方法文章

线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫 使用细胞器特异性染料标记细菌和哺乳动物细胞

DOI：

10.3791/65337

⸱

2023年5月19日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过电子显微镜、遗传传感器和免疫荧光技术研究线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的技术人员以及大量的时间投入。本文展示了商用荧光染料试剂盒在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和肝癌细胞系中定量检测线粒体自噬过程的有效性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体对多种生物学功能至关重要，包括能量生成、脂质代谢、钙稳态、血红素生物合成、调控性细胞死亡以及活性氧（ROS）的产生。活性氧对关键的生物学过程具有重要作用。然而，当其失控时，可能导致氧化损伤，包括线粒体损伤。受损的线粒体会释放更多的活性氧，从而加剧细胞损伤和疾病状态。一种名为线粒体自噬（mitophagy）的稳态过程可选择性清除受损的线粒体，并由新的线粒体取代。存在多种线粒体自噬通路，其共同终点是在溶酶体中降解受损的线粒体。

多种方法（包括基因传感器、抗体免疫荧光和电子显微镜）均利用该终点来定量线粒体自噬。每种检测线粒体自噬的方法都有其优势，例如基因传感器可实现特定组织/细胞的靶向，而电子显微镜可提供极高的细节分辨率。然而，这些方法通常需要昂贵的资源、专业培训的人员，以及在实际实验前进行耗时的准备工作，例如构建转基因动物。本文介绍一种经济高效的替代方法，使用市售的靶向线粒体和溶酶体的荧光染料来检测线粒体自噬。该方法可有效测量线虫Caenorhabditis elegans和人肝细胞中的线粒体自噬，表明其在其他模式系统中也具有潜在的应用效率。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体对所有需氧动物（包括人类）至关重要。它们通过氧化磷酸化过程将生物分子的化学能转化为三磷酸腺苷（ATP）via 氧化磷酸化1，合成血红素2，通过β氧化降解脂肪酸3，调节钙4和铁5的稳态，通过凋亡调控细胞死亡6，并产生活性氧（ROS），后者在氧化还原稳态中发挥重要作用7。两个相互补充且相反的过程维持着线粒体的完整性和正常功能：新线粒体组分的合成（即生物发生）以及通过线粒体自噬（即有丝分裂）选择性清除受损组分8。

多种线粒体自噬通路由酶类（如 PINK1/Parkin）以及受体（包括 FUNDC1、FKBP8 和 BNIP/NIX）介导9,10。值得注意的是，线粒体组分的选择性降解可独立于自噬体机制发生（即通过线粒体来源的囊泡）11。然而，不同选择性线粒体自噬通路的最终结果相似 （即通过溶酶体酶降解线粒体）12,13。因此，目前多种识别和检测线粒体自噬的方法均依赖于线粒体与溶酶体标志物的共定位14,15,16,17，以及线粒体蛋白/线粒体 DNA 水平的降低18。

以下是使用荧光显微镜检测动物细胞中线粒体自噬的现有实验方法的简要描述，重点强调线粒体自噬的终末阶段。

线粒体自噬生物传感器
线粒体降解发生于溶酶体的酸性环境中19。因此，在线粒体自噬过程的终点，线粒体组分（包括蛋白质）会经历从接近中性到酸性pH值的转变。这一特性构成了多种线粒体自噬生物传感器的作用机制基础，例如mito-Rosella18和串联结构mCherry-GFP-FIS114。这些传感器包含一种对pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）和一种对pH不敏感的红色荧光蛋白（RFP）。因此，在线粒体自噬的终点，由于GFP荧光基团被淬灭，绿色荧光与红色荧光的比值显著下降。这些传感器的主要局限性包括：（1）荧光基团之间可能发生福斯特共振能量转移（FRET）；（2）GFP与RFP成熟速率不同；（3）连接两种荧光蛋白的多肽链可能被蛋白水解切割，导致GFP与RFP解离；（4）荧光发射光谱重叠；以及（5）不同荧光基团的亮度和淬灭特性存在差异15,16。

