本方案包含一系列中性粒细胞功能检测方法，可作为筛选手段，用于评估不同信号通路相关的功能。该方案包括细胞活力、纯度、活性氧生成、实时迁移、吞噬作用的初步且简单的评估，以及对中性粒细胞胞外诱捕网的初步分析建议。
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摘要
摘要
中性粒细胞是先天免疫反应中已知的第一道防线之一，能够执行多种特定的细胞功能，例如趋化作用、逆行迁移、吞噬作用、脱颗粒释放细胞毒性酶和代谢产物，以及释放DNA形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。中性粒细胞不仅自身具有严密调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分。由于新鲜分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短，且个体间差异较大，因此充分高效地利用所获取的样本至关重要。研究人员通常需要进行筛选实验，以全面评估在特定实验条件下可能受到影响的多种中性粒细胞功能。为此，本研究建立了一套在单次正常密度中性粒细胞分离后即可连续开展的检测组合，旨在兼顾速度、全面性、成本与准确性之间的平衡。所得结果可用于推断并指导后续深入研究。该流程平均耗时约4小时，包括细胞活力检测、活性氧（ROS）生成测定、实时迁移分析以及在玻片上进行的酵母吞噬实验，同时保留足够数量的细胞用于后续更深入的组学研究。此外，该流程还包括一种简便方法：通过快速全染染色后在光学显微镜下观察，初步判断是否存在NETs形成，尽管缺乏特异性标记物，但足以提示是否值得在该方向上投入进一步研究。多种功能检测之间共享部分实验环节，从而减少了总体分析时间和成本。该流程被命名为NeutroFun Screen，尽管存在 局限性，但较好地平衡了上述各项因素。此外，本研究的目的并非提供一套固定不变的检测方案，而是提供一种可依据各实验室资源与需求灵活调整的操作指南。
引言
中性粒细胞是人体血液中最丰富的先天免疫细胞，已知在感染和炎症过程中发挥重要作用，是组织损伤部位最先到达的反应细胞1。近年来，人们日益认识到中性粒细胞在多种疾病以及维持机体稳态中所起的关键作用2。中性粒细胞不仅自身具有严格调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分3,4,5。因此，在许多研究背景下，探究中性粒细胞及其多种非典型细胞功能——如趋化性、逆向迁移6、吞噬作用7、呼吸爆发8以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的释放7——至关重要，尤其是在需要评估特定分析条件下所引发的中性粒细胞功能、形态或分子变化潜力的研究中。
新分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短、高度动态且易于活化9。然而，目前尚未建立一种不影响中性粒细胞功能反应的高效保存方法，这使得需要连续进行的多项检测难以实施。此外，以往描述的功能分析方法10<....
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方案
所有实验均严格遵循巴西利亚大学机构审查委员会制定的伦理准则（编号13364819.0.0000.5558），样本以代码标识以确保供体匿名。细胞来源于18至35岁、签署知情同意书且符合以下纳入标准的健康男性供体：非吸烟者/非电子烟使用者，无慢性健康疾病，且在过去14天内无炎症性疾病史。
1. 血液采集
- 无菌操作，将 0.3 mL 浓度为 5,000 IU/mL 的肝素（参见 材料表）加入无菌 20 mL 注射器中，以肝素化该注射器。
- 在穿刺部位上方约 10 cm 处绑扎静脉压脉带，并定位肘正中静脉或头静脉以进行静脉穿刺。
注意：确保压脉带总使用时间不超过 1 分钟。 - 用 70% 酒精清洁穿刺部位，然后进行静脉穿刺。
- 采血后，轻柔地将注射器倒置 3 至 4 次，使血液与肝素充分混匀。
2. 中性粒细胞分离
注：多形核白细胞（PMNs）通过密度梯度离心法分离，随后对残留的红细胞（RBC）进行低渗裂解，方法如前所述11 有所改变。该方法并非进行筛选实验的强制要求，只要所选方法能达到相应的存活率，即可替代使用。 >97%，引发....
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结果
本研究中采用的基于密度的分离方法（图1）符合所设计实验的要求。通过该方法获得的中性粒细胞参数包括：活力≥98%，纯度≥94%，细胞得率≥1.5 × 107，且通过筛查试验未检测到明显激活。中性粒细胞分离过程中的两个关键步骤是抗凝和红细胞去除。在密度梯度层析前，将抗凝血液样本置于轻柔摇动的环境中，并选择可同时防止细胞激活和污染的红细胞去除方法，均可影响实验的得率和可重复性。
为了评估中性粒细胞功能的整体功能概况，建立了一种实验流程，使得至少两名研究人员可在约4 h内完成建议的筛选实验，其中包括1 h的激活时间和2 h的实时迁移监测，如图2所示。
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讨论
中性粒细胞是高度动态且反应迅速的细胞，寿命较短，目前尚无法冻存19，这使得对其生物学特性的研究具有挑战性。因此，必须严格遵循操作步骤，以获得存活率高、富集度高且处于静息状态的中性粒细胞11,20。本研究采用基于密度的分离技术，强调操作轻柔、步骤最少，并在激活前全程保持低温环境。此外，血液样本需在静脉穿刺后30分钟内开始处理，并在室温下保存。本研究提供了一种可减少操作应激和实验时间的方案。为进一步简化流程，我们在原有方案中引入了一个新的可选步骤，即在单次溶血处理后，通过轻柔重悬并吸除红细胞层来去除红细胞。该步骤仅需一次低渗溶血即可去除大部分红细胞，从而减少操作应激和实验时间。然而需要注意的是，该步骤的效果在很大程度上依赖于操作者的技能，可能无法完全清除红细胞。此外，吸除红细胞时可能导致部分中性粒细胞丢失，但这并不影响最终得率，因为在梯度离心中靠近红细胞层收集时初始回收的中性粒细胞数量更多。因此，若实验不要求最高纯度，或操作者具备稳定良好的操作经验，建议采用红细胞吸除步骤。对于.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢以下资助机构：FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP 和 FINATEC。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar 酶标仪 | BMG LABTECH | 美国专利号 9,733,124 产品详情：MARS 数据分析软件 | |
| 二甲基亚砜 | Dinâmica | 1582 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| 快速全染染色液 | Laborclin | 620529 | |
| 载玻片 | Exacta | 7102 | |
| 含钙、含镁、不含酚红的 Hank’s 平衡盐溶液 | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| 不含氯化钙、硫酸镁和碳酸氢钠的 Hank’s 平衡盐溶液 | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| 肝素 | Blau | 7896014655229 | |
| 层流柜 | Veco | VLFS-12 | |
| 显微镜 | Zeiss | 415501-0101-002 | 产品详情：Primostar 1 |
| 混匀模块 | BIOER | MB-102 | |
| 改进型血球计数板（亮线型） | New Optik | 1110000 | |
| N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| 氮蓝四唑 | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | 分离介质 |
| 佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯 | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| 沙黄 | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Cytiva | 17-1313-01 | |
| 超声波破碎仪 | Qsonica | Q125 | |
| 台盼蓝溶液 | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence 实时细胞分析系统（RTCA DP，双用途） | Agilent | 380601050 | 产品详情：RTCA 系统由检测硬件、细胞培养板和软件组成 |
参考文献
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020). <....
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