本方案概述了对癌细胞系和非癌细胞系机械特性的定量分析方法 体外癌细胞与正常细胞在力学特性上的保守差异可作为一种生物标志物，可能对疾病的预后和诊断具有重要意义。
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本文内容
摘要
摘要
异常的生物力学特性是癌症生物学的一个显著特征，受到广泛研究。细胞的力学性质与材料的力学性质相似。细胞对应力和应变的抵抗能力、弛豫时间以及弹性等性质均可被测定，并与其他类型细胞进行比较。量化癌细胞（恶性）与正常细胞（非恶性）的力学特性，有助于研究人员进一步揭示该疾病的生物物理基础。尽管已知癌细胞的力学特性始终不同于正常细胞，但目前尚缺乏一种标准的实验方法，用于从培养细胞中推导这些力学性质。
本文概述了一种用于量化单个细胞力学特性的实验方法 体外 使用流体剪切实验。该实验的原理是将流体剪切应力施加于单个细胞，并通过光学手段实时监测细胞随之发生的形变。随后，利用数字图像相关（DIC）分析对细胞的力学特性进行表征，并将合适的黏弹性模型拟合至DIC分析所得的实验数据。总体而言，本文所述方案旨在为难治性癌症的诊断提供一种更有效且更具针对性的方法。
引言
研究癌细胞与非癌细胞之间的生物物理差异，可为新型诊断和治疗手段提供机遇1。了解生物力学/机械生物学差异如何影响肿瘤进展及治疗耐药性，将为靶向治疗和早期诊断开辟新的途径2。
已知癌细胞的力学特性与正常细胞存在差异（例如细胞膜和核膜的黏弹性）3,4,5，但目前仍缺乏用于在活细胞中测量这些特性的稳健且可重复的方法6。剪切实验方法通过将单个细胞暴露于流体剪切应力下，并分析其对施加应力的个体响应和抵抗能力，从而量化细胞的力学特性3,4,5,7,8,9。尽管已有多种方法和技术被用于表征单个细胞的力学特性，但这些方法往往会对细胞材料特性产生影响：i) 原子力显微镜（AFM）相关的压痕深度、复杂的探针几何形状或基底硬化可能导致细胞膜穿孔或损伤10,11；ii) 光学捕获过程中诱导细胞光损伤12,13；或 iii) 微吸管抽吸引发复杂的应力状态14,15。这些外部效应会导致细胞黏弹性测量结果的准确性存在显著不确定性6,16,17。
为解决这些局限性，本文所述的剪切力检测方法提供了一种高度可控且简便的方法，用于模拟体内生理流动，同时不会影响细胞材料的特性。该检测中的流体剪切应力代表了细胞在体内因肿瘤间质液或循环血液中的流体所经历的机械应力18,19,20。此外，这些流体应力可促进癌细胞的多种恶性行为，包括进展、迁移、转移和细胞死亡19,21,22,23 ，这些行为在致瘤性与非致瘤性细胞之间有所不同。此外，癌细胞的力学特性发生改变（即，它们通常比同一器官内的正常细胞更"柔软"），使其能够在恶劣的肿瘤微环境中持续存在，侵入周围正常组织，并转移至远端部位24,25,26。通过构建一种伪生物环境，使细胞经受生理水平的流体剪切应力，从而实现一种生理相关且对细胞无损伤的过程。细胞对所施加流体剪切应力的响应使我们能够表征细胞的力学特性。
本文提供了一种剪切力测定实验方案，可用于深入研究在施加剪切应力条件下癌细胞与非癌细胞的力学特性及行为。细胞对外部力的响应具有弹性和黏性特征，因此可被理想化为一种黏弹性材料3该技术分为以下几类：（i）分散的单细胞培养，（ii）流体剪切应力的可控施加，（iii） 原位 细胞行为的成像与观察（包括对压力和形变的抵抗能力）、(iv) 细胞应变分析以确定形变程度，以及 (v) 单个细胞黏弹性特性的表征。通过探究这些力学性质与行为，可将复杂的细胞力学生物学过程转化为可量化的数据。该方法的实验方案可用于系统记录并比较不同类型恶性与非恶性细胞。对这些差异进行量化，有望建立用于诊断和治疗的生物标志物。
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方案