一种能够克服上述部分局限性的传感器是Keima线粒体传感器17。mt-Keima传感器（源自珊瑚蛋白Keima）具有单一发射峰（620 nm），但其激发峰对pH敏感。因此，当pH由高变酸时，激发峰会从绿色激发（440 nm）转变为红色激发（586 nm）16,17。一种较新的线粒体自噬传感器Mito-SRAI通过实现对固定生物样本的检测，进一步推动了该领域的发展20。然而，尽管基因编码传感器具有诸多优势，例如可在特定组织或细胞中表达，并靶向至不同的线粒体区室，但它们也存在局限性。其中一个局限性在于，这些基因传感器需要在细胞或动物体内表达，这一过程可能耗时且资源消耗较大。

此外，传感器在线粒体自身的表达可能会影响线粒体功能。例如，在线粒体中表达线粒体GFP（mtGFP）时 秀丽隐杆线虫 线虫体壁肌肉扩展线粒体网络21。该表型依赖于应激激活的转录因子ATFS-1的功能，后者在线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）的激活过程中发挥关键作用线粒体)21因此，尽管基因编码的线粒体/线粒体自噬生物传感器在监测线粒体稳态方面极为有用 体内它们可能会影响其原本旨在测量的过程本身。

线粒体/溶酶体特异性抗体与染料
检测线粒体/溶酶体共定位的另一种策略是使用针对线粒体/溶酶体蛋白的抗体，例如线粒体外膜蛋白 TOM20 和溶酶体相关膜蛋白 1（LAMP1）22。在大多数情况下，使用与荧光染料偶联的二抗，通过显微镜检测荧光信号via。另一种方法是将遗传构建体与线粒体/溶酶体染料结合使用，例如在细胞中表达 LAMP1::GFP 融合构建体的同时，用红色线粒体染料（如 Mitotracker Red）进行染色16。这些方法虽然有效，但需要特定的抗体，且通常涉及固定样本的操作，或需要构建表达荧光标记线粒体/溶酶体的细胞或转基因动物。

本文概述了一种商用溶酶体/线粒体/细胞核染色试剂盒的使用方法，用于评估合成二胺化合物 O,O'-(辛烷-1,8-二基)双(羟胺)（以下简称 VL-85023）在秀丽隐杆线虫（C. elegans）和人肝癌细胞系 Hep-3B 中激活线粒体自噬（mitophagy）的特性（图1）。该染色试剂盒包含一组特异性靶向溶酶体、线粒体和细胞核的荧光染料，可分别对这些细胞器进行染色23。我们此前已利用该试剂盒证明了1,8-二氨基辛烷（以下简称 VL-004）在 C. elegans 中具有诱导线粒体自噬的活性23。重要的是，我们通过 mito-Rosella 生物传感器以及线粒体DNA与细胞核DNA含量的qPCR检测结果，验证了该染色试剂盒的可靠性23。该染色试剂盒具有以下优势：第一，无需构建表达线粒体生物传感器的转基因动物或细胞，因此可直接研究未经基因修饰的野生型个体或细胞，从而节省大量时间、经费和人力；此外，如前所述，表达线粒体生物传感器可能改变线粒体的正常功能。第二，该试剂盒成本较低、操作简便且检测快速。第三，尽管本研究在 C. elegans 和人源细胞中展示了该方法的应用，但其亦可经适当调整后用于其他类型的细胞或生物体。

话虽如此，与其他方法一样，染色试剂盒方案也存在一些缺点。例如，线虫与试剂的孵育需在无食物条件下进行（我们发现即使使用灭活的细菌也会显著降低染色效率）。尽管孵育时间相对较短，但仍有可能在此期间影响稳态响应，包括线粒体自噬。此外，染料与内质网/线粒体/核蛋白及其他生物分子的结合可能会影响这些细胞器的功能。而且，与使用遗传传感器检测线粒体自噬不同，我们所使用的线虫和细胞均经过化学固定处理，因此无法对同一批线虫或细胞在不同时间点进行连续监测。因此，我们建议结合多种方法来验证线粒体自噬在特定生理过程中的功能。下文展示了新的实验数据，证明VL-850可在C. elegans线虫和Hep-3B细胞中诱导强烈的线粒体自噬。这些数据进一步支持了VL-850通过诱导健康的线粒体自噬来延长C. elegans寿命并保护C. elegans免受氧化损伤的假说。实验中我们采用质子离子载体羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）作为阳性对照，该化合物是一种强效的线粒体自噬诱导剂24。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：为了方便读者，我们将实验方案分为两部分：一部分专注于在线虫 C. elegans 中检测线粒体自噬的实验方法，另一部分专注于在肝细胞中检测线粒体自噬的实验方法。材料清单见文中提供的材料表。

