在多重血清学检测中同时检测不同抗体类别

莱姆疏螺旋体病是北半球温和气候中最常见的蜱传传染病¹.它是由疏螺旋体属的螺旋体细菌引起的，有五种已知的人类病原体，地理分布各不相同².欧洲的主要致病性疏螺旋体是阿氏疏螺旋体和加里尼疏螺旋体，伯氏疏螺旋体、斯皮尔曼疏螺旋体和巴伐利亚疏螺旋体的发病率较低。在北美，伯氏疏螺旋体是莱姆疏螺旋体病的唯一病原体 ^2,3。疏螺旋体病原体由蜱属硬蜱传播，传播可在蜱叮咬后 24 小时内发生⁴.

莱姆疏螺旋体病的诊断通常根据临床症状进行，随后通过血清学检查确诊。在欧洲和北美，诊断指南建议进行两步检测，包括酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和反射性免疫印迹，以评估针对疏螺旋体特异性抗原 1,5,6,7,8,9 的抗体反应.然而，这种方法缺乏敏感性且效果不佳，尤其是在感染早期，此时血清转化可能不完全，抗疏螺旋体 IgG 和 IgM 滴度过低⁶。

多重免疫测定改进了一次仅测量一个靶标的传统免疫测定，并且可以同时评估针对一种或多种抗原的多种抗体同种型反应 10,11,12。ELISA等检测仅限于鉴定和定量每次反应的单个分析物，在当前情况下，在感染疏螺旋体后，循环IgG或IgM诱导针对单个细菌抗原。本报告说明了使用基于微珠的分析物分析技术开发一种多重免疫测定法，该测定法可同时检测针对人血清样本中任何本文选择的疏螺旋体抗原的 IgG 和 IgM 抗体。我们选择了四种抗原，它们共同覆盖了欧洲本土最常见的致病性疏螺旋体物种（B.garinii， B. afzelii， B. burgdorferi s.s.）和北美 （B. burgdorferi s.s.）（表1）^2,3.这样可以决定性地识别病原体，并能够辨别患者样本中的早期 IgM 和后来更持久的 IgG 免疫反应性。

表 1:用于多重检测开发的代表性 疏螺旋体 抗原。

我们最初开发了一种单报告基因免疫测定法，可在两个单独的反应中检测抗疏螺旋体 抗原IgG或IgM抗体，然后将这些检测合并为双报告基因多重检测法，该检测法可测量同一反应混合物中的两种抗体同种型。将磁珠偶联到感兴趣的病原体靶抗原上，然后与患者血清样本一起孵育。微珠偶联抗原被血清中循环的 IgG 和 IgM 识别并捕获，这些 IgG 和 IgM 是在针对该病原体抗原的免疫反应中产生的。测定 IgG 与 IgM 特异性是通过选择与 IgG 或 IgM 结合的二抗来确定的，每种抗体都具有与两种二抗相关的不同荧光团信号。每个荧光信号在仪器的两个报告基因通道（即双报告基因）之一中被检测，该基因通道具有不同的激发激光和发射捕获，特定于用于检测 IgG 或 IgM（此处分别为 Brilliant Violet 421 或藻红蛋白）的单个荧光基团。仪器分类通道可识别不同微珠组固有的颜色编码染料。因此，多种靶抗原可以偶联到不同染色的微珠上，并将微珠组混合在一起，用于全面评估血清样品中不同的抗病原体免疫反应性。分类通道可识别每个单独的微珠组（即特异性抗原），并测量与该抗原相关的 IgG 或 IgM 荧光。与不太全面的传统检测相比，由此产生的多重检测节省了时间和资源，并在有限的样本量中准确分类了莱姆病免疫反应性。虽然以前曾使用类似的双报告方法对其他病理学（如 SARS-CoV-2 感染）中的免疫反应进行分类¹³，但本报告详细介绍了多重荧光测定技术在莱姆疏螺旋体病中表征免疫反应性的应用。

在该实验系列中使用人类血清样本已获得适当的机构审查委员会/伦理委员会批准。样本是来自德国 SARS-CoV-2 血清阳性率¹⁴ 国家研究的匿名残留材料。德国汉诺威医学院伦理委员会（9086_BO_S_2020）批准了使用人类样本。本研究共使用了 21 份人类血清样本。

