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方法文章

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

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DOI：

10.3791/65331

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2023年6月30日

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1School of Infection and Immunity, University of Glasgow, 2Faculty of Science and Technology, Institute of Technology, University of Tartu

本文内容

摘要

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。

摘要

中枢神经系统（CNS）模型必须重现所存在的复杂互联细胞网络 体内 中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成。随着减少和替代动物使用的努力不断加强，已开发出多种 体外 已开发出细胞培养系统以研究细胞的固有特性，从而推动针对中枢神经系统（CNS）感染和疾病治疗策略的发展。尽管某些研究问题可通过基于人类细胞的培养系统（如诱导性多能干细胞）来解决，但人源细胞在可获得性、成本和伦理方面仍存在局限性。本文介绍一种从胚胎小鼠脑组织中分离和培养细胞的独特方案。所获得的混合神经细胞培养物可模拟大脑中存在的多种细胞群体及其相互作用。 体内与现有的类似方法相比，该方案更能模拟大脑的特性，且可获得更多的细胞，从而能够从一只怀孕小鼠中开展更多实验条件的探究。此外，该方案操作相对简便，且具有高度可重复性。这些培养体系已针对多种实验规模进行了优化，可用于基于96孔板的高通量筛选、24孔板的显微镜分析，以及用于流式细胞术和逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析的6孔板培养。该培养方法是一种强有力的工具，可在兼具中枢神经系统（CNS）部分复杂性的同时，以其操作便利性来研究感染与免疫过程 体外 方法

引言

加深对中枢神经系统（CNS）的理解，对于改善多种神经炎症性和神经退行性疾病治疗方案至关重要。中枢神经系统由大脑、脊髓和视神经中相互连接的复杂细胞网络构成，主要包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞以及其固有免疫细胞——小胶质细胞1。体外（in vitro）研究方法通常可显著减少开展有意义研究所需使用的小鼠数量；然而，由于中枢神经系统的复杂性，仅依靠细胞系无法重现体内（in vivo）的真实情况。混合神经细胞培养体系为研究神经（免疫）学问题提供了一个高度有价值的实验模型，符合“替代、减少、优化”（3Rs）原则2,3。

Thomson 等人描述了一种使用产前脊髓细胞的细胞培养方法，这些细胞可分化为上述所有主要的中枢神经系统细胞类型4。该体系还具有突触形成、有髓鞘的轴突以及郎飞结。这种培养方法的主要局限性在于，由于来源于脊髓，无法有效模拟大脑，且从胚胎第13天（E13）脊髓中获得的细胞数量有限。因此，这限制了可研究的实验条件数量。本研究旨在开发一种新的细胞培养体系，以重现大脑的特征，并提高细胞产量，从而减少对实验动物的需求。

以Thomson等人的研究为基础，我们开发了一种完全来源于孕鼠脑组织的细胞培养模型。这些培养物具有与脊髓培养物相同的细胞群体、相互连接性及处理方式，但相比之下髓鞘化程度较低。然而，拥有一个中枢神经系统（CNS） 体外 细胞产量约为三倍的模型效率更高，所需小鼠数量更少，胚胎处理时间也更短。我们针对多种下游应用和不同规模优化了这一独特的培养体系，包括使用玻璃盖玻片进行显微镜分析，以及各种规格的塑料孔板，如适用于高通量研究的96孔板。

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方案

所有动物实验均符合当地关于动物使用的法律法规，并经格拉斯哥大学本地伦理审查委员会批准。动物饲养于特定病原体阴性环境中，符合英国《1986年动物科学程序法》的要求，并在英国内政部项目许可证的授权下进行。本研究使用实验室自繁的成年C57BL/6J小鼠。建议使用年轻雌性小鼠（8–12周龄），因其妊娠成功率较高；雄性小鼠可多次用于繁殖。图1展示了用于制备混合神经元和胶质细胞培养物的方法示意图。

1. 组织培养耗材的准备

  1. 在 II 级生物安全柜内准备含有显微镜盖玻片的培养板和/或培养皿。对所有试剂进行灭菌或高压灭菌，以确保培养期间的无菌状态。
  2. 向每个孔中加入适量体积的 BA-PLL（13.2 µg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴化物 [PLL] 溶于硼酸缓冲液 [BA] [50 mM 硼酸，12.5 mM 四硼酸钠，pH 8.5]；参见材料表）（6 孔板每孔 1,000 µL，96 孔板每孔 100 µL；体积详见表 1）。对于含有显微镜盖玻片的 9 cm 直径组织培养皿，加入 20 mL BA-PLL，并轻轻旋转使溶液均匀分布。
  3. 在 37 °C 下孵育 1–2 小时。
  4. 从每个孔或含有显微镜盖玻片的培养皿中移除 BA-PLL 溶液，加入 20 mL 无菌水进行洗涤，轻轻旋转盖玻片后吸去水分。重复此洗涤步骤三次。对于含有盖玻片的培养皿，在最后一次洗涤时保留无菌水，以便于后续取出盖玻片。
  5. 用无菌移液器尽可能吸尽液体，并干燥至少 2 小时至 过夜。
  6. 将包被好的培养板在 4 °C 下保存，最长可保存 2 个月。
    注意：制备好的含聚-L-赖氨酸的硼酸溶液（BA-PLL）最多可重复使用三次，每次需补充新的 PLL。将 BA-PLL 储存于 4 °C。培养皿需用 BA-PLL 处理，因为 PLL 可使细胞贴附并生长。若不进行此处理，细胞在培养约 1 周后会脱落，无法继续分化。