1. C. elegans 实验方案

  1. 准备线虫生长培养基（NGM）平板和大肠杆菌（Escherichia coli）OP50 菌种储备
    注意：需要说明的是，尽管我们遵循了制备 NGM 平板和 OP50 细菌储备的标准方案25,26，但我们认识到不同实验室之间这些方案可能存在差异。因此，我们提供了完整的操作流程，以确保实验能够准确重复。
    1. 通过将约 150 mL 的 1 M K2HPO4 加入 500 mL 的 1 M KH2PO4 溶液中，直至 pH 达到 6，配制 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6）。使用 0.22 µm 真空过滤/储存系统对缓冲液进行灭菌。
    2. 配制 0.1 M 氯化钙（CaCl2）和硫酸镁（MgSO4），并使用 0.2 µm 注射器滤器进行灭菌。
    3. 用无水乙醇配制 5 mg/mL 胆固醇溶液。
      注意：由于胆固醇溶于乙醇，因此不要对其进行过滤。
    4. 通过将 1.5 g 氯化钠（NaCl）、1.25 g 蛋白胨和 8.5 g 琼脂溶解于 500 mL 双蒸水（DDW）中，配制 NGM-琼脂。高压灭菌后冷却至约 55 °C。
    5. 在无菌条件下，向上述溶液中加入 12.5 mL 磷酸钾缓冲液（pH 6）、0.5 mL 0.1 M CaCl2、0.5 mL 0.1 M MgSO4 和 1 mL 5 mg/mL 胆固醇溶液。每次添加后充分混匀。
    6. 将 4 mL 熔化的 NGM-琼脂加入每个 35 mm 培养皿中。将培养皿置于室温（RT，约 21 °C）下过夜，使其凝固。
    7. 为制备 LB（Luria-Bertani）琼脂平板，将 5 g NaCl、5 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物和 7.5 g 琼脂溶解于 400 mL 去离子蒸馏水（DDW）中，调节溶液 pH 至 7.0，用 DDW 定容至 500 mL，然后高压灭菌。待溶液冷却至 55 °C 后，将 25 mL 混合液倒入每个 90 mm 培养皿中，并在室温下干燥 2 天。随后，从甘油储备菌种中在干燥的 LB 平板上划线接种 OP50 细菌，于 37 °C 培养过夜以获得单菌落。
    8. 通过将 8 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 2.5 g 氯化钠（NaCl）溶解于 0.5 L DDW 中，配制 2x 酵母胰蛋白胨（YT）培养基。调节 pH 至 7，然后高压灭菌。
    9. 冷却后，从新鲜划线的 LB 平板上挑取一个 OP50 细菌单菌落，接种至 250 mL 锥形瓶中的 50 mL 2x YT 培养基中。在 37 °C、250 rpm 条件下振荡培养，直至光密度（OD600）达到约 0.6。
  2. 准备对照和实验处理平板
    1. 在每个 35 mm NGM-琼脂平板中心加入 100 µL OP50 细菌，在室温（RT，21 °C）下过夜干燥。
    2. 用 DMSO 配制 0.5 M VL-850 溶液，并使用 M9 缓冲液（22 mM KH2HPO4、42 mM Na2HPO4、86 mM NaCl、pH 7 和 1 mM MgSO4）26 稀释至 10 mM VL-850。确认 pH 为 7.0（若非此值，用 0.1 M HCl 滴定），并通过 0.22 µm 注射器滤器过滤灭菌。对照溶液的配制方法相同，但不添加药物（即 VL-850）。另用 DMSO 配制 50 mM FCCP 溶液，用 M9 缓冲液稀释至 1 mM FCCP，并通过 0.22 µm 注射器滤器过滤灭菌。
    3. 分别在已接种细菌的 NGM 平板的菌苔上加入 25 µL 对照溶液（阴性对照）、FCCP（阳性对照；5 µM）或 VL-850（实验处理；62.5 µM）。