1. 单细胞剪切实验的准备工作
- 细胞培养
- 在含有 2 mL 培养基的 35 mm × 10 mm 培养皿中接种约 50,000 个悬浮的单细胞。
注意：接种前需涡旋振荡悬浮细胞，以打散细胞团块。 - 将细胞在 37 °C 条件下孵育，静置 10 至 48 小时，以确保细胞贴壁及细胞骨架蛋白完全形成。
注意：应考虑细胞贴壁时间以及增殖和生长速率，以保证细胞充分生长和贴壁，同时避免细胞聚集。这些参数因细胞类型而异。
- 在含有 2 mL 培养基的 35 mm × 10 mm 培养皿中接种约 50,000 个悬浮的单细胞。
2. 剪切力实验
- 剪切力测定黏性流动介质的制备
- 为确保流动培养基具有轻微的黏性（0.015–0.02 Pa·s），请测量并向培养基中添加0.05 wt%无毒且无致敏性的甲基纤维素（4 Pa·s）。
- 为确保混合均匀，将基础培养基在约60-70 °C 使用磁力搅拌器/加热板。在持续搅拌培养基的同时，缓慢加入甲基纤维素，使其迅速分散，避免甲基纤维素颗粒结块。继续搅拌约15–24小时，以确保形成澄清的培养基+纤维素溶液。
注意：避免过度加热溶液。 - 使用流变仪测试约0.5–1 mL的代表性流动介质，以测量其黏度。根据仪器读数确定流体黏度，并将该值用于表示剪切流体介质的黏度。μ) 以使用公式（2).
- 剪切装置设置
- 设置双注射器（60 mL 或 100 mL）剪切力测定系统，将注射器连接至可编程注射泵，用于黏性培养基的灌注与回抽图1).
- 将两个注射器连接到流室上 通过 1/16 英寸管路及管路连接件
- 在流路中固定橡胶垫圈，以实现单个细胞沿流动路径的可控且均匀的流动图1）。橡胶垫圈有不同尺寸，具体取决于所需的流动模式（层流或湍流）和期望的观察区域（例如，长度为22.5 mm，宽度为2.5 mm，高度为0.254 mm）（图1).
- 将泵设置为以指定流速（例如，1 mL/min）灌注并抽取特定体积的液体（例如，60 mL），并选择相应规格的注射器（例如，60 mL）。
注意：应考虑最大灌注和抽吸体积的预设值，以避免发生堵塞或故障。使用公式（2用于计算所需泵剪切速率（假设所需的应力和黏度已知）。
- 预剪切设置
- 用制备好的黏性流动介质填充注射器。
- 将装有60或100 mL（或根据需要）黏性流动培养基的注射器以及一个空的60 mL注射器分别连接至可编程注射泵的相应位置。 通过 将管路和管路连接器连接至流动室，并将两个注射器与管路相连。
- 为便于识别单个细胞并确保流室与培养皿之间连接牢固，需将橡胶垫圈安装到流室上。
- 吸除含有目标细胞的培养皿中的细胞培养基。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去死细胞和未贴壁的细胞。
- 吸除 PBS。
- 将流动小室和橡胶垫圈（约34 mm × 9 mm）插入并固定到含有贴壁细胞的培养皿（35 mm × 10 mm）上。
- 将装有细胞的微流控灌注室置于培养皿中，然后放置在倒置显微镜载物台上，选用足够高倍的物镜以获得高像素值的高质量图像（通常介于 40x 和 63x 放大倍数）和显示监视器。
- 选择 活体成像 （在显示器上的显微镜软件中选择某些软件的延时成像）选项。确保计算机上的显微镜软件具备延时（t）功能，或能够进行视频录制。
- 调节显微镜物镜，确保获得足够的对比度和清晰的细胞边缘，这对于剪切后的图像分析至关重要。移动显微镜载物台，使细胞在显示屏幕上清晰可见，并确认为实时动态图像。
- 在已安装的流室+培养皿的成像/流经路径内（由垫圈与流室的贴合所形成的区域/路径），选择一个或多个独立的细胞。
- 剪切与成像
- 为保持连续均匀的流动，应选择相近的灌注与抽吸速率，并确保流体呈层流状态，通常介于 1 mL/min 和 5 mL/min对于低层流状态，确保雷诺数为 重新 < 100.
