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一套用于快速评估中性粒细胞功能的筛选技术

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DOI：

10.3791/65329

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2024年2月9日

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1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

通讯作者： Wagner Fontes <wagnerf@unb.br>

本文内容

摘要

本方案包含一系列中性粒细胞功能检测方法，可作为筛选手段，用于评估不同信号通路相关的功能。该方案包括细胞活力、纯度、活性氧生成、实时迁移、吞噬作用的初步且简单的评估，以及对中性粒细胞胞外诱捕网的初步分析建议。

摘要

中性粒细胞是先天免疫反应中已知的第一道防线之一，能够执行多种特定的细胞功能，例如趋化作用、逆行迁移、吞噬作用、脱颗粒释放细胞毒性酶和代谢产物，以及释放DNA形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。中性粒细胞不仅自身具有严密调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分。由于新鲜分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短，且个体间差异较大，因此充分高效地利用所获取的样本至关重要。研究人员通常需要进行筛选实验，以全面评估在特定实验条件下可能受到影响的多种中性粒细胞功能。为此，本研究建立了一套在单次正常密度中性粒细胞分离后即可连续开展的检测组合，旨在兼顾速度、全面性、成本与准确性之间的平衡。所得结果可用于推断并指导后续深入研究。该流程平均耗时约4小时，包括细胞活力检测、活性氧（ROS）生成测定、实时迁移分析以及在玻片上进行的酵母吞噬实验，同时保留足够数量的细胞用于后续更深入的组学研究。此外，该流程还包括一种简便方法：通过快速全染染色后在光学显微镜下观察，初步判断是否存在NETs形成，尽管缺乏特异性标记物，但足以提示是否值得在该方向上投入进一步研究。多种功能检测之间共享部分实验环节，从而减少了总体分析时间和成本。该流程被命名为NeutroFun Screen，尽管存在 局限性，但较好地平衡了上述各项因素。此外，本研究的目的并非提供一套固定不变的检测方案，而是提供一种可依据各实验室资源与需求灵活调整的操作指南。

引言

中性粒细胞是人体血液中最丰富的先天免疫细胞，已知在感染和炎症过程中发挥重要作用，是组织损伤部位最先到达的反应细胞1。近年来，人们日益认识到中性粒细胞在多种疾病以及维持机体稳态中所起的关键作用2。中性粒细胞不仅自身具有严格调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分3,4,5。因此，在许多研究背景下，探究中性粒细胞及其多种非典型细胞功能——如趋化性、逆向迁移6、吞噬作用7、呼吸爆发8以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的释放7——至关重要，尤其是在需要评估特定分析条件下所引发的中性粒细胞功能、形态或分子变化潜力的研究中。

新分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短、高度动态且易于活化9。然而，目前尚未建立一种不影响中性粒细胞功能反应的高效保存方法，这使得需要连续进行的多项检测难以实施。此外，以往描述的功能分析方法10,11依赖于流式细胞术和/或荧光染色技术，在需要对中性粒细胞进行广泛而初步评估时，可能并非可行的选择。

为解决这些问题，本方案描述了一套可在单次分离过程后进行的检测，包括细胞活力评估、活性氧（ROS）生成、实时迁移以及对Saccharomyces cerevisiae的吞噬作用检测，其结果可用于深入推导后续研究。该方法命名为NeutroFun Screen，旨在涵盖除脱颗粒以外的主要效应功能，整个流程平均耗时4小时，其中包括1小时的激活时间。此外，剩余细胞还可用于更深入的组学研究等进一步分析。该方法的优势在于在速度、全面性、成本和准确性之间实现了良好平衡。

此外，还有一种方法可以在没有特异性标记物的情况下，简便地观察到中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的初步迹象，虽不足以确证，但足以判断是否值得在此方向上进一步深入研究。所测试的多种功能旨在整合不同检测方法之间的共性，从而缩短分析时间并降低成本。该方法的主要目标是提供一种在速度、全面性、成本和准确性之间达到平衡的功能性分析手段，以概览中性粒细胞的反应情况，因此可作为研究新型刺激物对正常密度中性粒细胞作用的有用初始步骤。

方案

所有实验均严格遵循巴西利亚大学机构审查委员会制定的伦理准则（编号13364819.0.0000.5558），样本以代码标识以确保供体匿名。细胞来源于18至35岁、签署知情同意书且符合以下纳入标准的健康男性供体：非吸烟者/非电子烟使用者，无慢性健康疾病，且在过去14天内无炎症性疾病史。