    4. 用铝箔覆盖平板，在室温（RT，21 °C）下干燥。约 16 小时后使用。
  3. 获得同步化的年轻成年秀丽隐杆线虫（C. elegans）雌雄同体
    1. 用 22 mM KH2HPO4、42 mM Na2HPO4 和 86 mM NaCl 配制 1 L M9 缓冲液。高压灭菌后冷却。冷却后加入 1 mL 1 mM MgSO4（经 0.22 µm 滤器灭菌）。
    2. 将 0.8 mL 2.5 N 氢氧化钠和 1 mL 5% 次氯酸钠溶液与 2.2 mL DDW 混合，配制 4 mL 碱性次氯酸盐溶液（终浓度为 0.5 N 氢氧化钠和 1.25% 次氯酸钠）。
    3. 用 1 mL M9 缓冲液冲洗 NGM 平板 3 次，将线虫（怀卵雌雄同体）收集至 15 mL 圆底离心管中，确保所有母体均被收集入管。
    4. 以 500 × g 离心 1 分钟使线虫沉淀，弃去上清液，保留约 1 mL 液体体积。
    5. 加入 1 mL 碱性次氯酸盐溶液，通过倒置混匀 5 次。轻柔涡旋 3 分钟以促进卵的释放，并在解剖立体显微镜下观察线虫状态。
    6. 当约 50% 的线虫破裂时，加入 5 mL M9 缓冲液 ，立即以 500 × g 离心 1 分钟，使卵沉淀。
    7. 小心弃去上清液，避免扰动沉淀。加入 5 mL M9 缓冲液，重复洗涤 2 次。
    8. 弃去上清液，保留 2 mL 液体，将离心管以 20 rpm 转速旋转（360° 旋转）约 16 小时（RT，21 °C），以获得同步化的 L1 幼虫。取 5 µL 液滴置于载玻片上，在立体显微镜下计数幼虫数量，重复 3 次，取三次计数的平均值，估算每微升（µL）中的线虫数量。根据此估算结果，向每个接种了 OP50 细菌的 NGM 平板中加入约 200 条幼虫。
    9. 将 L1 幼虫在 21 °C 下培养约 48 小时，直至发育至年轻成虫阶段。
  4. 药物处理与显微观察流程
    1. 将 100 条线虫分别置于各实验组或对照组平板上。确保阴性对照、阳性对照和实验组平板分别含有对照溶液、5 µM FCCP 和 62.5 µM VL-850。在 21 °C 下孵育 6 小时。
    2. 用 1 mL M9 缓冲液将每块平板上的线虫洗入 1.7 mL 微量离心管中。在小型离心机中短暂离心（约 3 秒）。然后小心吸去上清液，避免扰动线虫沉淀。重复洗涤 2 次，最后轻轻去除上清液，避免扰动线虫沉淀。
    3. 向线虫沉淀中加入 200 µL 含有 0.1% v/v Poloxamer 188、0.1% v/v Pluronic F127 和 2 µL 染色试剂盒试剂的 M9 缓冲液。在室温（RT，21 °C）下以 20 rpm（360° 旋转）缓慢旋转 1 小时。为防止染料见光分解，用铝箔覆盖离心管。
    4. 如步骤 1.3.4 所述，轻柔离心线虫，然后去除染色液而不扰动线虫沉淀。接着按步骤 1.3.2 所述方法洗涤线虫，并将其转移至含有相应处理剂的接种 NGM-琼脂平板中（例如，经 FCCP 处理的线虫转移至含 FCCP 的平板）。由于染色试剂对光敏感，需用铝箔覆盖平板。
      ​注意：我们将线虫转移至含有细菌和相应处理剂的培养平板中，以尽量减少因过量染料引起的背景噪声。例如，经 FCCP 处理的线虫被转移至补充 FCCP 的平板，依此类推。
    5. 用 1 mL M9 缓冲液将线虫从平板上洗入新的微量离心管中，按相同方式洗涤 2 次。接着在冰上用 1% 甲醛固定 30 分钟，再用 1 mL M9 缓冲液洗涤 3 次以去除残留甲醛。洗涤后将线虫离心成沉淀，尽可能吸除上清液，保留约 10 µL M9 缓冲液包裹线虫沉淀。
    6. 为配制 2.5% 琼脂糖，称取 0.125 g 琼脂糖放入 10 mL 硼硅酸盐玻璃试管中，加入 5 mL M9 缓冲液，用本生灯轻轻加热溶解琼脂糖。将熔化的琼脂糖转移至设定为 75 °C 的干浴锅中，用 1 mL 枪头取 100 µL 熔化的琼脂糖滴加至显微镜盖玻片（24 mm × 60 mm）上。立即将另一张载玻片垂直置于琼脂糖液滴上，形成十字形。等待约 2 分钟后，轻柔推动上方盖玻片，将其与下方盖玻片分离，使琼脂糖垫保留在底部盖玻片上。
