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方法文章

一套用于快速评估中性粒细胞功能的筛选技术

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DOI：

10.3791/65329

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2024年2月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

本文内容

摘要

本方案包含一系列中性粒细胞功能检测方法，可作为筛选手段，用于评估不同信号通路相关的功能。该方案包括细胞活力、纯度、活性氧生成、实时迁移、吞噬作用的初步且简单的评估，以及对中性粒细胞胞外诱捕网的初步分析建议。

摘要

中性粒细胞是先天免疫反应中已知的第一道防线之一，能够执行多种特定的细胞功能，例如趋化作用、逆行迁移、吞噬作用、脱颗粒释放细胞毒性酶和代谢产物，以及释放DNA形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。中性粒细胞不仅自身具有严密调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分。由于新鲜分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短，且个体间差异较大，因此充分高效地利用所获取的样本至关重要。研究人员通常需要进行筛选实验，以全面评估在特定实验条件下可能受到影响的多种中性粒细胞功能。为此，本研究建立了一套在单次正常密度中性粒细胞分离后即可连续开展的检测组合，旨在兼顾速度、全面性、成本与准确性之间的平衡。所得结果可用于推断并指导后续深入研究。该流程平均耗时约4小时，包括细胞活力检测、活性氧（ROS）生成测定、实时迁移分析以及在玻片上进行的酵母吞噬实验，同时保留足够数量的细胞用于后续更深入的组学研究。此外，该流程还包括一种简便方法：通过快速全染染色后在光学显微镜下观察，初步判断是否存在NETs形成，尽管缺乏特异性标记物，但足以提示是否值得在该方向上投入进一步研究。多种功能检测之间共享部分实验环节，从而减少了总体分析时间和成本。该流程被命名为NeutroFun Screen，尽管存在 局限性，但较好地平衡了上述各项因素。此外，本研究的目的并非提供一套固定不变的检测方案，而是提供一种可依据各实验室资源与需求灵活调整的操作指南。

引言

中性粒细胞是人体血液中最丰富的先天免疫细胞，已知在感染和炎症过程中发挥重要作用，是组织损伤部位最先到达的反应细胞1。近年来，人们日益认识到中性粒细胞在多种疾病以及维持机体稳态中所起的关键作用2。中性粒细胞不仅自身具有严格调控的信号通路，还参与调节免疫系统的其他组分3,4,5。因此，在许多研究背景下，探究中性粒细胞及其多种非典型细胞功能——如趋化性、逆向迁移6、吞噬作用7、呼吸爆发8以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的释放7——至关重要，尤其是在需要评估特定分析条件下所引发的中性粒细胞功能、形态或分子变化潜力的研究中。

新分离的中性粒细胞为终末分化细胞，寿命短、高度动态且易于活化9。然而，目前尚未建立一种不影响中性粒细胞功能反应的高效保存方法，这使得需要连续进行的多项检测难以实施。此外，以往描述的功能分析方法10,11依赖于流式细胞术和/或荧光染色技术，在需要对中性粒细胞进行广泛而初步评估时，可能并非可行的选择。

为解决这些问题，本方案描述了一套可在单次分离过程后进行的检测，包括细胞活力评估、活性氧（ROS）生成、实时迁移以及对Saccharomyces cerevisiae的吞噬作用检测，其结果可用于深入推导后续研究。该方法命名为NeutroFun Screen，旨在涵盖除脱颗粒以外的主要效应功能，整个流程平均耗时4小时，其中包括1小时的激活时间。此外，剩余细胞还可用于更深入的组学研究等进一步分析。该方法的优势在于在速度、全面性、成本和准确性之间实现了良好平衡。

此外，还有一种方法可以在没有特异性标记物的情况下，简便地观察到中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的初步迹象，虽不足以确证，但足以判断是否值得在此方向上进一步深入研究。所测试的多种功能旨在整合不同检测方法之间的共性，从而缩短分析时间并降低成本。该方法的主要目标是提供一种在速度、全面性、成本和准确性之间达到平衡的功能性分析手段，以概览中性粒细胞的反应情况，因此可作为研究新型刺激物对正常密度中性粒细胞作用的有用初始步骤。

