猪常温离体肝脏灌注

摘要

本文所述的猪肝脏常温机械灌注（NMP）模型可成功用于研究NMP作为一种器官保存策略、活力评估工具以及器官修复平台。该模型具有较高的转化价值，但在技术上具有挑战性且劳动强度大。

摘要

猪的肝脏模型 离体 常温机械灌注（NMP）在移植研究中正日益得到广泛应用。与啮齿类动物相比，猪肝脏在解剖结构和生理特性上更接近人类，其器官大小和胆汁成分均与人类相似。NMP通过在肝脏血管系统中循环一种温暖、含氧且富含营养物质的基于红细胞的灌注液，使肝移植物维持在接近生理状态的条件下。NMP可用于研究缺血-再灌注损伤以及保存肝脏 离体 移植前评估肝脏在植入前的功能，并为器官修复与再生提供平台。或者，可采用基于全血灌注液的常温机械灌注（NMP）来模拟移植过程。然而，该模型费时费力，技术难度高，且经济成本昂贵。

在此猪的常温机械灌注（NMP）模型中，我们使用经历热缺血损伤的肝脏（对应于循环死亡后捐献）。首先，实施全身麻醉并进行机械通气，随后通过夹闭胸主动脉60分钟以诱导热缺血。经腹主动脉和门静脉插入导管，用低温保存液对肝脏进行冲洗。冲洗出的血液使用细胞回收装置洗涤，以获得浓缩的红细胞。肝切除术后，将导管插入门静脉、肝动脉和肝下腔静脉，并连接至预先充填血浆扩容剂和红细胞的闭合灌注回路。灌注回路中包含一个中空纤维氧合器，并连接热交换器，以维持38 °C时氧分压（pO₂）在70–100 mmHg。通过动脉持续灌注实现常温机械灌注 通过 通过门静脉连接静脉储液器。持续监测血流、压力和血气值。为评估肝损伤，在预设时间点采集灌注液和组织样本，并收集胆汁 通过 胆总管中的导管

引言

肝移植是治疗终末期肝衰竭的唯一确定性手段；然而，其成功受到等待移植患者数量与潜在供体器官可获得性之间长期失衡的限制¹为了扩大供体来源，过去十年中供体标准逐步放宽，包括高龄供体、肝脏脂肪变性以及循环死亡后捐献（DCD）^2,3在DCD手术过程中，肝脏在撤除生命支持治疗、宣布死亡至器官获取之间不可避免地会经历一段热缺血时间。 原位 冷却与保存，加重缺血-再灌注损伤（IRI）⁴因此，DCD肝脏与早期移植物功能障碍及胆道并发症的发生率增加相关。^5,6.

对于这些高风险供体肝脏，采用静态冷保存进行常规保存无法为缺血-再灌注损伤（IRI）提供足够的保护。因此，诸如常温机械灌注（NMP）等替代性保存策略已受到广泛关注。在常温机械灌注过程中，肝脏被连接 离体 连接至独立回路，并在体温条件下用含氧且富含营养的灌注液进行灌注。临床试验表明，常温机械灌注可减少肝细胞损伤，表现为转氨酶释放峰值降低以及早期移植物功能障碍减少⁷然而，关于常温机械灌注期间肝细胞生物学特性的研究仍十分有限

方案

鲁汶大学遵循涉及动物研究的欧盟动物福利指令（Directive 2010/63/EU）。该指令已纳入比利时法律，强调"3R原则"（替代、减少、优化），并确保动物使用的合理性基于潜在的科学收益，且不存在可行的替代方法。本方案中的所有实验均依照欧盟动物福利指令进行，并已获得鲁汶大学动物护理委员会批准（P054/2020）。

1. 动物信息

注意：本研究方案使用3月龄雄性TOPIGS TN70猪，体重约30 kg，肝重为600-700 g。

1. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的节律下，单栏饲养，自由摄食和饮用自来水，同时保持动物之间的视觉、嗅觉和听觉接触。
2. 确保动物至少在手术前2天到达，以适应周围环境。手术前禁食12小时，但可自由饮水。
   ​注意：麻醉采用异氟烷维持，镇痛使用芬太尼。在整个麻醉过程中，持续监测心电图、脉搏血氧饱和度、二氧化碳浓度监测和血压。实验为终末性实验；在持续全身麻醉和镇痛状态下，通过放血法处死猪，并同时获取肝脏。

2. 灌注装置的准备

1. 一次性灌注套件的安装
   1. 将储液器固定在比肝脏接收容器高约15 cm的固定高度处。
   2. ....