      注意：加热试管中琼脂糖时需小心，确保试管远离身体。剪去 1 mL 枪头的尖端以减少琼脂糖凝固。
    7. 用巴斯德玻璃移液管将线虫转移至琼脂糖垫上（即管中全部约 10 µL 液体）。用实验室擦拭纸制成的吸水条吸除多余液体，然后用较小的盖玻片（24 mm × 40 mm）覆盖线虫。在小盖玻片边缘涂上透明指甲油以防止蒸发。将载玻片放入暗盒中避光保存。
    8. 使用共聚焦显微镜在 24 小时内以适当波长（见下文）和 60 倍物镜对线虫进行成像。
      1. 将载玻片置于显微镜载物台上。
      2. 打开成像软件，右键单击软件的灰色区域。在弹出的菜单中依次点击 Acquisition | Ti2 Full Pad | ND Acquisition | LUTs。
      3. 在 Ti2 Full Pad 下选择 60x。
      4. 在 Acquisition 下选择 Eyepiece DIA，使用显微镜微调焦旋钮使线虫图像清晰。在 Acquisition 下选择 Spinning disk，并选择 16-bit - No binning option。对于 每个荧光滤光片，将 曝光时间 设置为 500 ms，明场 设置为 20 ms。参数设置完成后，选择 Run Now，等待输出图像生成为 ND2 文件。
        注意：曝光时间需根据实验条件确定，不同成像系统具有不同特性。使用查找表（LUTs）检查各波长下的荧光强度。
  5. 图像分析
    1. 在 ImageJ27 中使用 共定位插件 打开共聚焦图像（此处为尼康 ND2 文件）。每个 ND 文件包含三个波长下的图像平面（使用 DAPI、GFP/FITC [绿色] 和 Texas Red [红色] 滤光片）以及可见光图像。打开 ND 文件后，在对话框中选择 Split Images。后续分析使用明场（BF）、绿色通道和红色通道图像。
    2. 点击 Image | Duplicate 或使用快捷键 Shift + D，生成这些图像的副本，以保持原始图像不变。
    3. 为降低背景，如上所述再生成一份图像副本。使用 Rolling Radius 为 100 进行背景减除，并选择 Create Background (don't subtract) option 生成该图像的背景图像。然后进入 Process | Image Calculator，将第一份副本图像从第二份副本图像中减去。使用所得图像进行共定位分析。
    4. 使用 共定位插件 前，将 绿色通道 和 红色通道图像 转换为 8 位。操作方法为点击 Image | Type | 8 bit。
    5. 点击 Plugins | Colocalization。使用 共定位插件（见上文）测量线粒体与溶酶体信号的共定位时，使用以下参数：Ratio = 75%，红色通道阈值 = 80.0，绿色通道阈值 = 50.0。输出结果为一张包含共定位点状结构的 8 位二值图像，以及三张 8 位图像（绿色、红色和共定位图像）合并而成的 RGB 图像。
    6. 通过手动选择线虫头部体壁肌区域并点击 Edit | Selection | Create Mask 创建掩膜，聚焦于该区域的点状结构（图 2A、B）。选择性去除其他染色结构（如咽部肌肉），以分析头部体壁肌区域。
    7. 为选择感兴趣区域（ROI）中的颗粒，使用图像计算器选中 共定位 8 位 和 掩膜 图像，然后使用 AND 操作（图 3A）选择 ROI 内的点状结构。此操作生成一张仅包含 ROI 内点状结构的图像（图 3B）。
    8. 为分析线粒体与溶酶体共定位区域的面积，选择 Analyze | Analyze Particles，测量面积介于 0.1625 µm2 和 4 µm2 之间的点状结构总面积。

