备在运行阶段的影响。
2. 使用颗粒计数监测提供证据，证明在静止和运行的关键控制点达到所需的清洁度水平。
   1. 采样位置的最小数量取决于测量的区域。使用方程式计算
      
      其中 A 是洁净室或洁净空气受控空间的面积，单位为 m^2，NL 是四舍五入为整数的样品位置数。
   2. 机载采样量是每个位置的最小体积。确保空气体积足够大，可以计数 20 个指定最大粒径的颗粒。通过方程计算空气传播的采样量
      V= 20/C x 1000
      其中 V 是每个位置的最小单个样品体积，以 L 表示，C 是类限值（颗粒数/m³）。
   3. 对于每个位置，根据区域，使用一个或多个样本。确保每个位置的最小采样体积为 2 L，最小采样时间至少为 1 分钟。
3. 采样前，用吹扫过滤器吹扫粒子计数器装置。取下过滤器并将其与等速探针一起放置以进行采样。
4. 将粒子计数仪放在确定的采样位置。从粒子计数器设备的主屏幕启动样品采集。
5. 采样结束后，将粒子计数器设备带到下一个位置。完成所有采样位置后，查看数据并打印报告。
6. 当该区域内所有采样点的平均颗粒浓度低于表 1 中规定的类别限值时，请考虑通过的房间以获得允许的颗粒浓度。

3. 梯度制备和细胞分离处理

1. 实验前，将轻密度和重密度梯度以及细胞处理器试剂盒在冰箱中于 +4 °C 预冷过夜。
2. 静息时将细胞处理器预冷 45 分钟（即，使用前打开细胞处理器）。将温度保持在 +2 °C 和 +5 °C 之间。插入预冷至 +4 °C 的细胞处理试剂盒。
3. 对于标准乙醇冷却双夹套梯度发生器（可选;图 3）连接 2 个玻璃室并将它们放在磁力搅拌器上。夹住 2 个腔室之间的管路。用乙醇循环冷却冷却器在 0 °C 下冷却梯度制备器。
4. 首先，准备在袋底部加载重层，方法是用 130 mL 的重密度梯度 （HD;1.087 克/毫升）。以 150 mL/min 的泵速加载。
一旦
5. 大梯度进入袋子中，向前烧杯添加 130 mL 高密度 （HD），向后烧杯添加 140 mL 低密度 （LD;1.063 g/mL） 梯度（夹具关闭）。
6. 松开 2 个腔室之间的止血钳/夹具，并以 50 mL/min 的泵速产生连续梯度。
7. 根据血库的可用性，提前准备人单核血沉棕黄层细胞，以便从全血废物产品中收集的多个混合匿名血沉棕黄层中纯化（将 40 mL 至 60 mL 全血添加到 10 个血沉棕黄层袋中）。
   1. MNC 分离
      1. 使用密度梯度离心法进行低密度人单核细胞分离。为此，请按照下面描述的步骤作。
      2. 对于细胞制备，计算血液体积（抗凝全血或悬浮的血沉棕黄层）。通过混合倒置，用 2x-4x 缓冲溶液稀释血液。血液稀释得越多，单核细胞的纯度就越好。
      3. 通过将磷酸盐缓冲液与抗凝剂混合来制备缓冲液。通过将血液体积除以 35 mL 来计算所需的试管数，并在每根试管中倒入 15 mL 的 1.073 密度梯度溶液。
      4. 使用连接到针头的 60 mL 注射器在密度梯度表面轻轻运行，逐渐将 35 mL 稀释的血液悬浮液分层到密度梯度上;对于小体积，请使用移液器。尽量不要破坏界面，因为这会导致单核层变差。
      5. 在 20 °C 下以 400 x g 离心 20 分钟，无任何中断（加速 0，减速 0）。离心后，使用无菌移液管轻轻收获单核细胞的界面层。将细胞转移到另一个新的 50 mL 锥形管中。
      6. 用缓冲液（添加抗凝剂的 PBS）洗涤细胞 2 次。第一次洗涤时，用缓冲液填充含有细胞的试管，直至 50 mL。在 20 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟以沉淀细胞（加速 9，减速 0）。轻轻小心地去除所有上清液。
      7. 进行第二次洗涤以去除血小板。用缓冲液将沉淀重悬至 50 mL 的体积。在 20 °C 下以 200-300 x g 离心 10 分钟（加速度 9，减速 0）。
      8. 将细胞重构至最终体积为 5 mL，这些细胞应具有类似于低密度 MNC <1.073 的比重。用密度计测量梯度的比密度。
      9. 在转移袋中加入 95 mL 高密度梯度培养基 （1.083 g/mL），将沉淀重悬至最终体积为 100 mL。使用本产品通过细胞分离器进行纯化。最终体积为 100 mL，包含细胞和 1.083 高密度梯度培养基><。 注：血沉棕黄层可以在冰箱中储存在含有 0.5% BSA 或自体血浆的 PBS 中过夜。血沉棕黄层也可以清洗。
8. 使用蠕动泵以 25 mL/min 的速度将最多 30 mL 的 MNC 从悬浮在 100 mL 浓缩保护培养基中的血沉棕黄层中分离出来，对预制梯度进行顶部加载。将梯度保持在 +4 °C。
9. 使用预先校准的热探针连续测量细胞处理器内部的温度。使用连接到无菌热探针的数字热电偶，在此过程中监测梯度和样品池的温度。