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方案

所有实验均严格遵循巴西利亚大学机构审查委员会制定的伦理准则（编号13364819.0.0000.5558），样本以代码标识以确保供体匿名。细胞来源于18至35岁、签署知情同意书且符合以下纳入标准的健康男性供体：非吸烟者/非电子烟使用者，无慢性健康疾病，且在过去14天内无炎症性疾病史。

1. 血液采集

  1. 无菌操作，将 0.3 mL 浓度为 5,000 IU/mL 的肝素（参见 材料表）加入无菌 20 mL 注射器中，以肝素化该注射器。
  2. 在穿刺部位上方约 10 cm 处绑扎静脉压脉带，并定位肘正中静脉或头静脉以进行静脉穿刺。
    注意：确保压脉带总使用时间不超过 1 分钟。
  3. 用 70% 酒精清洁穿刺部位，然后进行静脉穿刺。
  4. 采血后，轻柔地将注射器倒置 3 至 4 次，使血液与肝素充分混匀。

2. 中性粒细胞分离

注：多形核白细胞（PMNs）通过密度梯度离心法分离，随后对残留的红细胞（RBC）进行低渗裂解，方法如前所述11 有所改变。该方法并非进行筛选实验的强制要求，只要所选方法能达到相应的存活率，即可替代使用。 >97%，引发或激活 <3% 的中性粒细胞，并能获得足够的细胞数量用于所有检测、重复实验及不同实验条件。必须在无菌条件下操作，并使用无内毒素溶液，以避免细胞活化。

  1. 配制12 mL的60%和70%分离介质稀释液（ commercially available；参见 材料表) 置于50 mL锥形管中。
  2. 从底部到顶部逐层制备梯度，使用5 mL移液器每次加入4 mL的60%稀释液覆盖在70%稀释液之上。操作应轻柔，避免混合两层界面。
  3. 将12 mL抗凝血液小心地加至密度梯度液上方。以200 x g离心 g 室温下孵育15分钟。
    注意：从这一步开始，直到中性粒细胞激活为止，所有使用的试剂和试管都必须置于装有冰块的冷藏容器中保存。
  4. 弃去血浆/单个核细胞层，然后轻柔地将红细胞沉淀物上方的液体层转移至两支15 mL圆锥形离心管中，每管约7.5 mL。用Hank's平衡盐溶液（HBSS；参见 材料清单).
  5. 300 x g 离心 g 5 分钟 19 °C.
  6. 用HBSS洗涤细胞沉淀。
    1. 弃去上清液，将管子倾倒，然后在 7 mL HBSS 中轻轻重悬沉淀。
    2. 300 x g 离心 g 5 分钟 19 °C 去除所有分离介质。
  7. 对剩余的红细胞进行低渗裂解。
    1. 弃去上清液，并将沉淀物合并至同一离心管中。
    2. 将红细胞/中性粒细胞沉淀重悬于 3 mL 无菌 H2O，并在25秒内加入3 mL HBSS（2倍浓度）以恢复渗透压。随后，以300 x g 5 分钟 19 °C.
    3. 重复步骤 2.8.1 和 2.8.2，直至获得白色、无红细胞的沉淀。
      注意：必须尽快移除上清液，以尽量减少中性粒细胞与红细胞裂解产物的接触。或者，可将第二次低渗裂解步骤替换为轻轻重悬残留的红细胞层并完全移除上清液，因为残留的红细胞将沉积在中性粒细胞沉淀物上方。
  8. 弃去上清液，将试管中的液体轻轻倒出，用剩余的缓冲液轻柔重悬中性粒细胞，并转移至预冷的微量离心管中。
    注意：使用移液器转移重悬细胞时，务必标注体积。
  9. 转移 3 × 1 µL 将细胞悬液转移至洁净的玻璃载玻片上（三个孔） 1 µL 每个）并用快速全染法染色（参见 材料清单用于形态学和纯度评估12.
    1. 使用快速泛染法染色时，将玻片浸入泛染固定液中五次° 1，六次在伊红中° 2，以及苏木精中染色两次° 3次，每次浸入持续1秒。
    2. 用蒸馏水轻轻清洗载玻片。
    3. 静置沥干并风干。
  10. 在显微镜下观察，对每个孔中随机选取的300个细胞进行计数，从而区分中性粒细胞与其他粒细胞。
  11. 转移 1 µL 细胞悬液的 49 µL 0.2% 台盼蓝染料13 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并区分死细胞与活细胞。
  12. 调整细胞浓度至 6,667 个细胞/μLµL 使用含钙和镁的50%自体血浆与50% HBSS混合溶液。将6,667个细胞/µL 将悬液均匀分配至对应待测条件（包括阴性对照）的微量离心管中。
    注意：可使用与模式生物中循环中性粒细胞浓度相近的任何细胞浓度，但为保证实验可重复性，所有实验中必须使用相同的细胞浓度。