1. 血液采集

  1. 无菌操作，将 0.3 mL 浓度为 5,000 IU/mL 的肝素（参见 材料表）加入无菌 20 mL 注射器中，以肝素化该注射器。
  2. 在穿刺部位上方约 10 cm 处绑扎静脉压脉带，并定位肘正中静脉或头静脉以进行静脉穿刺。
    注意：确保压脉带总使用时间不超过 1 分钟。
  3. 用 70% 酒精清洁穿刺部位，然后进行静脉穿刺。
  4. 采血后，轻柔地将注射器倒置 3 至 4 次，使血液与肝素充分混匀。

2. 中性粒细胞分离

注：多形核白细胞（PMNs）通过密度梯度离心法分离，随后对残留的红细胞（RBC）进行低渗裂解，方法如前所述11 有所改变。该方法并非进行筛选实验的强制要求，只要所选方法能达到相应的存活率，即可替代使用。 >97%，引发或激活 <3% 的中性粒细胞，并能获得足够的细胞数量用于所有检测、重复实验及不同实验条件。必须在无菌条件下操作，并使用无内毒素溶液，以避免细胞活化。

  1. 配制12 mL的60%和70%分离介质稀释液（ commercially available；参见 材料表) 置于50 mL锥形管中。
  2. 从底部到顶部逐层制备梯度，使用5 mL移液器每次加入4 mL的60%稀释液覆盖在70%稀释液之上。操作应轻柔，避免混合两层界面。
  3. 将12 mL抗凝血液小心地加至密度梯度液上方。以200 x g离心 g 室温下孵育15分钟。
    注意：从这一步开始，直到中性粒细胞激活为止，所有使用的试剂和试管都必须置于装有冰块的冷藏容器中保存。
  4. 弃去血浆/单个核细胞层，然后轻柔地将红细胞沉淀物上方的液体层转移至两支15 mL圆锥形离心管中，每管约7.5 mL。用Hank's平衡盐溶液（HBSS；参见 材料清单).
  5. 300 x g 离心 g 5 分钟 19 °C.
  6. 用HBSS洗涤细胞沉淀。
    1. 弃去上清液，将管子倾倒，然后在 7 mL HBSS 中轻轻重悬沉淀。
    2. 300 x g 离心 g 5 分钟 19 °C 去除所有分离介质。
  7. 对剩余的红细胞进行低渗裂解。
    1. 弃去上清液，并将沉淀物合并至同一离心管中。
    2. 将红细胞/中性粒细胞沉淀重悬于 3 mL 无菌 H2O，并在25秒内加入3 mL HBSS（2倍浓度）以恢复渗透压。随后，以300 x g 5 分钟 19 °C.
    3. 重复步骤 2.8.1 和 2.8.2，直至获得白色、无红细胞的沉淀。
      注意：必须尽快移除上清液，以尽量减少中性粒细胞与红细胞裂解产物的接触。或者，可将第二次低渗裂解步骤替换为轻轻重悬残留的红细胞层并完全移除上清液，因为残留的红细胞将沉积在中性粒细胞沉淀物上方。
  8. 弃去上清液，将试管中的液体轻轻倒出，用剩余的缓冲液轻柔重悬中性粒细胞，并转移至预冷的微量离心管中。
    注意：使用移液器转移重悬细胞时，务必标注体积。
  9. 转移 3 × 1 µL 将细胞悬液转移至洁净的玻璃载玻片上（三个孔） 1 µL 每个）并用快速全染法染色（参见 材料清单用于形态学和纯度评估12.
    1. 使用快速泛染法染色时，将玻片浸入泛染固定液中五次° 1，六次在伊红中° 2，以及苏木精中染色两次° 3次，每次浸入持续1秒。
    2. 用蒸馏水轻轻清洗载玻片。
    3. 静置沥干并风干。
  10. 在显微镜下观察，对每个孔中随机选取的300个细胞进行计数，从而区分中性粒细胞与其他粒细胞。
  11. 转移 1 µL 细胞悬液的 49 µL 0.2% 台盼蓝染料13 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并区分死细胞与活细胞。
  12. 调整细胞浓度至 6,667 个细胞/μLµL 使用含钙和镁的50%自体血浆与50% HBSS混合溶液。将6,667个细胞/µL 将悬液均匀分配至对应待测条件（包括阴性对照）的微量离心管中。
    注意：可使用与模式生物中循环中性粒细胞浓度相近的任何细胞浓度，但为保证实验可重复性，所有实验中必须使用相同的细胞浓度。