2. Hep-3B 癌细胞实验方案

  1. 配制药物储备液
    1. 用二甲基亚砜（DMSO）配制100 mM的VL-850溶液。用0.5 M HEPES缓冲液（pH 7.3）将其稀释至5 mM，并使用0.22 µm针头滤器对溶液进行灭菌。然后，按照前述方法配制不含药物（本例中为VL-850）的对照溶剂（vehicle）。
  2. Hep-3B细胞的培养、药物处理及显微镜观察流程
    1. 在含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的10 cm组织培养皿中培养Hep-3B细胞，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、2% L-谷氨酰胺和1%四环素（以下简称完全DMEM）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
    2. 选择处于70%–80%汇合度（对数生长期）的Hep-3B细胞培养皿，吸除培养基，用5 mL预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。吸除PBS后，加入1 mL预热的0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液，在37 °C孵育约3分钟，并在组织培养显微镜下（10倍物镜）观察细胞状态。当细胞变圆并开始从皿底脱落时，加入5 mL完全DMEM终止消化。以1,000 × g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于5 mL完全DMEM中。
    3. 测定细胞浓度。取50 µL细胞悬液与50 µL台盼蓝混合，使用自动细胞计数仪或血球计数板重复计数5次，取平均值以确保计数准确性。
    4. 在每个8孔µ载玻片的400 µL完全DMEM中接种42,000个Hep3G细胞（如上所述）。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
    5. 孵育24小时后，当细胞汇合度达到约80%–85%时，从每孔中吸除250 µL培养基，然后加入50 µL含有相应处理药物或对照溶剂的培养基。按照本方案，分别用100 µM VL-850、5 µM FCCP及对照溶剂处理细胞。
    6. 化合物处理6小时后，向每孔加入含染色试剂的50 µL培养基（每孔250 µL中含0.5 µL染料）。将细胞在37 °C、5% CO2条件下与染料共同孵育30分钟。
      注意：染色试剂对光敏感，应尽量避免光照，可用铝箔包裹样品，并在避光环境中操作（如条件允许）。
    7. 使用200 µL移液器轻轻吸除每孔中的全部培养基（250 µL），然后用200 µL预热的PBS洗涤细胞一次。
    8. 加入200 µL固定液（含4%甲醛和2.5%戊二醛的PBS溶液），室温固定15分钟。
    9. 倾去固定液，用200 µL PBS快速洗涤一次。
    10. 加入200 µL PBS，将样品覆盖并避光保存于4 °C，于24小时内完成成像。
      注意：我们采用转盘共聚焦显微镜进行四通道成像，包括DIC、TRITC、FITC和DAPI，具体设置同步骤1.4.8。每种处理条件下成像约300个细胞。
  3. 图像分析
    1. 执行步骤1.5.1–1.5.5。为获得细胞的感兴趣区域（ROI），生成一幅突出显示细胞区域的图像。为此，选择共定位点（RGB）图像（图4A）。为选中整个细胞区域，选择处理 | 二值化 | 创建掩模，生成二值图像（图4B）。为分析细胞面积，选择分析 | 分析颗粒，并测量图像中从0到无穷大范围内的所有颗粒，此为分析颗粒功能的默认设置。
    2. 为分析线粒体与溶酶体共定位区域的面积，选择一幅共定位8位图像，通过选择处理 | 二值化 | 转为二值图像将其转换为二值图像，然后选择分析 | 分析颗粒，测量面积在0.1625 µm2至4 µm2之间的斑点总和。为计算共定位斑点比例，将线粒体与溶酶体共定位区域面积除以总细胞面积。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在两者中诱导强烈的线粒体自噬反应 秀丽隐杆线虫 线虫和用VL-850处理的Hep-3B细胞
VL-850具有保护作用 秀丽隐杆线虫 线虫和人角质形成细胞（HaCaT细胞）免受氧化应激23为了进一步探究其作用机制，我们检测了VL-850是否在细胞中诱导线粒体自噬 秀丽隐杆线虫 和其他人类细胞。为了验证这一点，我们暴露了 秀丽隐杆线虫 将线虫（年轻成虫，L1期后3天）分别暴露于62.5 µM VL-850、5 µM FCCP（阳性对照）和溶剂对照（阴性对照）中处理6小时。如上所述，我们使用染色试剂检测线粒体自噬。选择62.5 µM这一浓度的VL-850，是因为该浓度可保护线虫免受氧化应激损伤，并显著延长其寿命。23VL-850 在线虫头部体壁肌肉中诱导了强烈的线粒体自噬（图5)，表明其是一种高效的线粒体自噬诱导剂。值得注意的是，VL850诱导线粒体自噬的效力与FCCP相似（<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多种线粒体自噬途径涉及多种蛋白质和生物分子（例如心磷脂29）。然而，这些途径的最终结果相似——均由溶酶体酶介导线粒体的降解12,13。事实上，已有多种方法利用这一终点来定量线粒体自噬。然而，某些方法（如透射电子显微镜）需要昂贵的设备、专业技术人员，并且样品制备和分析耗时较长。此外，尽管线粒体自噬生物传感器具有可在特定组织、细胞或亚细胞区域中检测线粒体自噬的优势，但此类传感器的表达可能改变细胞的生理状态21。因此，亟需一种可靠、经济且快速的定量线粒体自噬方法，且无需长期干扰细胞正常生理活动。