2. E17 胚胎脑的解剖

  1. 将一只或多只雌鼠与一只雄鼠共同饲养。每天检查雌鼠是否有黏液栓，以确认是否已交配。
    注意：任何 "堵塞的" 雌性小鼠需要与雄性小鼠分离，以确保妊娠起始日期准确。可通过称重或肉眼观察来确认是否怀孕。
  2. 在符合当地动物福利指导原则和法律的前提下，使用适当方法于E17阶段处死怀孕小鼠，例如通过升高二氧化碳（CO₂）浓度2浓度、致死性麻醉过量或颈部脱臼。
    注意：所选方法不得对胚胎造成干扰。本研究中，通过逐渐增加二氧化碳气体浓度对怀孕母体实施安乐死，并通过切断股动脉确认死亡。
  3. 将处死后的怀孕小鼠仰卧置于解剖板上；虽然无需固定，但对于经验不足的研究人员而言，固定可能更便于操作。用镊子夹住腹部中线处皮肤，使用尖头剪刀沿中线从外生殖器向肋骨处剪开皮肤和腹膜，注意避免刺破子宫。
    1. 小鼠子宫具有两个角，每个角通常含有1至5个胚胎。将带有胚胎的子宫从母鼠体内取出，并立即置于冰上。
  4. 从胎盘一侧切开卵黄囊，注意不要损伤胚胎，然后将胚胎从卵黄囊中取出。
  5. 立即处死胚胎并断头，将断头后的头部放入含有不含钙（Ca）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中。2+）和镁（Mg2+)（HBSS-/-）置于冰上。
    注意：如果需要进行基因分型，可在此阶段切取尾部用于遗传学分析。当预期存在多种基因型时，应将各个胚胎的头部单独保留用于培养。
  6. 使用斜角镊子，将头部侧向放置，朝向左侧。
  7. 用镊子的一端刺穿眼球，同时用另一端牢固地夹住下巴。
  8. 从颈背开始，沿中线轻轻撕开头皮皮肤至吻部前端。
  9. 通过呈白色椭圆形的脊髓进入，使用斜角镊沿中线撬开颅骨，暴露脑组织。
  10. 轻轻剥离朝上一侧的颅骨，暴露脑组织。
  11. 将脑组织从颅骨中取出，待脑完全移出后，处理掉颅骨。
  12. 用镊子去除脑膜，脑膜表现为一层带有密集血管的薄膜。
  13. 将脑组织放入 Bijou 瓶中（参见 材料表) 冰上放置，内含 2 mL HBSS-/-。
  14. 用剩余的脑组织重复步骤 2.6 至 2.13，每个比约瓶最多加入四个脑组织。
  15. 向离心管中加入 250 µL 10x 胰蛋白酶，通过振荡离心管吹打破碎脑组织。在 37 °C 下孵育 15 分钟。
    注意：从此时起的所有步骤均应在无菌细胞培养罩内进行。
  16. 解冻2 mL大豆胰蛋白酶（SD）抑制剂（Leibovitz L-15，含0.52 mg/mL大豆来源的胰蛋白酶抑制剂，40 µg/mL DNase I，3 mg/mL牛血清白蛋白[BSA] 5号组分；参见 材料表从 -20 °C 取出后置于 37 °C 解冻。
  17. 向每个含有脑组织的离心管中加入 2 mL SD 抑制剂（每管最多含四个脑组织），再次振荡离心管以使其均匀分散。
    注意：SD抑制剂可降低胰蛋白酶活性，防止样品发生不必要的消化，从而维持细胞活力。
  18. 不进行离心，从每个bijou管中移除2 mL上清液，并小心避免转移细胞团块，将上清液转移至15 mL离心管中。
  19. 用连接5 mL注射器的19号针头在离心管中将剩余细胞反复吹打两次，以重悬细胞。这将形成一种浓稠的、类似黏液的混合物。
    1. 用21 G针头再重复两次。如果仍有团块残留，用21 G针头再吹打一次。
  20. 使用23 G针头将细胞从离心管转移至同一个15 mL离心管（来自步骤2.18）。
  21. 以 200 x 离心 g 室温（RT）孵育 5 分钟。
  22. 使用5 mL血清移液管移除所有上清液，并将其转移至另一支15 mL离心管中，注意不要扰动底部含有目标细胞的松散沉淀。
  23. 再次以 200 x 离心上清液 g 室温下孵育5分钟。
    注意：此步骤并非必需，但如果需要获得大量细胞或胚胎数量较少时，可执行此步骤以从上清液中尽可能回收更多细胞。
  24. 使用10 mL铺板培养基（PM）（49%达尔伯克改良伊格尔培养基[DMEM]，1%青霉素/链霉素[Pen/Strep]，25%马血清，25%含Ca²⁺的Hank's平衡盐溶液[HBSS]）2+ 和 Mg2+ [HBSS+/+]；参见 材料表），合并并共同重悬两个沉淀，以制备全细胞悬液。
  25. 使用台盼蓝和血细胞计数板或数字细胞计数器对细胞进行计数，并用PM将细胞悬液稀释至浓度为1.8 × 10⁶细胞/mL。6 cells/mL