Percoll 密度梯度；离心示意图；红细胞裂解；中性粒细胞分离；细胞分离方法。
图 1：中性粒细胞分离流程图。 将两种浓度的分离介质（Percoll）(A) 进行叠加 (B)，然后将血液样本加在分离梯度的上方 (C)。离心后，中性粒细胞位于中间层 (D)，将该层分为两个 15 mL 离心管 (E)。细胞悬液用 HBSS 洗涤两次并离心 (G–I) 以去除介质，然后重悬细胞，并对残留的红细胞进行两轮低渗裂解处理 (J–M)。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 中性粒细胞活化的准备

  1. 在1.5 mL离心管中，为每种条件配制激活体系，使最终细胞浓度为6,600个细胞/µL。例如，为检测100 nM fMLP（N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸；参见材料表）的作用，向495 µL浓度为6,667个细胞/µL的细胞悬液中加入5 µL的10 µM fMLP。对于阴性（未刺激）对照组，加入含Ca2+和Mg2+的HBSS。
    注意：为演示本方法，以下刺激物的终浓度分别为：100 nM fMLP、16 µM fallaxin（一种天然存在的抗菌肽14）以及100 nM PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯）（参见材料表）。
  2. 在37 °C下静置孵育，不旋转。
    ​注意：所有功能检测所用的样品均取自该细胞悬液，后文将此悬液称为激活体系。

4. 用于评估活性氧产生的氯化硝基四氮唑蓝（NBT）检测

  1. 制备 NBT 工作液：针对每个实验条件，按照以下步骤制备 6 mM 的 NBT（参见材料表）工作液：
    1. 将 0.0005 g NBT 溶解于 10 µL 二甲基亚砜（DMSO）中，涡旋混匀至少 15 分钟。
    2. 加入 90 µL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 溶液，涡旋混匀最多 2 分钟。
      注意：所有涉及 NBT 的操作均需在避光条件下进行。
  2. 进行 NBT 载玻片检测。
    1. 细胞活化 20 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，并小心转移 2 µL PMN 至洁净的载玻片上。在 37 °C 的湿化孵育盒中孵育 20 分钟。
      注意：不要将细胞悬液在载玻片上涂布过广，否则可能在孵育前干燥。
    2. 在细胞上加入 1 µL NBT 工作液，继续在避光条件下孵育 20 分钟。
    3. 用热风干燥载玻片，并在每个区域滴加一滴甲醇固定 1 分钟。随后用 0.03% 番红溶液（参见材料表）染色 1 分钟。
    4. 用蒸馏水轻轻冲洗载玻片。
    5. 让载玻片自然晾干，并在显微镜下观察。
    6. 在每个区域随机计数 100 个细胞，区分含有和不含甲臜沉积物的中性粒细胞。
  3. 进行 NBT 分光光度法检测。
    1. 细胞活化 40 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，将 90 µL PMN 从活化体系转移至洁净的微量离心管中。然后，小心加入 20 µL 6 mM NBT 溶液。在 37 °C 避光孵育 20 分钟。
    2. 加入 100 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS；参见材料表）溶液，并涡旋混匀。
    3. 使用探头式超声仪，以 60% 振幅进行超声处理，共五个循环，每个循环 15 秒，间隔 15 秒。随后在 12,000 x g 离心 5 分钟。
    4. 将 60 µL 上清液转移至透明底 96 孔板中，在 570 nm 波长处测定甲臜产物的吸光度。