结果

本灌注方案利用肝脏血流的自我调节能力，实现长达24小时的稳定血流动力学条件，并模拟门静脉和肝动脉中生理性的血流分布。图1展示了灌注回路的示意图。图2A显示了稳定的血流分布，门静脉和肝动脉分别贡献了约75%和25%的总肝血流量（在下腔静脉水平测量）。图2B显示肝内血管阻力保持稳定。门静脉的阻力低于肝动脉，与正常的生理状态相似。

稳定且持续的灌注配合充分的氧合可确保肝脏功能在24小时内得到保存。图3A显示，灌注液中天冬氨酸转氨酶（肝损伤标志物）的释放水平在灌注开始后6–12小时内达到稳定状态。此外，灌注液的pH值由肝脏自身调节，并维持在正常范围内，无需添加碳酸氢盐进行补充（图3B）。灌注液中的乳酸在灌注开始后1小时内即可清除至正常水平（图3C

讨论

本文中，我们详细介绍了猪肝脏离体常温机械灌注（NMP）的操作经验。该技术的优势包括高度的可转化性和多功能性。猪肝脏NMP既可用于研究并加深对这种增强型保存技术的理解，也可用于模拟移植过程。该系统可对手动控制灌注的各个方面，从而以多种方式调节门静脉和动脉的压力与流量。

为了尽可能接近临床实践，猪的肝切除术以与人类供体相同的方式进行，这意味着需要进行一些离体台上的准备工作。由于这是一个封闭回路系统，在肝脏离体冲洗过程中必须特别注意彻底止血。尽管循环管路允许少量渗漏，但门管区出血过多可能导致溶血增加。准备过程中的另一个关键步骤是下腔静脉流出道插管的位置，因为放置不当可能导致下腔静脉塌陷，从而产生负压，引起流出道阻塞和肝脏充血。因此，采用多孔尖端插管以防止阻塞，并使用伺服调节器控制下腔静脉压力。此外，在再灌注开始时，应在门静脉血流启动数秒后才打开下腔静脉夹，同时应缓慢增加泵速，直至达到理想的流出压。我们还建议将流出道插管固定在肝脏容器上，以确保即使在取活检操作过程中移动肝脏时，流出道插管仍能保持在正确位置。

在离体常温机械灌注（NMP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alaris GH Plus 注射泵	BD Care Fusion	80023 UN 01-G
麻醉机	Dräger	Titus
动脉导管 Cavafix Certo	Braun, Melsungen, Germany	BRAU4152557
血气分析仪	Radiometer	ABL815
10% 葡萄糖酸钙	Braun, Melsungen, Germany	570/13596667/1214
二氧化碳图监测仪	Dräger	Scio
自体血回收装置	Medtronic	AutoLog
离心泵 Biomedicus	Medtronic	85315 REV 3.0
离心机 Rotina 420R Hettich	VWR	521-1156
定制灌注管路	Medtronic	M323901C
一次性自体血回收装置套件	Medtronic	ATLS24
DLP 单级直型静脉插管 20F	Medtronic	66120
依前列醇	GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium	Flolan
芬太尼-Janssen 0.05 mg/mL	Janssen	HK-08700
血流传感器 BioPro TT	Em-Tec	12271
4% 甲醛	VWR	VWRK4078.9005
-80 °C 超低温冰箱	New Brunswick Scientific	U570-86
冰箱	Liebherr	CUP 3513
Geloplasma	Fresenius-Kabi, Bad Homburg, Germany	freeflex
热交换器	Stöckert-Shiley, Sorin group	16-02-1950
肝素 5000 IE/mL	Leo Pharma, Ballerup, Denmark	HeparinLeo
肝动脉插管	Medtronic	BIO-MEDICUS 12F
IGL-1 器官保存液	Institut Georges Lopez	IGL-1/1000/D
在线血气分析仪	TERUMO	Calibrator 3MCDI 540/CDI 500
胰岛素 200 IU Actrapid	Novo Nordisk, Dagsvaerd, Denmark	MEDI-00018
异氟烷 1000 mg/g 吸入用蒸气	Chanelle Pharma	Iso-Vet
静脉导管 BD Insyte-W 20 G	BD	381334
液氮罐	KGW Isotherm	S22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 无针结扎包	JNJ medical	F4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 无针结扎包	JNJ medical	F4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 无针	JNJ medical	EH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 无针	JNJ medical	EH6734H
微量移液器 1000 µL	Socorex	82,51,000
监护仪	Siemens	SC 8000
Plasmalyte Viaflo	Baxter	Plasmalyte Viaflo
门静脉插管	CALMED LABS	18F RV-40018
压力传感器	Stöckert-Shiley, Sorin group	22-06-2000
压力伺服调节器	Medtronic	BM 9505-2
Prolene 4-0	JNJ medical	EH7151H
滚压泵	Cobe Century USA	468048-000 REV C
碳酸氢钠 8.4%	Braun, Melsungen, Germany	362 2339
牛磺胆酸钠	Sigma Aldrich, Burlington, USA	86339
手术刀片 24 号	Swann Morton	0211
静脉导管，三腔；12FR	ARROW	AK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 无针大包装	JNJ medical	V1205G
赛拉嗪 2%	VMD Livestock pharma	XYL-M 2%
Zinacef 头孢呋辛 750 mg	GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, Belgium	NDC 0173-0353-32
Zoletil 100	Virbac	Zoletil 100