3. 细胞接种

  1. 按照 表1 中所述，将所需体积的细胞悬液加入相应的培养容器中：6 孔板每孔 1,000 µL，96 孔板每孔 50 µL，或每张盖玻片 100 µL。
  2. 在 37 °C、5%-7% CO2 条件下孵育 2-4 小时，使用倒置显微镜检查细胞是否已贴壁。
  3. 移除培养基，并补充新鲜的分化培养基（DM+：含 10 µg/mL 胰岛素的 DM-；DM-：DMEM，1% 青霉素/链霉素，50 nM 氢化可的松，10 ng/mL 生物素，2.5 mL 100x N1 培养基添加剂；参见 材料表）。培养基体积详见 表1。使用无菌移液器吸头将漂浮的盖玻片轻轻压下使其贴壁。

4. 培养物的维持

注意：这些培养物需每周喂养三次，以支持最佳生长和分化。培养物将在体外培养天数（DIV）达到适宜天数时，处于最适合实验的健康和成熟状态。 体外细胞可在培养条件下维持长达28天，此后培养物会迅速退化。

  1. 在DIV12之前，每周三次，通过以下方式更换部分上清液：在6孔板中每孔移除500 µL，在96孔板中每孔移除50 µL，或在含三张盖玻片的培养皿中移除500 µL，然后分别向6孔板每孔加入600 µL、96孔板每孔加入60 µL，或向含盖玻片的培养皿中加入600 µL新鲜DM+培养基（表1）。
  2. 从DIV13开始，每周三次，通过以下方式更换部分上清液：在6孔板中每孔移除500 µL，在96孔板中每孔移除50 µL，或在含三张盖玻片的培养皿中移除500 µL，然后分别向6孔板每孔加入600 µL、96孔板每孔加入60 µL，或向含盖玻片的培养皿中加入600 µL新鲜DM-培养基（表1）。

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结果

显微镜检查
在玻璃盖玻片上培养的细胞适用于显微镜分析。为了观察细胞培养物的发育过程，从DIV0（细胞贴壁后）至DIV28的多个时间点，用4%多聚甲醛（PFA）固定盖玻片上的细胞。细胞染色用于免疫荧光成像，方法如前所述5，采用三种不同的染色组合：NG2（未成熟少突胶质细胞）和nestin（神经干细胞/前体细胞）作为发育标志物，SMI31（轴突）、MBP（髓鞘）和NeuN（神经元胞体）作为神经元标志物，或CNP（少突胶质细胞）、GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）作为胶质细胞标志物（图2）。

使用 CellProfiler 流程（基于 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1））对各类细胞进行定量。每个独立数据点均来自每个时间点三个盖玻片上平均10张图像的统计结果。对于小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，计算其占4′,6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（DAPI+）细...

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讨论

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的网络，从大脑延伸至脊髓，包含多种细胞类型，主要是神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞1。由于每种细胞在维持中枢神经系统稳态以及对各种刺激产生适当反应中均发挥重要作用9,10,11，因此包含所有这些细胞类型的培养系统是研究大脑如何应对刺激的一种有用且多功能的工具。在体外（in vitro）环境中研究这些细胞及其相互作用的能力，使得大量技术可被灵活应用于解决多种实验问题。我们概述了一种快速高效的方法，用于从小鼠产前脑组织中分离并培养主要的中枢神经系统细胞类型，该方法可模拟成年小鼠脑中的各个细胞群体12。