5. 吞噬作用检测

  1. 制备 33,000 酵母/μL 的细胞悬液µL 每种条件下分别制备悬液，具体步骤如下：
    1. 加入约 0.75 mg 干酵母 （酿酒酵母）；参见 材料清单) 至 200 µL HBSS Ca2+Mg2+ 并在恒温混匀仪中孵育 100 °C 以500 rpm转速离心至少15分钟。
    2. 通过涡旋振荡使混合物充分匀浆，然后转移 5 µL 酵母悬液的量至 45 µL 用0.2%台盼蓝染液染色。使用血细胞计数板对酵母细胞进行计数。
    3. 将初始悬液的浓度调整至 33,000 个酵母细胞/μLµL 使用 HBSS Ca2+Mg2+将悬液置于冰上保存，直至使用。
  2. 细胞活化20分钟后，轻轻混匀细胞悬液并转移 5 µL 激活系统的作用 5 µL 33,000 酵母/µL 酿酒酵母 在新的无菌微量离心管中重悬。
    注意：中性粒细胞与酵母的比例为 1:5（PMN:酵母）。
  3. 立即转移 6 µL 将PMN/酵母悬液分别加入洁净载玻片的三个孔中（2 µL 每个样本）并在湿盒中孵育40分钟。
    注意：不要将细胞悬液在载玻片上铺展过多，否则可能在孵育前干燥。
  4. 在热空气中干燥载玻片，并按照上述步骤2.9所述，用快速泛影染色法染色。
    注意：快速全视野染色的第三步对玻片的显微镜分析至关重要。此步骤染色时间 ≥3 秒会导致玻片难以区分酵母与中性粒细胞核叶，从而无法用于分析。
  5. 在显微镜下观察玻片，每孔随机计数100个中性粒细胞，并区分吞噬阳性与阴性的中性粒细胞（PMNs）。
    注意：若至少有一个酵母颗粒位于中性粒细胞膜内或直接与膜接触，则判定该中性粒细胞为吞噬阳性。如需分析酵母/中性粒细胞比例，应同时计数被吞噬的酵母颗粒数量。

6. 中性粒细胞实时趋化迁移实验

注意：迁移实验的操作方法与先前描述的方案15相似，但需进行以下调整：

  1. 通过向基于阻抗的实时细胞分析仪（RTCA）板的下室中加入 160 µL 趋化因子（例如 fMLP、IL-8、C5 或 LTB4；参见 材料表）来制备趋化梯度。对于阴性对照和空白对照，加入 160 µL HBSS Ca2+Mg2+。
  2. 安装上室，并加入 25 µL HBSS Ca2+Mg2+。室温孵育至少 1 小时，以形成趋化梯度。
  3. 细胞活化 60 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，并将 60 µL 细胞悬液加入上室。向空白孔中加入 60 µL HBSS Ca2+Mg2+。
  4. 将 RTCA 板放入仪器，并设置 RTCA 软件每 60 秒测量一次细胞指数（CI），持续 2 小时。
    ​注意：RTCA 板可按照先前描述的方法清洗后重复使用16。简言之，先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 RTCA 室和电极三次，再用 I 型超纯水清洗两次。然后在上下室中加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.53 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）孵育 40 分钟，最后用超纯水清洗三次。

7. NET 诱导实验

  1. 细胞激活10分钟后，轻轻混匀细胞悬液，将每种待评估激活体系中的中性粒细胞（PMNs）各取4 µL，分别加入洁净玻片的两个孔中。于37 °C湿盒中孵育30分钟。
  2. 向其中一个孔中加入1 µL的DNAse I，并在湿盒中37 °C孵育20分钟。
  3. 将玻片干燥后，按“中性粒细胞分离”部分步骤2.9中所述方法，用快速全景染色法进行染色。
  4. 在显微镜下观察玻片。
    注意：观察是否有中性粒细胞胞外诱捕网（NET）释放的迹象，其特征为网状结构的存在。一旦发现，需确认DNAse I处理是否能够消除此类结构。本实验仅提示可能存在NET形成，尚需进一步检测以确认其存在。

结果

本研究中采用的基于密度的分离方法（图1）符合所设计实验的要求。通过该方法获得的中性粒细胞参数包括：活力≥98%，纯度≥94%，细胞得率≥1.5 × 107，且通过筛查试验未检测到明显激活。中性粒细胞分离过程中的两个关键步骤是抗凝和红细胞去除。在密度梯度层析前，将抗凝血液样本置于轻柔摇动的环境中，并选择可同时防止细胞激活和污染的红细胞去除方法，均可影响实验的得率和可重复性。

为了评估中性粒细胞功能的整体功能概况，建立了一种实验流程，使得至少两名研究人员可在约4 h内完成建议的筛选实验，其中包括1 h的激活时间和2 h的实时迁移监测，如图2所示。

中性粒细胞分离流程、NET检测流程、细胞迁移时间线；显微镜观察、RTCA分析设置。
图2：NeutroFun Screen 工作流程。 为评估特定实验条件下触发的中性粒细胞功能反应谱，NeutroFun Screen 工作流程需至少两名研究人员共同参与。研究者1（R1）首先启动中性粒细胞（PMN）的分离流程，随后进行细胞浓度调整及激活体系的孵育；与此同时，研究者2（R2）准备后续各项检测所需的材料，并将检测任务进行分工：R1负责吞噬作用、NET形成及分光光度法NBT检测；R2负责实时迁移检测和NBT载片试验。请点击此处查看该图的放大版本。