Percoll 密度梯度；离心示意图；红细胞裂解；中性粒细胞分离；细胞分离方法。
图 1：中性粒细胞分离流程图。 将两种浓度的分离介质（Percoll）(A) 进行叠加 (B)，然后将血液样本加在分离梯度的上方 (C)。离心后，中性粒细胞位于中间层 (D)，将该层分为两个 15 mL 离心管 (E)。细胞悬液用 HBSS 洗涤两次并离心 (G–I) 以去除介质，然后重悬细胞，并对残留的红细胞进行两轮低渗裂解处理 (J–M)。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 中性粒细胞活化的准备

  1. 在1.5 mL离心管中，为每种条件配制激活体系，使最终细胞浓度为6,600个细胞/µL。例如，为检测100 nM fMLP（N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸；参见材料表）的作用，向495 µL浓度为6,667个细胞/µL的细胞悬液中加入5 µL的10 µM fMLP。对于阴性（未刺激）对照组，加入含Ca2+和Mg2+的HBSS。
    注意：为演示本方法，以下刺激物的终浓度分别为：100 nM fMLP、16 µM fallaxin（一种天然存在的抗菌肽14）以及100 nM PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯）（参见材料表）。
  2. 在37 °C下静置孵育，不旋转。
    ​注意：所有功能检测所用的样品均取自该细胞悬液，后文将此悬液称为激活体系。

4. 用于评估活性氧产生的氯化硝基四氮唑蓝（NBT）检测

  1. 制备 NBT 工作液：针对每个实验条件，按照以下步骤制备 6 mM 的 NBT（参见材料表）工作液：
    1. 将 0.0005 g NBT 溶解于 10 µL 二甲基亚砜（DMSO）中，涡旋混匀至少 15 分钟。
    2. 加入 90 µL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 溶液，涡旋混匀最多 2 分钟。
      注意：所有涉及 NBT 的操作均需在避光条件下进行。
  2. 进行 NBT 载玻片检测。
    1. 细胞活化 20 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，并小心转移 2 µL PMN 至洁净的载玻片上。在 37 °C 的湿化孵育盒中孵育 20 分钟。
      注意：不要将细胞悬液在载玻片上涂布过广，否则可能在孵育前干燥。
    2. 在细胞上加入 1 µL NBT 工作液，继续在避光条件下孵育 20 分钟。
    3. 用热风干燥载玻片，并在每个区域滴加一滴甲醇固定 1 分钟。随后用 0.03% 番红溶液（参见材料表）染色 1 分钟。
    4. 用蒸馏水轻轻冲洗载玻片。
    5. 让载玻片自然晾干，并在显微镜下观察。
    6. 在每个区域随机计数 100 个细胞，区分含有和不含甲臜沉积物的中性粒细胞。
  3. 进行 NBT 分光光度法检测。
    1. 细胞活化 40 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，将 90 µL PMN 从活化体系转移至洁净的微量离心管中。然后，小心加入 20 µL 6 mM NBT 溶液。在 37 °C 避光孵育 20 分钟。
    2. 加入 100 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS；参见材料表）溶液，并涡旋混匀。
    3. 使用探头式超声仪，以 60% 振幅进行超声处理，共五个循环，每个循环 15 秒，间隔 15 秒。随后在 12,000 x g 离心 5 分钟。
    4. 将 60 µL 上清液转移至透明底 96 孔板中，在 570 nm 波长处测定甲臜产物的吸光度。