4. 梯度加载不同步骤的优化

1. 插入在 +4 °C 下预冷的细胞处理试剂盒。在 + 4.5 °C 下加载重梯度 （130 mL）。在梯度加载结束时，将离心机设置为相对较低的速度 （537 x g），以最大限度地减少转子产生的热量。
2. 关闭单元处理器，让液压系统恢复到运行前水平并释放空气。
3. 以 537 x g 的速率重新启动细胞处理器，并添加重密度 （130 mL） 和低密度梯度 （140 mL），以在 +4.3 °C 和 50 mL/min 的流速下产生连续的密度梯度。
在
4. +6 °C 和流速为 25 mL/min 的温度下，用 100 mL 的冷藏介质加载血沉棕黄层 （30 mL），加入 50 mL （25 mL x 2） 洗涤液。
5. 在 +5 °C 下 5 分钟后，以 100 mL/min 的流速收集 12 个瓶子中的离心梯度。
6. 用洗涤培养基（M199 + 20% 人白蛋白 + 10% 青霉素链霉素）填充试管。用 100 mL 洗涤培养基和 150 mL 细胞填充试管 1，用 225 mL 洗涤培养基和 25 mL 细胞填充试管 2-12。

Results

首先量化了冷却单元处理器对 GMP 洁净室的影响。标准化方法使用粒子计数器测量 GMP 级 C 级和 B 级洁净室环境中靠近细胞处理器和加压空气冷却器系统的关键点的空气传播颗粒污染。结果表明，设备周围没有产生湍流。记录数据显示，根据洁净室 GMP C 级、B 级和 BSL III 标准（图 4），空气中的颗粒物没有过量

。

所有实验均采用连续多糖密度梯度进行。首先，在冷却和非冷却池处理器中，在 6 次运行中测试无池在不同时间点的梯度溶液温度测量值。在随后的研究中，使用冷却的细胞处理器在密度梯度上纯化人类细胞。

所有数据均以标准差 （SD） 表示为 3 项独立试验±平均值，并使用商业分析软件进行分析。统计显着性设置为 p<0.05。如图 5 所示在前四个步骤中，在冷却和非冷却电池处理器中测得的梯度温度没有显着差异;记录的温度约为 +4.5 °C。然而，在 5 分钟离心期后和...

Discussion

几十年来，世界各地的胰岛分离设施一直在重新利用的细胞处理器中采用人胰岛纯化。尽管一些胰岛生产设施继续在未冷藏的细胞处理器中处理胰岛，但大多数中心使用细胞处理器^10、11、15 的冷藏版本。中心要么将电池处理器放置在冷藏室中，该冷藏室的主要缺点是暴露在潮湿和冷凝水中，要么在技术上对电池处理器本身（包括轴）进行重大修改，这会直接影响机器的保修及其预防性维护。所提出的新型GMP细胞治疗兼容细胞处理器冷却系统有利于在规定的低温（+ <10°C）下进行细胞处理，这在室温下使用原始细胞处理器细胞分离器离心时无法实现。

该空气冷却技术首先由该集团在布鲁塞尔²⁰ 使用，并在莱顿²¹ 实施。大多数医院环境中都提供需要压缩医用级空气的新版本冷却系统，在多哈-卡塔尔的 GMP 洁净室环境中对细胞处理器进行了冷却测试。事实上，...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备
空气颗粒计数器	Lasair III
AirJet XR40	SP Scientific	FTS 系统 XR40
生物安全柜	Thermo Scientific	EQ-1301
循环冷却冷却器	Julabo	CF30
COBE 2991	Terumo BCT
锥形冷却托盘	Biorep	CCT-01
双夹套渐变机	内部
KJT-热电偶温度计	Hanna Instruments	HI93551N	用于测量液体温度
磁力搅拌器	Thermo Scientific	88880014
蠕动泵	MasterFlex	MK-77921-79
温度计	Extech Instruments	RMS 430	适用于COBE温度
无水珠浴	Cole-Parmer	10122-00
材料和试剂
BD干细胞计数试剂盒	Biosciences
COBE 2911 管路套件	Terumo BCT	90819
锥形管 250ml	康宁	430776
梯度密度 1.1	Biochrom	L6155
一次性刻度瓶	Thermo Fisher	382019-1000
人白蛋白 20%	Kedrion Biopharma	8091600
M199 洗涤液	康宁	99-784-CM
Masterflex 试管	Masterflex	96400-6
医用干燥空气	Linde Healthcare	Medi On 22
Pencillin-链霉素	Gibco 公司
Thermoprobe	Biorep	TC-02	温度传感器
台盼蓝	Sigma Aldrich	15250061
威斯康星大学贝尔泽分校 （UW）	生命之桥	RM/N 4055	保存培养基