经典的NBT检测法17已针对载玻片观察和分光光度法评估进行了优化，用于检测NBT与中性粒细胞（PMNs）产生的活性氧（ROS）反应后生成的甲臜沉淀。分光光度法检测可在不同实验条件下实现相对定量，而显微镜检测则适用于描述性和半定量分析，可评估甲臜晶体分布的规律性、细胞形态以及含甲臜细胞的数量。分光光度法检测结果如图3A所示，表明100 nM PMA诱导的ROS生成水平高于fMLP组和对照组，其平均比值为3:2:1。NBT载玻片检测结果（图3B）与分光光度法结果一致，同样显示PMA是比fMLP更强的ROS诱导刺激物（图3C），该结果与先前通过流式细胞术直接测定ROS所证实的结果相符18。在细胞计数方面，含甲臜晶体的中性粒细胞数量在PMA:fMLP:对照组中的比值为7:4:1，同时揭示了fMLP与PMA激活的PMNs之间甲臜分布模式的差异：fMLP处理导致少数细胞高度活化，而PMA则在大多数PMNs的胞质中广泛诱导甲臜晶体的形成。此外，还观察到一些可区分不同处理条件的形态学特征，例如PMA处理后出现明显的细胞聚集现象。对照组中缺乏此类典型的活化特征，且甲臜水平较低，表明细胞处于静息状态且未受到显著干扰。因此，NBT检测被证实是一种简单、经济且可靠的中性粒细胞ROS生成检测方法，可用于评估特定刺激物诱导ROS生成的能力与强度。

吸光度图、显微镜图像和柱状图显示中性粒细胞对对照组、fMLP和PMA的反应。
图3：NBT试验。（A）通过甲臜吸光度（490–630 nm）测定中性粒细胞在不同条件下的呼吸爆发反应（阴性对照：100 nM fMLP 和 100 nM PMA）。数据来自四名供体，以均值±标准差（SD）表示。* = 所有组间均存在显著差异（p ≤ 0.05）；£ = 对照组与PMA组、fMLP组与PMA组之间的比较显示显著差异（p ≤ 0.05）。（B）载玻片试验可进行定性分析，包括甲臜沉积物的强度、其在细胞内的位置以及细胞聚集情况。黑色箭头指向甲臜晶体。比例尺：20 µm。（C）通过光学显微镜计数含有甲臜的中性粒细胞（PMNs）数量。数据来自八名供体，以均值±SD表示。*** p < 0.0001，Student t检验。请点击此处查看该图的放大版本。

采用吞噬作用载玻片测定中性粒细胞发生吞噬作用的比例，以此确定吞噬率，如图4所示。尽管100 nM fMLP和16 µM抗菌肽均似乎增加了酵母的吞噬，但与对照组相比，差异均未达到统计学显著性；只有在双重刺激下，吞噬作用显著增强，提示双重刺激可能引发协同反应。

吞噬作用分析；柱状图；抗菌肽效应；显微镜图像；数据比较。
图4：吞噬作用检测。通过中性粒细胞对酵母的吞噬能力（计数含有酵母的中性粒细胞）进行评估。尽管在酵母孵育前暴露于100 nM fMLP或16 µM抗菌肽的条件下，吞噬作用较对照组有所增强，(A) 但该增强无统计学显著性。有趣的是，先与fMLP进行初始孵育，再加入抗菌肽，可显著增强人中性粒细胞的吞噬作用（CTRL与fMLP+抗菌肽组之间的星号所示）。(B) 黑色箭头指示酵母细胞，绿色箭头指示单独的中性粒细胞，红色箭头指示正在吞噬酵母的中性粒细胞。数据来自五名供体，以均值±标准差表示。比例尺：20 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

实时细胞迁移结果的示例如图5所示，展示了100 nM fMLP对中性粒细胞已知的趋化效应。细胞迁移动力学数据经Gompertz模型拟合，从而可对模型参数进行比较。

细胞指数增长比较图；fMLP 对比 CTRL；使用指数函数拟合数据；时间序列。
图 5：实时细胞迁移。 细胞指数反映了由细胞迁移引起的电阻抗变化。在本实验中，将100 nM fMLP加入下室作为中性粒细胞迁移的阳性对照，阴性对照（CTRL）的下室中仅含有HBSS。叠加的曲线表示对Gompertz模型进行修正后拟合的曲线，以最佳匹配上升和下降斜率。数据来自三位供体，以均值±标准差表示。*p < 0.05，采用Student's t检验。请点击此处查看该图的放大版本。