本文介绍了一种使用经济实惠的市售线粒体/溶酶体/细胞核染料混合物的方法。我们最近已证明该方法在C. elegans和永生化人角质形成细胞（HaCaT细胞）中检测线粒体自噬的有效性23。该染色试剂盒的结果通过两种生物传感器...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢Gross实验室成员对本文手稿的仔细审阅以及提出的评论和建议。感谢由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供部分菌株。本研究得到了Vitalunga有限公司和以色列科学基金会（资助号989/19）的资助。图形摘要图（图1）由BioRender.com生成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂或资源
分析天平Mettler-Toledo
Bacto 琼脂BD-Difco214010
Bacto 蛋白胨BD-Difco211677
Bacto 胰蛋白胨BD-Difco211705
Bacto 酵母提取物BD-Difco212750
氯化钙SigmaC1016
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）SigmaC2920
化学品
胆固醇Thermo FisherC/5360/48
DMEM 高糖培养基Biological Industries01-055-1A
双蒸水（DDW）
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Biological Industries02-023-1A
经热灭活的胎牛血清（FBS）InvitrogenM7514
戊二醛（25%）SigmaG5882
HEPES 缓冲液 1 MBiological Industries03-025-1B
L-谷氨酰胺Biological Industries03-020-1B
溶酶体/线粒体/细胞核染色 Cytopainter 试剂Abcamab139487
硫酸镁SigmaM7506
Nonidet P-40Sigma74385
多聚甲醛（16%）Electron Microscopy Sciences15720
泊洛沙姆 188 溶液SigmaP5556
磷酸二氢钾Millipore1.04873.1000
磷酸氢二钾SigmaP3786
SeaKem LE 琼脂糖Lonza50004
氯化钠Bio-Lab1903059100
氢氧化钠Gadot1310732
十二水合磷酸氢二钠Sigma4273
盐酸四环素Sigma87128-25G
胰蛋白酶-EDTABiological Industries03-052-1A
VL-850：1,8-二氨基辛烷专利
玻璃/塑料耗材
0.22 μm 注射器滤器Millex GVSLGV033RS
1.7 mL 微量离心管LifegeneLMCT1.7B-500
10 cm 培养皿Corning430167
1,000 mL 锥形瓶IsoLab, Germany
15 mL 无菌聚丙烯管LifegeneLTB15-500
35 mm 培养皿Bar NaorBN9015810
500 mL 真空过滤/储存瓶系统，0.22 μmLifegeneLG-FPE205500S
50 mL 无菌聚丙烯管LifegeneLTB50-500
Deckgläser 显微镜盖玻片 24 x 60 mmMarienfeld101152
玻璃试管（10 mL-13 x 100 mm），硼硅酸盐玻璃Pyrex99445-13
iBiDi 8 孔 μ-载玻片iBiDi80826
显微镜盖玻片 24 x 40 mmBar NaorBN1052421ECALN
铂铱合金丝 0.25 mMWorld Precision InstrumentsPT1002
仪器
CellDrop BF 细胞计数仪DeNovixCellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400BiosanBS-010201-AAA
配备 DAPI、FITC 和 TRITC 滤光片及明场成像功能的尼康 Yokogawa W1 转盘共聚焦显微镜，搭载 60x CFI Plan-Apochromat Lambda 型物镜（空气镜）及 NIS-Elements 软件NikonCSU-W1
奥林巴斯 SZ61 体视显微镜OlympusSZ61
pH 计Mettler-ToledoMT30019032
Revolver 可调式实验室旋转仪LabnetH5600

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6(2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479(2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706(2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ImageJ

相关文章