5. 吞噬作用检测

  1. 制备 33,000 酵母/μL 的细胞悬液µL 每种条件下分别制备悬液，具体步骤如下：
    1. 加入约 0.75 mg 干酵母 （酿酒酵母）；参见 材料清单) 至 200 µL HBSS Ca2+Mg2+ 并在恒温混匀仪中孵育 100 °C 以500 rpm转速离心至少15分钟。
    2. 通过涡旋振荡使混合物充分匀浆，然后转移 5 µL 酵母悬液的量至 45 µL 用0.2%台盼蓝染液染色。使用血细胞计数板对酵母细胞进行计数。
    3. 将初始悬液的浓度调整至 33,000 个酵母细胞/μLµL 使用 HBSS Ca2+Mg2+将悬液置于冰上保存，直至使用。
  2. 细胞活化20分钟后，轻轻混匀细胞悬液并转移 5 µL 激活系统的作用 5 µL 33,000 酵母/µL 酿酒酵母 在新的无菌微量离心管中重悬。
    注意：中性粒细胞与酵母的比例为 1:5（PMN:酵母）。
  3. 立即转移 6 µL 将PMN/酵母悬液分别加入洁净载玻片的三个孔中（2 µL 每个样本）并在湿盒中孵育40分钟。
    注意：不要将细胞悬液在载玻片上铺展过多，否则可能在孵育前干燥。
  4. 在热空气中干燥载玻片，并按照上述步骤2.9所述，用快速泛影染色法染色。
    注意：快速全视野染色的第三步对玻片的显微镜分析至关重要。此步骤染色时间 ≥3 秒会导致玻片难以区分酵母与中性粒细胞核叶，从而无法用于分析。
  5. 在显微镜下观察玻片，每孔随机计数100个中性粒细胞，并区分吞噬阳性与阴性的中性粒细胞（PMNs）。
    注意：若至少有一个酵母颗粒位于中性粒细胞膜内或直接与膜接触，则判定该中性粒细胞为吞噬阳性。如需分析酵母/中性粒细胞比例，应同时计数被吞噬的酵母颗粒数量。

6. 中性粒细胞实时趋化迁移实验

注意：迁移实验的操作方法与先前描述的方案15相似，但需进行以下调整：

  1. 通过向基于阻抗的实时细胞分析仪（RTCA）板的下室中加入 160 µL 趋化因子（例如 fMLP、IL-8、C5 或 LTB4；参见 材料表）来制备趋化梯度。对于阴性对照和空白对照，加入 160 µL HBSS Ca2+Mg2+。
  2. 安装上室，并加入 25 µL HBSS Ca2+Mg2+。室温孵育至少 1 小时，以形成趋化梯度。
  3. 细胞活化 60 分钟后，轻轻混匀细胞悬液，并将 60 µL 细胞悬液加入上室。向空白孔中加入 60 µL HBSS Ca2+Mg2+。
  4. 将 RTCA 板放入仪器，并设置 RTCA 软件每 60 秒测量一次细胞指数（CI），持续 2 小时。
    ​注意：RTCA 板可按照先前描述的方法清洗后重复使用16。简言之，先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 RTCA 室和电极三次，再用 I 型超纯水清洗两次。然后在上下室中加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.53 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）孵育 40 分钟，最后用超纯水清洗三次。

