建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

摘要

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。

摘要

中枢神经系统（CNS）模型必须重现所存在的复杂互联细胞网络 体内 中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成。随着减少和替代动物使用的努力不断加强，已开发出多种 体外 已开发出细胞培养系统以研究细胞的固有特性，从而推动针对中枢神经系统（CNS）感染和疾病治疗策略的发展。尽管某些研究问题可通过基于人类细胞的培养系统（如诱导性多能干细胞）来解决，但人源细胞在可获得性、成本和伦理方面仍存在局限性。本文介绍一种从胚胎小鼠脑组织中分离和培养细胞的独特方案。所获得的混合神经细胞培养物可模拟大脑中存在的多种细胞群体及其相互作用。 体内与现有的类似方法相比，该方案更能模拟大脑的特性，且可获得更多的细胞，从而能够从一只怀孕小鼠中开展更多实验条件的探究。此外，该方案操作相对简便，且具有高度可重复性。这些培养体系已针对多种实验规模进行了优化，可用于基于96孔板的高通量筛选、24孔板的显微镜分析，以及用于流式细胞术和逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析的6孔板培养。该培养方法是一种强有力的工具，可在兼具中枢神经系统（CNS）部分复杂性的同时，以其操作便利性来研究感染与免疫过程 体外 方法

引言

加深对中枢神经系统（CNS）的理解，对于改善多种神经炎症性和神经退行性疾病治疗方案至关重要。中枢神经系统由大脑、脊髓和视神经中相互连接的复杂细胞网络构成，主要包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞以及其固有免疫细胞——小胶质细胞¹。体外（in vitro）研究方法通常可显著减少开展有意义研究所需使用的小鼠数量；然而，由于中枢神经系统的复杂性，仅依靠细胞系无法重现体内（in vivo）的真实情况。混合神经细胞培养体系为研究神经（免疫）学问题提供了一个高度有价值的实验模型，符合“替代、减少、优化”（3Rs）原则^2,3。

Thomson 等人描述了一种使用产前脊髓细胞的细胞培养方法，这些细胞可分化为上述所有主要的中枢神经系统细胞类型⁴。该体系还具有突触形成、有髓鞘的轴突以及郎飞结。这种培养方法的主要局限性在于，由于来源于脊髓，无法有效模拟大脑，且从胚胎第13天（E13）脊髓中获得的细胞数量有限。因此，这限制了可研究的实验条件数量。本研究旨在开发一种新的细胞培养体系，以重现大脑的特征，并提高细胞产量，从而减少对实验动物的需求。

以Thomson等人的研究为基础，我们开发了一种完全来源....

方案

所有动物实验均符合当地关于动物使用的法律法规，并经格拉斯哥大学本地伦理审查委员会批准。动物饲养于特定病原体阴性环境中，符合英国《1986年动物科学程序法》的要求，并在英国内政部项目许可证的授权下进行。本研究使用实验室自繁的成年C57BL/6J小鼠。建议使用年轻雌性小鼠（8–12周龄），因其妊娠成功率较高；雄性小鼠可多次用于繁殖。图1展示了用于制备混合神经元和胶质细胞培养物的方法示意图。

1. 组织培养耗材的准备

1. 在 II 级生物安全柜内准备含有显微镜盖玻片的培养板和/或培养皿。对所有试剂进行灭菌或高压灭菌，以确保培养期间的无菌状态。
2. 向每个孔中加入适量体积的 BA-PLL（13.2 µg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴化物 [PLL] 溶于硼酸缓冲液 [BA] [50 mM 硼酸，12.5 mM 四硼酸钠，pH 8.5]；参见材料表）（6 孔板每孔 1,000 µL，96 孔板每孔 100 µL；体积详见表 1）。对于含有显微镜盖玻片的 9 cm 直径组织培养皿，加入 20 mL BA-PLL，并轻轻旋转使溶液均匀分布。
3. 在 37 °C 下孵育 1–2 小时。
4. 从每个孔或含有显微镜盖玻片的培养皿中移除 BA-PLL 溶液，加入 20 mL ....

结果

显微镜检查
在玻璃盖玻片上培养的细胞适用于显微镜分析。为了观察细胞培养物的发育过程，从DIV0（细胞贴壁后）至DIV28的多个时间点，用4%多聚甲醛（PFA）固定盖玻片上的细胞。细胞染色用于免疫荧光成像，方法如前所述⁵，采用三种不同的染色组合：NG2（未成熟少突胶质细胞）和nestin（神经干细胞/前体细胞）作为发育标志物，SMI31（轴突）、MBP（髓鞘）和NeuN（神经元胞体）作为神经元标志物，或CNP（少突胶质细胞）、GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）作为胶质细胞标志物（图2）。

使用 CellProfiler 流程（基于 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1））对各类细胞进行定量。每个独立数据点均来自每个时间点三个盖玻片上平均10张图像的统计结果。对于小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，计算其占4′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（DAPI+）细.......