1. 使用人体样本的伦理批准

1. 获得使用人体样本的适当伦理批准。

2.试剂和设备

1. 人血清样本:使用先前诊断为莱姆疏螺旋体病或已证实为疏螺旋体阴性免疫状态的人的血清样本进行技术测定验证和质量控制^12,14。
2. 单报告器检测。使用双通道单报告仪器（材料表）进行初始检测开发和技术验证。
   注:单报告系统有两个激光器:1） 识别和量化微珠组特异性荧光以区分不同的微珠组（如果使用）（分类通道），以及 2） 检测和定量微珠结合的靶标特异性藻红蛋白 （PE） 荧光（报告通道;532 nm 激发，"橙色"565-585 nm 发射）。因此，使用单个报告通道一次只能分析单个抗体同种型类别（例如，IgG 或 IgM）。
   1. 进行初步验证研究，分别评估抗疏螺旋体 IgG 和 IgM，采用单报告基因 96 孔形式，对两种抗体类别均使用 PE 标记的检测试剂。
      注:目前的检测评估了对 疏螺旋体 抗原 VlsE 和两种 DbpA 变体具有特异性的循环 IgG，以及对抗原 OspC 具有特异性的循环 IgM，作为代表性示例。该测定可以扩展以评估针对其他抗疏螺旋体 抗原的血清免疫反应性，如所需¹²。
3. 双报告器仪器。使用允许在同一反应中同时进行 IgG/IgM 分析的三通道双报告基因仪器（材料表），用于开发和技术验证双 IgM/IgG 检测（详见下文）。该仪器共有 3 个荧光检测通道，其中 2 个是评估靶向 Ig 相关信号的报告通道。
   注:双报告系统有三个激光器:1）识别和量化珠组特异性荧光（分类通道）;2） 检测和定量靶标特异性藻红蛋白 （PE） 荧光（报告通道 1;532 nm 激发，"橙色"565-585 nm 发射），以及 3） 评估第二个靶标分析物的靶标特异性亮紫 421 （BV421） 荧光（报告通道 2;405 nm 激发，"蓝色"421-441 nm 发射）。双报告基因系统兼容 96 孔和 384 孔微量滴定板（半自动处理）检测形式。一般测定方案如 图1所示。协议步骤详述如下。

3. 抗原偶联

1. 将 疏螺旋体 抗原偶联到磁性、羧化和荧光颜色编码的 6.5μm 微球（珠子; 材料表）使用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 （EDC）/磺基-N-羟基琥珀酰亚胺 （sNHS） 化学。
   注:详细说明可在参考文献¹¹和参考文献¹² 中找到。在表1中找到每种抗原的偶联浓度。偶联珠应在4°C下避光储存直至使用。偶联和检测反应中使用的所有缓冲液均详见 补充材料。