- 点击 运行 通过剪切泵以恒定速率注入和抽出剪切流体（配制好的黏性培养基）。确保流体灌注过程中无气泡产生，以免对细胞引入额外的、不可控的应力。
- 单击开始录制视频 记录 在显微镜下，灌注的剪切流体与目标细胞接触之前，启动显微镜软件。
- 继续记录7分钟，或根据所需的应激暴露时间进行记录，直至目标细胞从培养皿底部脱落。点击 停止记录 在运行按预期完成后，于显微镜软件中进行相应操作。
- 保存记录并导出为 .tiff 文件. 最好在以下条件下提取图像 每秒1帧 便于分析。
3. 数据处理
- 数字图像相关程序（图像分析）
- 如果显微镜记录以视频文件形式导出，请将其转换为图像帧（建议使用 .tiff 文件格式）。
- 将剪切实验记录获得的图像导入 Davis 10.1.2 软件（DIC 软件），通过在后续新图像（变形图像）中定位参考图像中每个像素块（子集），追踪细胞天然结构的运动（图 2）。
- 为获得优化的相关性，建议使用 31 × 31 像素 的子集大小、20 像素 的步长（每个子集的变形距离），并选择 差分轨迹求和 选项，该选项可追踪新图像相对于上一图像的变形。相关分析结果为应变-时间曲线图（图 3），可导出为 .csv 文件，供 MATLAB 进一步分析。
- 划定所选单个细胞的兴趣区域。在已划定的细胞区域内选择任意点以追踪变形。对于细胞等不规则形状，使用 多边形掩模 来描绘细胞的几何轮廓。
- 完成区域划定后，点击 添加应变计，并在已定义的细胞边界内选择细胞上的特定位置（如细胞核或细胞质），绘制单个应变计以进行分析。
- 点击 运行 开始应变处理，获取应变随时间变化的数据。
- 双击（或右键点击）生成的应变-时间曲线图，选择 将数据导出为电子表格。
4. 机械性能表征
- 粘弹性特性表征
- 将DIC软件生成的包含应变-时间数据的.csv文件保存到单独的文件夹中，以便MATLAB能够方便地读取。
- 运行 MATLAB 并单击 编辑器标签 打开一个编辑器页面，编写代码以逐个单元格读取电子表格。
- 更改 MATLAB 路径（访问目标文件的文件夹路径），以指向包含待分析数据的文件夹，例如， 用户/用户名/桌面/数据.
- 在 MATLAB 编辑器页面中，使用自定义代码访问电子表格数据。例如：a1 = xlsread('data','run1','A4:A183')，其中 a1 代表 标识符, xlsread 是 MATLAB 函数 那个 读取 .csv 文件 （在此情况下，以电子表格形式） 数据 是 文件名，run1 是 工作表名称，以及 A4:A183 是 电子表格数据中A列感兴趣数据的范围 待分析。为获得完整拟合，请分析 x 和 y (时间 和 菌株，分别）。例如：
a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
a1 = x（时间），b1 = y（应变）。 - 在 MATLAB 中，单击 应用程序 | 曲线拟合器 | 自定义方程. 清除代表性的自定义方程，并输入粘弹性模型方程 [方程（1)，其中 ε 表示 x 变量，t 表示 y 变量。
(1)
此处，ε 表示应变，σ 表示剪切应力， η1 表示黏度，E 表示弹性，t 表示时间，且 τ 表示弛豫时间，用于表征细胞在发生初始形变后恢复至原始形状所需的最长时间。其表达式为 τ =
，其中 η2 是第二个阻尼器的二级黏度项（图4). - 在自定义方程界面中，将新的变量重新分配给粘弹性参数。（ε， η1，E，σ，t，和 τ = ) 分别表示 (x, a, b, K, y 和 c)。其中，x 和 y 分别为自变量和因变量。剪切应力（σ）可通过公式（2):
(2)
此处， μ repr表示剪切流体介质的黏度，Q 为泵的流速， w 和 h 分别为图中流道的宽度和高度 图1C分别。 - 点击 选择数据 选择 时间（a1） 和 菌株 (b1) 每组数据。
- 确保 自动适配框选项 检查后，当选中数据（x 和 y）时，将自动运行拟合。
- 选择合适的方法以收紧边界条件。单击 高级选项 在……之下 方法 类别并选择 非线性最小二乘法. 在……之下 稳健的，选择 关闭，以及在……之下 算法，选择 信赖域将其他所有参数保持不变。
- 拟合后得到的新变量（a、b 和 c）分别代表黏弹性特性、黏度、弹性以及松弛时间η1，E，EQUAT），分别表示细胞的（图5).