讨论

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的网络，从大脑延伸至脊髓，包含多种细胞类型，主要是神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞¹。由于每种细胞在维持中枢神经系统稳态以及对各种刺激产生适当反应中均发挥重要作用^9,10,11，因此包含所有这些细胞类型的培养系统是研究大脑如何应对刺激的一种有用且多功能的工具。在体外（in vitro）环境中研究这些细胞及其相互作用的能力，使得大量技术可被灵活应用于解决多种实验问题。我们概述了一种快速高效的方法，用于从小鼠产前脑组织中分离并培养主要的中枢神经系统细胞类型，该方法可模拟成年小鼠脑中的各个细胞群体¹²。

既往建立的中枢神经系统（CNS）培养方案使用E13.5时期的脊髓组织^4,<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 胰蛋白酶	Sigma	T4549-100ML	用于组织消化
140 mm 组织培养皿	Fisher	11339283	每1个140 mm培养皿中放置8个35 mm培养皿
15 mL Falcon 管	Sarstedt	62554502	用于收集细胞形成沉淀，以便重悬于铺板培养基中
18 G 针头	Henke Sass Wolf	4710012040	用于样品吹打
21 G 针头	BD	304432	用于样品吹打
23 G 针头	Henke Sass Wolf	4710006030	用于样品吹打
35 mm 组织培养皿	Corning	430165	每1个35 mm培养皿中铺3个PLL包被的盖玻片
5 mL 注射器	Fisher	15869152	用于样品吹打
6 孔板	Corning	3516	用于细胞铺板，进行RT-qPCR和流式细胞术
7 mL Bijoux 管	Fisher	DIS080010R	用于放置脑组织
96 孔板	Corning	3596	用于高通量检测的细胞铺板
ACSA-2 抗体，抗小鼠，PE标记	Miltenyi	130-123-284	用于星形胶质细胞的流式细胞术染色
弯头镊子	Dumont	0108-5/45-PO	用于解剖
生物素	Sigma	B4501	用于DM+/-培养基
硼酸	Sigma	B6768-500G	用于配制硼酸缓冲液
Brilliant Violet 421 标记抗小鼠CD24抗体，克隆M1-69	Biolegend	101825	用于神经元和星形胶质细胞的流式细胞术染色
Brilliant Violet 605 标记抗小鼠CD45抗体，克隆30-F11	Biolegend	103139	用于小胶质细胞的流式细胞术染色
Brilliant Violet 785 标记抗小鼠/人CD11b抗体，克隆M1/70	Biolegend	101243	用于小胶质细胞的流式细胞术染色
BSA 第V组分	Sigma	A3059-10G	用于SD抑制剂
CNP	Abcam	AB6319	成熟少突胶质细胞标记物
盖玻片	VWR	631-0149	用于显微镜观察的细胞铺板
解剖剪刀	Sigma	S3146-1EA	用于解剖
DMEM 高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺	Gibco	21969-035	用于DM+/-培养基及铺板培养基
DNase I	Thermofisher	18047019	用于SD抑制剂，可使用此产品或Sigma的另一种DNase
DNase I	Sigma	D4263	用于SD抑制剂，可使用此产品或Thermofisher的另一种DNase
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	活/死细胞染色
精细镊子	Dumont	0102-SS135-PO	用于解剖
GFAP	Invitrogen	13-0300	星形胶质细胞标记物
含钙镁的HBSS	Sigma	H9269-500ML	用于铺板培养基
不含钙镁的HBSS	Sigma	H9394-500ML	用于盛放脑组织
马血清	Gibco	26050-070	用于铺板培养基
氢化可的松	Sigma	H0396	用于DM+/-培养基
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	小胶质细胞标记物
胰岛素	Sigma	I1882	用于DM+培养基
Leibovitz L-15 培养基	Gibco	11415-049	用于SD抑制剂
MBP	Bio-Rad	MCA409S	髓鞘标记物
小鼠CCL5/RANTES DuoSet ELISA试剂盒	BioTechne	DY478-05	用于定量96孔板上清液中CCL5浓度的ELISA试剂盒
N1 培养基添加剂	Sigma	N6530-5ML	用于DM+/-培养基
Nestin	Merck	MAB353	神经干细胞/前体细胞标记物
NeuN	Thermofisher	PA578499	神经元胞体标记物
NG2	Sigma	AB5320	未成熟少突胶质细胞标记物
O4 抗体，抗人/小鼠/大鼠，APC标记	Miltenyi	130-119-155	用于少突胶质细胞的流式细胞术染色
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	Sigma	P0781-100ML	用于DM+/-培养基及铺板培养基
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P1274	用于配制硼酸/聚-L-赖氨酸溶液以包被盖玻片
SMI31	BioLegend	801601	轴突标记物
四硼酸钠	Sigma	221732-100G	用于配制硼酸缓冲液
Trizol	Thermofisher	15596026	用于细胞裂解以进行RT-qPCR
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T9003-100MG	用于SD抑制剂