4.检测程序:单报告基因IgG或IgM血清学检测:96孔形式

1. 分 2 步稀释样品（2 步，均在 96 孔板中;在测定缓冲液中稀释 200 倍血清样品）。
   注:测定缓冲液组合物是含有 1% （w/v） 牛血清白蛋白的低交叉缓冲液:PBS 的 1:4 混合物。将吐温-20加入到混合物中，至终浓度为0.05%（v / v）。
   1. 样品稀释步骤 1:将 5 μL 血清样品与 120 μL 测定缓冲液（25 倍稀释）混合。
   2. 样品稀释步骤 2:通过将 10 μL 稀释液与 70 μL 测定缓冲液混合，将 25 倍的样品稀释液再稀释 8 倍，使最终样品稀释 200 倍。
2. 磁珠混合物稀释
   1. 制备每个微珠群（即每个唯一靶抗原）含有 1.0 ×^{10 个 6} 个微珠/mL 的微珠混合物。
   2. 在测定缓冲液中将制备的微珠混合物稀释 25 倍，使该稀释悬浮液中的最终微珠浓度现在为每个微珠群 4 ×^{10 个 4} 个微珠/mL（即每个独特的靶抗原）。
3. 血清样品与珠子孵育
   1. 将 25 μL 稀释的偶联多重微珠悬浮液（含 4.0 ×^{10 个 4} 个微珠/组/mL）移液到 96 孔半面积微量滴定板（材料表）的指定孔中。
   2. 将 25 μL 200 倍稀释的血清样品（来自上述步骤 4.1）加入含有 25 μL 偶联微珠悬浮液的适当孔中。
      注意:这会产生额外的 2 倍稀释，因此孔中的最终血清样品稀释度为 400 倍，最终微珠计数为 1000 个微珠/微珠组/50 μL 反应。
   3. 用微孔板密封件（粘合剂箔或塑料板盖）覆盖96孔反应板。
   4. 在板振荡器上以750rpm在20°C下孵育板2小时。
4. 珠子清洗
   1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。
   2. 将 96 孔反应板放入洗板机中。
   3. 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液 （1× PBS + 0.05% v/v Tween 20） 洗涤珠子 3 次。
5. 将洗涤过的珠子重悬于100μL洗涤缓冲液中，用粘性箔或塑料板盖覆盖板，并在20°C下以1000rpm在板振荡器上摇动板1分钟。
6. 劈开洗过的珠子
   1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。
   2. 通过上下移液五次混合反应，并将每个 100 μL 反应体积的 50 μL 转移到两个新的 96 孔反应板中，一个用于 IgG 检测，一个用于 IgM 检测。
7. 检测抗体/试剂孵育
   注意:此时，靶抗原偶联微珠已与血清样品一起孵育，以提取血清（如果存在）中与抗原反应的循环抗体。与结合的免疫球蛋白的反应微球已被分成两个板，现在使用带有 PE 标记的同种型特异性二抗在其单独的板中检测和定量 IgG 和 IgM。错开板处理 20 分钟。
   1. 使用磁性板垫圈从含有磁珠的孔中吸出上清液。
   2. 对于每个板，在测定缓冲液中制备适当的 Ig 检测试剂混合物（抗 IgG 或抗 IgM），其中含有 PE 偶联的山羊抗人 IgG （3 μg/mL） 或 PE 偶联的驴抗人 IgM （5 μg/mL）。对于每个含微珠的孔，使用 30 μL 检测试剂。为反应孔准备足够的 IgG 和 IgM 检测试剂体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。
   3. 将 30 μL IgG 检测试剂移液到 IgG 板上含有反应珠的每个孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。
   4. 将 30 μL IgM 检测试剂移液到每个孔中，其中包含 IgM 板上的反应珠，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。
   5. 在20°C下孵育45分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。
8. 珠子清洗
   1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。
   2. 将 96 孔反应板放入磁性洗板器中。
   3. 使用磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。
9. 将珠子重悬于 100 μL 洗涤缓冲液中。
10. 在单个报告基因仪器上分析结果。
    1. 用微孔板密封盖住96孔反应板。
    2. 在板振荡器上以1000rpm在20°C下摇动96孔反应板3分钟。
    3. 将 96 孔反应板从板振荡器中转移出来，并放入单报告器流量分析仪（材料表）。
    4. 对于每个样品，使用以下仪器设置分析中值荧光强度 （MFI）:摄取体积 = 80 μL，计数 = 50/微珠群，超时 = 60 秒，门控 = 7,500-15,000）^12,13。