最后，介绍一种简单的光学显微镜检测方法，可用于提示中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的存在，该方法使用快速潘顿染色对中性粒细胞（PMN）进行染色。可以观察到，在某些特定的NET诱导刺激条件下（如PMA或某些抗菌肽），即使激活时间较短（1小时），也能在细胞周围观察到丝状网状结构；而在阴性对照或fMLP等其他条件下则无法观察到此类结构（图6）。为了进一步支持这一结论，在使用100 nm PMA或抗菌肽刺激细胞40分钟后加入DNase I，结果发现NET样结构被清除（图6）。尽管该方法不适用于NET的精确表征，且可能受到人工假象的干扰，但它是一种经济、简便且具有启发性的初步检测手段，尤其适用于刺激因素的作用尚不明确或描述不足的研究场景，可为后续深入分析NET提供合理的依据。

PMA、fMLP、肽类刺激下的中性粒细胞反应；显微镜观察、细胞应答、免疫学研究。
图6：提示性NET形成检测。 在载玻片上激活1小时后，经全景染色的中性粒细胞可进行定性分析，以提示NET的释放。对照组（A,B）和fMLP组（C,D）未显示任何NET释放迹象，而PMA激活（E-H）诱导了类似NET结构的形成，且该结构可被DNase I处理降解（I-L）。对一种抗菌肽对中性粒细胞作用的研究表明，此类刺激可能能够诱导NET释放，因为载玻片上出现了类似NET的结构（M-P），且这些结构也可被DNase I降解（Q-T）。红色箭头指向类似NET的结构。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

中性粒细胞是高度动态且反应迅速的细胞，寿命较短，目前尚无法冻存19，这使得对其生物学特性的研究具有挑战性。因此，必须严格遵循操作步骤，以获得存活率高、富集度高且处于静息状态的中性粒细胞11,20。本研究采用基于密度的分离技术，强调操作轻柔、步骤最少，并在激活前全程保持低温环境。此外，血液样本需在静脉穿刺后30分钟内开始处理，并在室温下保存。本研究提供了一种可减少操作应激和实验时间的方案。为进一步简化流程，我们在原有方案中引入了一个新的可选步骤，即在单次溶血处理后，通过轻柔重悬并吸除红细胞层来去除红细胞。该步骤仅需一次低渗溶血即可去除大部分红细胞，从而减少操作应激和实验时间。然而需要注意的是，该步骤的效果在很大程度上依赖于操作者的技能，可能无法完全清除红细胞。此外，吸除红细胞时可能导致部分中性粒细胞丢失，但这并不影响最终得率，因为在梯度离心中靠近红细胞层收集时初始回收的中性粒细胞数量更多。因此，若实验不要求最高纯度，或操作者具备稳定良好的操作经验，建议采用红细胞吸除步骤。对于本文所展示的筛选实验而言，少量红细胞污染（<3%）不会干扰实验结果。

为确保所有操作均按时完成，包括试剂准备，本文提供了一个工作流程（图2），详细说明了时间安排以及两名研究人员之间的任务分工。在完成所有功能检测后，可对剩余细胞进行进一步分子研究的准备，例如通过适当的裂解缓冲液裂解细胞并储存，用于组学研究。

活性氧（ROS）的产生
呼吸爆发是中性粒细胞致敏和活化的标志性特征18,21, 评估活性氧（ROS）的产生是估算中性粒细胞活化状态的常用方法。本研究采用两种方法评估ROS的产生：光学显微镜法和分光光度法。

NBT试验是一种评估中性粒细胞呼吸爆发的常用方法22,23。目前常用的两种方法分别为基于光学显微镜（或载片试验）和基于分光光度法的检测方法24,25,26。尽管光学显微镜可实现细胞水平细节的观察，但容易受到操作者主观偏差的影响。因此，NBT载片试验可作为分光光度法检测的定性补充，用于分析表型特征，如甲臜形成模式、强度以及细胞聚集情况。