7. NET 诱导实验

  1. 细胞激活10分钟后，轻轻混匀细胞悬液，将每种待评估激活体系中的中性粒细胞（PMNs）各取4 µL，分别加入洁净玻片的两个孔中。于37 °C湿盒中孵育30分钟。
  2. 向其中一个孔中加入1 µL的DNAse I，并在湿盒中37 °C孵育20分钟。
  3. 将玻片干燥后，按“中性粒细胞分离”部分步骤2.9中所述方法，用快速全景染色法进行染色。
  4. 在显微镜下观察玻片。
    注意：观察是否有中性粒细胞胞外诱捕网（NET）释放的迹象，其特征为网状结构的存在。一旦发现，需确认DNAse I处理是否能够消除此类结构。本实验仅提示可能存在NET形成，尚需进一步检测以确认其存在。

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结果

本研究中采用的基于密度的分离方法（图1）符合所设计实验的要求。通过该方法获得的中性粒细胞参数包括：活力≥98%，纯度≥94%，细胞得率≥1.5 × 107，且通过筛查试验未检测到明显激活。中性粒细胞分离过程中的两个关键步骤是抗凝和红细胞去除。在密度梯度层析前，将抗凝血液样本置于轻柔摇动的环境中，并选择可同时防止细胞激活和污染的红细胞去除方法，均可影响实验的得率和可重复性。

为了评估中性粒细胞功能的整体功能概况，建立了一种实验流程，使得至少两名研究人员可在约4 h内完成建议的筛选实验，其中包括1 h的激活时间和2 h的实时迁移监测，如图2所示。

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讨论

中性粒细胞是高度动态且反应迅速的细胞，寿命较短，目前尚无法冻存19，这使得对其生物学特性的研究具有挑战性。因此，必须严格遵循操作步骤，以获得存活率高、富集度高且处于静息状态的中性粒细胞11,20。本研究采用基于密度的分离技术，强调操作轻柔、步骤最少，并在激活前全程保持低温环境。此外，血液样本需在静脉穿刺后30分钟内开始处理，并在室温下保存。本研究提供了一种可减少操作应激和实验时间的方案。为进一步简化流程，我们在原有方案中引入了一个新的可选步骤，即在单次溶血处理后，通过轻柔重悬并吸除红细胞层来去除红细胞。该步骤仅需一次低渗溶血即可去除大部分红细胞，从而减少操作应激和实验时间。然而需要注意的是，该步骤的效果在很大程度上依赖于操作者的技能，可能无法完全清除红细胞。此外，吸除红细胞时可能导致部分中性粒细胞丢失，但这并不影响最终得率，因为在梯度离心中靠近红细胞层收集时初始回收的中性粒细胞数量更多。因此，若实验不要求最高纯度，或操作者具备稳定良好的操作经验，建议采用红细胞吸除步骤。对于...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢以下资助机构：FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP 和 FINATEC。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CIM-Plate 16Agilent 5665825001
CLARIOstar 酶标仪 BMG LABTECH美国专利号 9,733,124
产品详情：MARS 数据分析软件
二甲基亚砜Dinâmica1582
脱氧核糖核酸酶 ISigma - AldrichDN 25
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Sigma - AldrichE5134
快速全染染色液Laborclin620529
载玻片Exacta7102
含钙、含镁、不含酚红的 Hank’s 平衡盐溶液Sigma - Aldrich55037C
不含氯化钙、硫酸镁和碳酸氢钠的 Hank’s 平衡盐溶液Sigma - AldrichH4641
肝素Blau 7896014655229
层流柜VecoVLFS-12
显微镜Zeiss415501-0101-002产品详情：Primostar 1
混匀模块BIOERMB-102
改进型血球计数板（亮线型）New Optik1110000
N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸Sigma - AldrichF3506
氮蓝四唑NeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101分离介质
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯Sigma - AldrichP8139
磷酸盐缓冲液片剂Sigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
沙黄Sigma - Aldrich50240
十二烷基硫酸钠Cytiva17-1313-01
超声波破碎仪QsonicaQ125
台盼蓝溶液VetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence 实时细胞分析系统（RTCA DP，双用途）Agilent 380601050产品详情：RTCA 系统由检测硬件、细胞培养板和软件组成

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