用于测定单细胞材料特性的剪切实验方案

摘要

本方案概述了对癌细胞系和非癌细胞系机械特性的定量分析方法 体外癌细胞与正常细胞在力学特性上的保守差异可作为一种生物标志物，可能对疾病的预后和诊断具有重要意义。

摘要

异常的生物力学特性是癌症生物学的一个显著特征，受到广泛研究。细胞的力学性质与材料的力学性质相似。细胞对应力和应变的抵抗能力、弛豫时间以及弹性等性质均可被测定，并与其他类型细胞进行比较。量化癌细胞（恶性）与正常细胞（非恶性）的力学特性，有助于研究人员进一步揭示该疾病的生物物理基础。尽管已知癌细胞的力学特性始终不同于正常细胞，但目前尚缺乏一种标准的实验方法，用于从培养细胞中推导这些力学性质。

本文概述了一种用于量化单个细胞力学特性的实验方法 体外 使用流体剪切实验。该实验的原理是将流体剪切应力施加于单个细胞，并通过光学手段实时监测细胞随之发生的形变。随后，利用数字图像相关（DIC）分析对细胞的力学特性进行表征，并将合适的黏弹性模型拟合至DIC分析所得的实验数据。总体而言，本文所述方案旨在为难治性癌症的诊断提供一种更有效且更具针对性的方法。

引言

研究癌细胞与非癌细胞之间的生物物理差异，可为新型诊断和治疗手段提供机遇¹。了解生物力学/机械生物学差异如何影响肿瘤进展及治疗耐药性，将为靶向治疗和早期诊断开辟新的途径²。

已知癌细胞的力学特性与正常细胞存在差异（例如细胞膜和核膜的黏弹性）^3,4,5，但目前仍缺乏用于在活细胞中测量这些特性的稳健且可重复的方法⁶。剪切实验方法通过将单个细胞暴露于流体剪切应力下，并分析其对施加应力的个体响应和抵抗能力，从而量化细胞的力学特性^3,4,5,7,8,9。尽管已有多种方法和技术被用于表征单个细胞的力学特性，但这些方法往往会对细胞材料特性产生影响：i) 原子力显微镜（AFM）....

方案

1. 单细胞剪切实验的准备工作

1. 细胞培养
   1. 在含有 2 mL 培养基的 35 mm × 10 mm 培养皿中接种约 50,000 个悬浮的单细胞。
      注意：接种前需涡旋振荡悬浮细胞，以打散细胞团块。
   2. 将细胞在 37 °C 条件下孵育，静置 10 至 48 小时，以确保细胞贴壁及细胞骨架蛋白完全形成。
      注意：应考虑细胞贴壁时间以及增殖和生长速率，以保证细胞充分生长和贴壁，同时避免细胞聚集。这些参数因细胞类型而异。

2. 剪切力实验

1. 剪切力测定黏性流动介质的制备
   1. 为确保流动培养基具有轻微的黏性（0.015–0.02 Pa·s），请测量并向培养基中添加0.05 wt%无毒且无致敏性的甲基纤维素（4 Pa·s）。
   2. 为确保混合均匀，将基础培养基在约60-70 °C 使用磁力搅拌器/加热板。在持续搅拌培养基的同时，缓慢加入甲基纤维素，使其迅速分散，避免甲基纤维素颗粒结块。继续搅拌约15–24小时，以确保形成澄清的培养基+纤维素溶液。
      注意：避免过度加热溶液。
   3. 使用流变仪测试约0.5–1 mL的代表性流动介质，以测量其黏度。根据仪器读数确定流体黏度，并将该值用于表示剪切流体介质的黏度。

结果

结合数字图像相关法（DIC）与黏弹性模型的剪切实验方案可成功量化单个细胞的力学特性 体外该方法已在人和小鼠细胞系上进行测试，包括正常人乳腺细胞（MCF-10A）^3,4,9转移性较低的三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-468）³三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）³人骨肉瘤细胞^7,8，以及最近研究的胶质母细胞瘤细胞（图3）。从剪切实验记录中提取的图像帧的微分干涉差（DIC）能够成功生成与蠕变应力响应相容的应变-时间数据（图3），可拟合至一个粘弹性模型（图4

讨论

剪切力检测方法通过构建拟态的力学生物学环境，模拟细胞与其周围力学微环境的相互作用以及对机械应力的响应，已系统性地揭示了一系列细胞力学特性，这些特性的模式显示出在不同癌细胞系中保守存在的物理异常特征^3,4,5,7,8。该方法结合了基础流体力学与物理学原理，用于表征细胞独特的力学性质，并为多种难治性癌症的检测提供了潜在的材料或力学生物标志物^3,4。

剪切力测定技术存在一定的局限性。由于某些细胞类型生长和增殖迅速，维持单细胞培养具有挑战性，这使得单个细胞的观察与分析变得困难。不同细胞系之间的细胞对压力的耐受性及其响应可能存在异质性，因此需要使用大量细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1×[-] 碳酸氢钠	Corning	25-053-ci	用于细胞培养中细胞从基质上的解离
15 mL 离心管	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm 培养皿	Corning	430165
50 mL 离心管	Falcon by Corning	14-432-22
离心机	任意		用于无菌细胞培养
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1×	Corning	10-013-cv	或其他适用于细胞培养的培养基。本实验使用 DMEM 培养 U87 细胞
手套	任意		用于无菌细胞培养
Heracell Vios 160i CO2 培养箱	Thermo Scientific	51033770	用于细胞培养过程中的孵育
生物安全柜	任意		用于无菌细胞培养
微量移液器	任意		用于无菌细胞培养
微量移液器吸头	任意		用于无菌细胞培养
显微镜	Leica/任意		用于无菌细胞培养
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），1×	Corning	21-040-CM
Pipetman	任意		用于无菌细胞培养
移液管吸头	任意		用于无菌细胞培养
Precision GP 10 液体培养箱	Thermo Scientific	TSGP02
T25 培养瓶	Corning	430639
T75 培养瓶	Corning	430641U
剪切力实验
100 mL 烧杯	任意		用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体
DMEM	Corning
流动腔室 + 橡胶垫圈	Glycotech	31-001	圆形流动腔室套件（适用于 35 mm 组织培养皿）
混合流变仪	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		用于测定剪切流体的黏度
磁力搅拌子	任意		用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体
磁力搅拌板	任意		用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体
甲基纤维素	任意		用于提高流动培养基中 DMEM 的黏度
注射泵	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	用于编程控制液体的注入与抽出
注射器、管路和连接件			用于剪切装置的搭建
软件
ABAQUS 软件	Simulia
数字图像相关软件	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
成像软件	Leica/任意显微镜配套软件
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B