既往建立的中枢神经系统（CNS）培养方案使用E13.5时期的脊髓组织4,<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向Edgar实验室和Linington实验室的成员表示感谢，特别是Chris Linington教授、博士 戴安娜·阿尔塞尼，博士 感谢Katja Muecklisch在建立细胞培养过程中提供的建议、有益的评论以及协助培养细胞。特别感谢Muecklisch博士为Cell Profiler分析流程提供了初始方案。本研究由多发性硬化症协会（资助号122）和Yuri与Lorna Chernajovsky基金会资助MP；格拉斯哥大学资助JC和MP；Wellcome Trust（217093/Z/19/Z）和医学研究理事会（MRV0109721）资助GJG。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x 胰蛋白酶SigmaT4549-100ML用于组织消化
140 mm 组织培养皿Fisher11339283每1个140 mm培养皿中放置8个35 mm培养皿
15 mL Falcon 管Sarstedt62554502用于收集细胞形成沉淀，以便重悬于铺板培养基中
18 G 针头Henke Sass Wolf4710012040用于样品吹打
21 G 针头BD304432用于样品吹打
23 G 针头Henke Sass Wolf4710006030用于样品吹打
35 mm 组织培养皿Corning430165每1个35 mm培养皿中铺3个PLL包被的盖玻片
5 mL 注射器Fisher15869152用于样品吹打
6 孔板Corning3516用于细胞铺板，进行RT-qPCR和流式细胞术
7 mL Bijoux 管FisherDIS080010R用于放置脑组织
96 孔板Corning3596用于高通量检测的细胞铺板
ACSA-2 抗体，抗小鼠，PE标记Miltenyi130-123-284用于星形胶质细胞的流式细胞术染色
弯头镊子Dumont0108-5/45-PO用于解剖
生物素SigmaB4501用于DM+/-培养基
硼酸SigmaB6768-500G用于配制硼酸缓冲液
Brilliant Violet 421 标记抗小鼠CD24抗体，克隆M1-69Biolegend101825用于神经元和星形胶质细胞的流式细胞术染色
Brilliant Violet 605 标记抗小鼠CD45抗体，克隆30-F11Biolegend103139用于小胶质细胞的流式细胞术染色
Brilliant Violet 785 标记抗小鼠/人CD11b抗体，克隆M1/70Biolegend101243用于小胶质细胞的流式细胞术染色
BSA 第V组分SigmaA3059-10G用于SD抑制剂
CNPAbcamAB6319成熟少突胶质细胞标记物
盖玻片VWR631-0149用于显微镜观察的细胞铺板
解剖剪刀SigmaS3146-1EA用于解剖
DMEM 高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺Gibco21969-035用于DM+/-培养基及铺板培养基
DNase IThermofisher18047019用于SD抑制剂，可使用此产品或Sigma的另一种DNase
DNase ISigmaD4263用于SD抑制剂，可使用此产品或Thermofisher的另一种DNase
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780Thermofisher65-0865-14活/死细胞染色
精细镊子Dumont0102-SS135-PO用于解剖
GFAPInvitrogen13-0300星形胶质细胞标记物
含钙镁的HBSSSigmaH9269-500ML用于铺板培养基
不含钙镁的HBSSSigmaH9394-500ML用于盛放脑组织
马血清Gibco26050-070用于铺板培养基
氢化可的松SigmaH0396用于DM+/-培养基
Iba1Alpha-Laboratories019-1971小胶质细胞标记物
胰岛素SigmaI1882用于DM+培养基
Leibovitz L-15 培养基Gibco11415-049用于SD抑制剂
MBPBio-RadMCA409S髓鞘标记物
小鼠CCL5/RANTES DuoSet ELISA试剂盒BioTechneDY478-05用于定量96孔板上清液中CCL5浓度的ELISA试剂盒
N1 培养基添加剂SigmaN6530-5ML用于DM+/-培养基
NestinMerckMAB353神经干细胞/前体细胞标记物
NeuNThermofisherPA578499神经元胞体标记物
NG2SigmaAB5320未成熟少突胶质细胞标记物
O4 抗体，抗人/小鼠/大鼠，APC标记Miltenyi130-119-155用于少突胶质细胞的流式细胞术染色
青霉素-链霉素（Pen/Strep）SigmaP0781-100ML用于DM+/-培养基及铺板培养基
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP1274用于配制硼酸/聚-L-赖氨酸溶液以包被盖玻片
SMI31BioLegend801601轴突标记物
四硼酸钠Sigma221732-100G用于配制硼酸缓冲液
TrizolThermofisher15596026用于细胞裂解以进行RT-qPCR
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT9003-100MG用于SD抑制剂

参考文献

  1. Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
  5. Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117(2019).
  6. Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
  7. Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).
  8. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  9. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
  10. Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
  11. Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).
  12. Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).
  13. Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
  14. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
  15. Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
  16. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
  17. Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
  18. Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
  19. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
  20. Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).
  21. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).
  22. Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
  23. Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
  24. Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).
  25. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).

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