- 寻找拟合的高R平方值（R²）2 > 80%），以确保数据输出可被视为黏弹性模型的真实拟合图3)
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结果
结合数字图像相关法（DIC）与黏弹性模型的剪切实验方案可成功量化单个细胞的力学特性 体外该方法已在人和小鼠细胞系上进行测试，包括正常人乳腺细胞（MCF-10A）3,4,9转移性较低的三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-468）3三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）3人骨肉瘤细胞7,8，以及最近研究的胶质母细胞瘤细胞（图3）。从剪切实验记录中提取的图像帧的微分干涉差（DIC）能够成功生成与蠕变应力响应相容的应变-时间数据（图3），可拟合至一个粘弹性模型（图4
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讨论
剪切力检测方法通过构建拟态的力学生物学环境，模拟细胞与其周围力学微环境的相互作用以及对机械应力的响应，已系统性地揭示了一系列细胞力学特性，这些特性的模式显示出在不同癌细胞系中保守存在的物理异常特征3,4,5,7,8。该方法结合了基础流体力学与物理学原理，用于表征细胞独特的力学性质，并为多种难治性癌症的检测提供了潜在的材料或力学生物标志物3,4。
剪切力测定技术存在一定的局限性。由于某些细胞类型生长和增殖迅速，维持单细胞培养具有挑战性，这使得单个细胞的观察与分析变得困难。不同细胞系之间的细胞对压力的耐受性及其响应可能存在异质性，因此需要使用大量细...
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者感谢伍斯特理工学院Soboyejo课题组先前的研究人员首次开创了该技术：曹一芳博士、胡敬杰博士和Vanessa Uzonwanne博士。本研究由美国国家癌症研究所（NIH/NCI K22 CA258410，资助对象：M.D.）提供支持。插图使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| 0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1×[-] 碳酸氢钠 | Corning | 25-053-ci | 用于细胞培养中细胞从基质上的解离 |
| 15 mL 离心管 | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm 培养皿 | Corning | 430165 | |
| 50 mL 离心管 | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| 离心机 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1× | Corning | 10-013-cv | 或其他适用于细胞培养的培养基。本实验使用 DMEM 培养 U87 细胞 |
| 手套 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| Heracell Vios 160i CO2 培养箱 | Thermo Scientific | 51033770 | 用于细胞培养过程中的孵育 |
| 生物安全柜 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 微量移液器 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 微量移液器吸头 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 显微镜 | Leica/任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），1× | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| 移液管吸头 | 任意 | 用于无菌细胞培养 | |
| Precision GP 10 液体培养箱 | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 培养瓶 | Corning | 430639 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641U | |
| 剪切力实验 | |||
| 100 mL 烧杯 | 任意 | 用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体 | |
| DMEM | Corning | ||
| 流动腔室 + 橡胶垫圈 | Glycotech | 31-001 | 圆形流动腔室套件（适用于 35 mm 组织培养皿） |
| 混合流变仪 | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | 用于测定剪切流体的黏度 | |
| 磁力搅拌子 | 任意 | 用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体 | |
| 磁力搅拌板 | 任意 | 用于配制含甲基纤维素的高黏度 DMEM 剪切流体 | |
| 甲基纤维素 | 任意 | 用于提高流动培养基中 DMEM 的黏度 | |
| 注射泵 | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | 用于编程控制液体的注入与抽出 |
| 注射器、管路和连接件 | 用于剪切装置的搭建 | ||
| 软件 | |||
| ABAQUS 软件 | Simulia | ||
| 数字图像相关软件 | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| 成像软件 | Leica/任意显微镜配套软件 | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
参考文献
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