NBT玻片法和分光光度法检测中的关键步骤均为NBT和甲臜的完全溶解。与生产商的建议相反，NBT在水中溶解性差。然而，将NBT在DMSO中均质处理至少15分钟，然后加入水/HBSS并涡旋振荡2分钟，可实现完全溶解。此外，为分析甲臜的吸光度，必须完成两个关键步骤：（1）通过多形核白细胞（PMN）裂解释放细胞内的甲臜结晶；（2）甲臜结晶的完全溶解。这两个步骤均可通过最近提出的方法实现27：即用10%十二烷基硫酸钠（SDS）处理细胞沉淀，随后进行超声处理，并在570 nm处测定上清液的吸光度。

此外，阴性对照组和阳性对照组的NBT结果是评估筛选的第一步。该步骤必须显示出显著差异，因为通过甲臜生成来评估活性氧（ROS）的产生情况，可表明细胞分离过程是否可能因刺激或抑制而导致细胞静息状态发生非预期的变化。

其他方法，如细胞色素c还原28或流式细胞术29分析，常用于活性氧（ROS）检测；然而，考虑到筛选实验的需求，这些方法需要较长的实验时间、特定的标记物以及昂贵的仪器。鲁米诺/异鲁米诺的化学发光法是一种快速且经济有效的ROS检测方法，同时还能区分细胞内和细胞外的ROS。但该方法需要使用化学发光仪30,31。尽管可通过共享平台避免仪器成本问题，但该方法仍不适用于与其他检测同时进行的高通量筛选分析。

吞噬作用
通过计数发生吞噬作用的中性粒细胞数量以及每个中性粒细胞所吞噬的酵母数量，PMN/酵母共孵育实验可总体评估中性粒细胞的吞噬能力与效率。然而，由于酵母颗粒本身即是一种激活信号，将对照组与经预处理的PMN进行比较构成了一种双重刺激体系，可能不会显示出显著差异，如CTRL组与fMLP处理的PMN之间的比较所示（图4）。尽管如此， 该实验可用于判断某种潜在调节因子是否会对吞噬作用产生任何影响。本研究利用该实验测试了一种新型抗菌肽，结果表明该刺激组合可能引发值得关注的反应，而这种组合刺激最近已被认为是实现有效激活所必需的32。

该实验的关键步骤在于染色，因为如果载玻片在泛染液3号（苏木精）中放置时间超过或等于3秒，分析结果将变得不可靠。这是由于酵母细胞与中性粒细胞的细胞核叶状结构无法被区分开来。此外，该方法允许在中性粒细胞暴露于调节剂后对其进行形态学分析。流式细胞术是另一种分析吞噬作用的有效技术33，但其存在一定的局限性，例如难以区分膜结合颗粒与被吞噬的颗粒，以及其他与所提出的筛选体系相关的因素，如前一主题所述。本文所述方法也存在同样的局限性，但应将其视为用于指导后续研究的初步筛选手段。

实时迁移
实时筛选方案经过优化，用于评估中性粒细胞（PMNs）的迁移能力。尽管先前有研究建议，为了在阴性对照与IL-8处理之间显示出差异，需要对RTCA板的下表面进行包被15本研究显示，在未添加包被剂的情况下，经fMLP处理的细胞具有较高的置信区间（CI）值。结果表现出良好的可重复性，从12分钟开始出现显著的细胞迁移。此外，对获得的迁移数据进行曲线拟合分析，可揭示细胞指数最大值、上升和下降斜率等参数，这些参数有助于理解迁移的动力学特征，并可能依赖于浓度或在不同条件下存在差异。中性粒细胞迁移曲线的最佳拟合（图5) 拟合至修正的 Gompertz 函数34，表明fMLP可增加最大细胞指数及增大的斜率。

在RTCA系统中需特别注意避免产生气泡，因为气泡可能阻塞细胞通过电极，从而影响实验结果。该方法的一个限制因素是培养板成本较高。尽管存在更为经济的细胞迁移分析技术，但这些方法往往重现性较差，或操作繁琐且耗时，例如Boyden小室法35。因此，RTCA是一种可靠的迁移分析方法，且可与本文所述的其他筛选实验兼容。