5. 检测程序:双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测:96 孔形式

1. 样品稀释（2 个步骤，均在 96 孔板中;在测定缓冲液中稀释 200 倍血清样品）
   1. 样品稀释步骤 1:将 5 μL 血清样品与 120 μL 测定缓冲液混合（稀释 25 倍）。
   2. 样品稀释步骤 2:通过将 10 μL 第一次稀释液（第 5.1.1 节中的 25 倍稀释样品）与 70 μL 测定缓冲液（8 倍稀释）混合，将 25 倍样品稀释液再稀释 8 倍，以获得最终样品稀释至 200 倍。
2. 磁珠混合物稀释
   1. 制备每个微珠群（即每个唯一靶抗原）含有 1.0 ×^{10 6} 个靶抗原偶联微珠/mL 的微珠混合物。
      注:在本实验系列中，我们评估了每次反应中对四种独特 疏螺旋体 抗原的 IgG 和 IgM 免疫反应性。
   2. 将制备的微珠混合物在测定缓冲液中稀释 50 倍。该稀释悬浮液中的微珠浓度现在为每微珠群 2.0 ×^{10 4} 个微珠/mL。
      注:在初步研究证实荧光信号保持在使用一半数量的微珠后，双链检测反应中的微珠数量比单报告基因反应中使用的微珠数量减半，以允许两种测定之间的直接可比性并节省资源。
3. 血清样品与珠子孵育
   1. 将 25 μL 稀释的靶抗原偶联微珠悬浮液（含 2.0 ×^{10 个 4} 个微珠/组/mL）移液到 96 孔半面积微量滴定板的预分配孔中。反应孔的确切数量及其在板上的位置取决于操作员确定的测试样品总数以及每个样品是运行单孔还是重复孔。
      注意:靶抗原偶联磁珠将与人血清样本反应。如果样本中存在抗疏螺旋体 抗原免疫反应性 IgG 和 IgM，它们都会结合并固定在相同的抗原偶联微珠上。然后，将在相同的反应中对相同的磁珠进行结合的 IgG 和 IgM 的二抗定量，使用不同的荧光团进行 IgG 和 IgM 鉴定，从而允许它们进行区分。
   2. 向每个含有 25 μL 混合靶标抗原偶联微珠悬浮液（步骤 5.2）的孔中加入 25 μL 200 倍稀释的血清（来自上述步骤 5.1）。
      注意:这会产生额外的 2 倍稀释，因此孔中的最终血清样品稀释度为 400 倍，最终微珠计数为 500 个微珠/微珠组/50 μL 反应。
   3. 用微孔板密封件（粘合箔或塑料板盖）覆盖96孔反应板。
   4. 在20°C，750rpm的板振荡器上用珠子孵育板2小时。
4. 珠子清洗（去除多余的血清样本）
   1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板并取下粘合板密封件。
   2. 将 96 孔反应板放入磁性洗板器中。
   3. 使用磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。
5. 在最后一个洗涤步骤后，从珠子中吸出最终洗涤体积。
6. 检测抗体（孵育 - 第一部分）
   1. 在测定缓冲液中制备含有生物素化山羊抗人 IgG （1 μg/mL） 和 PE 偶联驴抗人 IgM （5 μg/mL） 的新鲜 IgG 和 IgM 双重检测试剂。对于每个含微珠的孔，使用 30 μL 双检测试剂。为反应孔准备足够的 IgG 和 IgM 双检测试剂体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。
   2. 将 30 μL IgG 和 IgM 双重检测试剂移液到每个指定的孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。
   3. 将板在20°C孵育45分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。
7. 微珠清洗（去除多余的检测抗体）
   1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。
   2. 将 96 孔反应板放入自动磁性洗板机中。
   3. 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。
8. 在最后一个洗涤步骤后，从珠子中吸出最终洗涤体积。
9. 链霉亲和素偶联报告基因（孵育 - 第 II 部分）
   1. 在测定缓冲液中将新鲜的 BV421 标记的链霉亲和素稀释至 0.2 μg/mL 的浓度。对于每个含珠子的孔，使用 30 μL BV421 标记的链霉亲和素。为反应孔准备足够的 BV421 标记的链霉亲和素体积，并有足够的额外体积来适应移液损失。
   2. 将 30 μL 稀释的 BV421-链霉亲和素移液到每个反应孔中，并用微孔板密封盖住 96 孔反应板。
   3. 将板在20°C孵育30分钟，同时在板振荡器上以750rpm振荡。
10. 清洗珠子（去除多余的BV421-链霉亲和素）
    1. 从板振荡器上取下 96 孔反应板，小心地取下粘合板密封件。
    2. 将 96 孔反应板放入磁性洗板机中。
    3. 使用自动磁性洗板机用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。
11. 在洗涤缓冲液中将微珠重悬于孔内至最终体积为 100 μL。
12. 在双报告器仪器上分析结果
    1. 用微孔板密封盖住96孔反应板。
    2. 将96孔反应板在20°C，1000rpm的板振荡器上孵育3分钟。
    3. 将 96 孔反应板从板振荡器转移到双报告器流量分析仪（材料表）。
    4. 根据制造商说明评估样品中位荧光强度 （MFI）（仪器设置:双报告模式，摄取体积 = 80 μL，计数 = 50/珠群，超时 = 60 秒，门控 = 7,500-15,000）。

6. 双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测:384 孔半自动形式

1. 使用第 5 节中详述的测定步骤以 384 孔板形式进行双报告基因测定，但使用移液机器人和自动磁性洗板器（材料表）处理样品。在384孔形式中，在1450rpm的孵育和洗涤期间摇动板，在测量荧光之前，在21°C和1800rpm下摇动板5分钟。