NETs
最后，研究人员开发了一种有前景、简便且低成本的检测方法，用于对NET形成进行初步评估，该方法基于光学显微镜观察。该方法源于对吞噬作用载片的观察：在测试PMA（一种特定的NET诱导刺激物）对吞噬能力影响的实验中，与对照组（CTRL）和fMLP组相比，PMA诱导形成了网状结构。本研究假设这些结构可能提示NET的释放。为验证这一假设，在细胞激活后使用DNase I处理样本，结果发现PMA激活的中性粒细胞中不再存在丝状结构。认为这些结构很可能为NET的依据包括：PMA被广泛引用为NET形成的已知诱导剂36,37，通过荧光显微镜结合NET特异性标记物可观察到类似结构38,39，以及DNase I可催化NET的降解40,41。需要强调的是，该方法并非用于确认NET的形成，而仅是一种提示NET可能存在的初步筛查手段。尽管该检测存在一定局限性（例如NET可能与染色伪影相混淆），但其在快速、低成本的筛查中具有重要价值，可与其他功能实验同时进行。一旦初步筛查提示NET可能与研究相关，可进一步通过共聚焦显微镜或电子显微镜进行深入评估42，相关内容将在后文讨论。

在我们的实验室中，通常通过这一系列筛选实验来评估新型抗菌肽（这些肽可能还具有免疫调节活性），以更好地指导进一步分析某些肽对人中性粒细胞的作用，因为其中一些肽表现出有趣的活性，如调节活性氧（ROS）43、吞噬作用、迁移和/或中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的调节特性。

总之，NeutroFun 筛选法为从大量未经测试的化合物中鉴定潜在的正常密度中性粒细胞活性调节剂提供了一种有价值的工具。然而，需要注意的是，该方法仅适用于初步筛选。在完成初步筛选后，可将更昂贵、更先进且耗时更长的方法集中用于由初步结果提示的特定功能或通路，以进行数据验证。对于活性氧（ROS）的产生、吞噬作用以及中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成，已有多种替代方法可用于数据验证并获得进一步的定量结果。NET 的可视化与定量可通过免疫荧光显微镜分析实现，该方法可确定细胞外 DNA 与颗粒蛋白（如髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶）的存在及其共定位情况，相关细节已有近期详细描述42。活性氧在多种生物过程中发挥着关键作用，因此对其研究广泛且多样。目前最成熟的方法包括利用抗体的技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和化学发光或荧光检测的免疫印迹，以及通过 DCFDA 标记、电子顺磁共振（EPR）波谱法和酶活性测定对不同标记条件下的细胞进行流式细胞术分析44。类似地，吞噬作用的可靠评估也可通过多种方式进行，替代方法包括单独使用流式细胞术45,46，或结合荧光显微镜分析47。文中所述的实时细胞迁移检测是一种稳健且充分的实验方法，无需进一步验证，且提供了其他方法无法涵盖的参数。这些方法的其他组合可能更适用于特定研究场景，但总体而言，本方案代表了一种快速且经济的组合策略，能够涵盖多种中性粒细胞活性。

总之，本研究旨在提供一系列检测方法，这些方法包含简单、快速且低成本的技术，用于评估中性粒细胞对新分子和新条件的多种反应，从而为推进更高级方法的研究方向提供依据。主要局限性在于，ROS、NET 和吞噬作用检测的结果应视为初步结果，需通过更特异、更复杂的检测方法进一步验证；此外，依赖非自动化显微镜进行细胞计数的方法容易引入无意识的偏倚。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢以下资助机构：FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP 和 FINATEC。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CIM-Plate 16Agilent 5665825001
CLARIOstar 酶标仪 BMG LABTECH美国专利号 9,733,124
产品详情：MARS 数据分析软件
二甲基亚砜Dinâmica1582
脱氧核糖核酸酶 ISigma - AldrichDN 25
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Sigma - AldrichE5134
快速全染染色液Laborclin620529
载玻片Exacta7102
含钙、含镁、不含酚红的 Hank’s 平衡盐溶液Sigma - Aldrich55037C
不含氯化钙、硫酸镁和碳酸氢钠的 Hank’s 平衡盐溶液Sigma - AldrichH4641
肝素Blau 7896014655229
层流柜VecoVLFS-12
显微镜Zeiss415501-0101-002产品详情：Primostar 1
混匀模块BIOERMB-102
改进型血球计数板（亮线型）New Optik1110000
N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸Sigma - AldrichF3506
氮蓝四唑NeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101分离介质
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯Sigma - AldrichP8139
磷酸盐缓冲液片剂Sigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
沙黄Sigma - Aldrich50240
十二烷基硫酸钠Cytiva17-1313-01
超声波破碎仪QsonicaQ125
台盼蓝溶液VetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence 实时细胞分析系统（RTCA DP，双用途）Agilent 380601050产品详情：RTCA 系统由检测硬件、细胞培养板和软件组成

参考文献

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

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