实验概述
基于单报告基因和双报告基因微球的疏螺旋体检测的一般方案如图1所示。对于针对给定疏螺旋体抗原产生的单抗体靶标（即 IgG 或 IgM），使用 PE 偶联的抗同种型抗体在人血清样本中独立评估两种抗体类别以进行报告。对于同时分析 IgG 和 IgM 免疫反应性的双报告基因检测，疏螺旋体抗原特异性 IgG 检测使用生物素化的抗人 IgG + BV421 标记的链霉亲和素（蓝色荧光）报告系统，同时保留 PE 偶联的报告基因（橙色荧光）进行 IgM 检测。双报告基因检测的工作流程与单报告基因检测相似，但使用第二通道荧光检测试剂BV421-链霉亲和素进行额外的30分钟检测系统孵育。

图 1:基于单报告基因和双报告基因微球的 疏螺旋 体检测示意图。 （A） 单报告基因仪器用于开发和初步验证基于微珠的检测方法，该检测方法分别表征抗疏螺旋体 IgG 或 IgM，两者都使用在"橙色"光谱中发射信号的藻红蛋白 （PE） 荧光报告基因标记。任何所需的 疏螺旋体 抗原都可以偶联到微珠上，并用于捕获和定量血清样品中存在的 IgG 或 IgM。需要两种独立的免疫测定来评估 IgG 和 IgM 对给定抗原的反应性。（B） 双报告系统允许在同一孔中同时分析血清样本中针对任何单个 疏螺旋体 抗原的 IgG 和 IgM 抗体。该方法使用相同的 PE 偶联检测抗体来靶向抗疏螺旋体 IgM，但取代了基于 PE 的系统的 IgG 检测，改为使用生物素化的一级检测抗体和 BV421 标记的链霉亲和素（一种"蓝色"发射体），后者需要额外的检测系统孵育步骤 30 分钟。 请点击这里查看此图的较大版本.

检测内精密度
对三种代表性 疏螺旋体 抗原（图2）的Spearman相关性分析表明，在检测人血清中存在的抗疏螺旋 体抗体时，MFI值具有一致的可重复性。

图 2:基于双报告微球的 疏螺旋体 检测的检测内精密度。 Spearman 的相关性分析显示，当使用 PE 检测系统检测 疏螺旋体特异性 IgM 抗体 （A） 和使用 BV421 检测系统检测 疏螺旋体 特异性 IgG 抗体 （B， C） 时，双报告基因检测具有较高的检测内精密度。使用半自动程序对总共 21 个血清样本进行一式两份分析。在每张图中，MFI信号相互绘制，并通过线性回归进行分析。显示为红色虚线的线性曲线 （x=y） 表示检测系统的相同 MFI 信号。 请点击这里查看此图的较大版本.

批间精密度
使用双报告基因测定法观察到良好的测定间重现性。Levey-Jennings图表（图3）在七次独立运行中测量了质控样品的MFI值，表明所有代表性抗原的检测间精密度都很高。四种代表性 疏螺旋体 抗原的平均变异系数百分比（CV% = 标准差/平均值 × 100）为 5.3%。

稀释线性度
由于原始的单报告基因检测和新的双报告基因检测采用不同的流式细胞术平台，因此我们比较了两种流式细胞术仪器之间相同抗原免疫检测的中位荧光输出（图4）。样品稀释系列为 IgM 和 IgG 评估提供了线性稀释曲线，在整个稀释范围 （1:100-1:12,800） 内，仪器之间的剂量反应具有良好的平行性。

图 3:基于双报告微球的 疏螺旋 体检测的批间精密度。 为了评估批间精密度，在七次独立运行中分析了质控样品的 疏螺旋体特异性 IgM （A） 和 IgG （B-D） 抗体反应，每次都在重复孔中。测定是手动进行的。MFI 值绘制在 Levey-Jennings 图中。绿线给出所有值的平均值。两条红色虚线表示批间精密度的公差范围。这是根据标准差 （2.5 S.D.） 的 2.5 倍的平均值计算得出±。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:基于双报告微球的 疏螺旋 体检测的稀释线性。 在样品稀释度为 100 倍至 12,800 倍时，使用单报告仪器和双报告基因仪器手动执行时，IgM 检测 （A） 和 IgG 检测 （B） 的稀释曲线相似。在所有测试的稀释度中，使用单报告仪器（红色符号）的MFI值略高于双报告仪器（蓝色符号）。所示是 2 种代表性抗原的稀释曲线，每个稀释点代表一式三份孔的平均测量值，标准偏差 （SD *） 由误差线表示。注意:在此比例下看不到小型 SD。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充材料。请点击这里下载此文件。

作者没有什么可透露的。