线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫 使用细胞器特异性染料标记细菌和哺乳动物细胞

摘要

通过电子显微镜、遗传传感器和免疫荧光技术研究线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的技术人员以及大量的时间投入。本文展示了商用荧光染料试剂盒在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和肝癌细胞系中定量检测线粒体自噬过程的有效性。

摘要

线粒体对多种生物学功能至关重要，包括能量生成、脂质代谢、钙稳态、血红素生物合成、调控性细胞死亡以及活性氧（ROS）的产生。活性氧对关键的生物学过程具有重要作用。然而，当其失控时，可能导致氧化损伤，包括线粒体损伤。受损的线粒体会释放更多的活性氧，从而加剧细胞损伤和疾病状态。一种名为线粒体自噬（mitophagy）的稳态过程可选择性清除受损的线粒体，并由新的线粒体取代。存在多种线粒体自噬通路，其共同终点是在溶酶体中降解受损的线粒体。

多种方法（包括基因传感器、抗体免疫荧光和电子显微镜）均利用该终点来定量线粒体自噬。每种检测线粒体自噬的方法都有其优势，例如基因传感器可实现特定组织/细胞的靶向，而电子显微镜可提供极高的细节分辨率。然而，这些方法通常需要昂贵的资源、专业培训的人员，以及在实际实验前进行耗时的准备工作，例如构建转基因动物。本文介绍一种经济高效的替代方法，使用市售的靶向线粒体和溶酶体的荧光染料来检测线粒体自噬。该方法可有效测量线虫Caenorhabditis elegans和人肝细胞中的线粒体自噬，表明其在其他模式系统中也具有潜在的应用效率。

引言

线粒体对所有需氧动物（包括人类）至关重要。它们通过氧化磷酸化过程将生物分子的化学能转化为三磷酸腺苷（ATP）via 氧化磷酸化¹，合成血红素²，通过β氧化降解脂肪酸³，调节钙⁴和铁⁵的稳态，通过凋亡调控细胞死亡⁶，并产生活性氧（ROS），后者在氧化还原稳态中发挥重要作用⁷。两个相互补充且相反的过程维持着线粒体的完整性和正常功能：新线粒体组分的合成（即生物发生）以及通过线粒体自噬（即有丝分裂）选择性清除受损组分⁸。

多种线粒体自噬通路由酶类（如 PINK1/Parkin）以及受体（包括 FUNDC1、FKBP8 和 BNIP/NIX）介导^9,10。值得注意的是，线粒体组分的选择性降解可独立于自噬体机制发生（即通过线粒体来源的囊泡）¹¹。然而，不同选择性线粒体自噬通路的最终结果相似 （即通过溶酶体酶降解线粒体）<....

方案

注意：为了方便读者，我们将实验方案分为两部分：一部分专注于在线虫 C. elegans 中检测线粒体自噬的实验方法，另一部分专注于在肝细胞中检测线粒体自噬的实验方法。材料清单见文中提供的材料表。

1. C. elegans 实验方案

1. 准备线虫生长培养基（NGM）平板和大肠杆菌（Escherichia coli）OP50 菌种储备
   注意：需要说明的是，尽管我们遵循了制备 NGM 平板和 OP50 细菌储备的标准方案^25,26，但我们认识到不同实验室之间这些方案可能存在差异。因此，我们提供了完整的操作流程，以确保实验能够准确重复。
   1. 通过将约 150 mL 的 1 M K₂HPO₄ 加入 500 mL 的 1 M KH₂PO₄ 溶液中，直至 pH 达到 6，配制 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6）。使用 0.22 µm 真空过滤/储存系统对缓冲液进行灭菌。
   2. 配制 0.1 M 氯化钙（CaCl₂）和硫酸镁（MgSO₄），并使用 0.2 µ....

结果

诱导强烈的线粒体自噬反应 秀丽隐杆线虫 线虫和用 VL-850 处理的 Hep-3B 细胞
VL-850具有保护作用 秀丽隐杆线虫 线虫和人角质形成细胞（HaCaT细胞）免受氧化应激²³为进一步探究其作用机制，我们检测了VL-850是否在细胞中诱导线粒体自噬 秀丽隐杆线虫 和其他人类细胞。为了验证这一点，我们暴露了 秀丽隐杆线虫 线虫（年轻成虫，L1后3天） 62.5 µM VL-850 5 µM FCCP（阳性对照）和溶剂（阴性对照）处理6 h。如上所述，我们使用染色试剂检测线粒体自噬。我们选择使用该方法 62.5 µM VL-850 的浓度因其可保护线虫免受氧化应激并显著延长其寿命²³. VL-850 在线虫头部体壁肌肉中诱导了强烈的线粒体自噬图5)，表明其是一种高效的线粒体自噬诱导剂。值得注意的是，VL850诱导线粒体自噬的效力与FCCP相似（

讨论

多种线粒体自噬途径涉及多种蛋白质和生物分子（例如心磷脂²⁹）。然而，这些途径的最终结果相似——均由溶酶体酶介导线粒体的降解^12,13。事实上，已有多种方法利用这一终点来定量线粒体自噬。然而，某些方法（如透射电子显微镜）需要昂贵的设备、专业技术人员，并且样品制备和分析耗时较长。此外，尽管线粒体自噬生物传感器具有可在特定组织、细胞或亚细胞区域中检测线粒体自噬的优势，但此类传感器的表达可能改变细胞的生理状态²¹。因此，亟需一种可靠、经济且快速的定量线粒体自噬方法，且无需长期干扰细胞正常生理活动。

本文介绍了一种使用经济实惠的市售线粒体/溶酶体/细胞核染料混合物的方法。我们最近已证明该方法在C. elegans和永生化人角质形成细胞（HaCaT细胞）中检测线粒体自噬的有效性²³。该染色试剂盒的结果通过两种生物传感器.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂或资源
分析天平	Mettler-Toledo
Bacto 琼脂	BD-Difco	214010
Bacto 蛋白胨	BD-Difco	211677
Bacto 胰蛋白胨	BD-Difco	211705
Bacto 酵母提取物	BD-Difco	212750
氯化钙	Sigma	C1016
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）	Sigma	C2920
化学品
胆固醇	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM 高糖培养基	Biological Industries	01-055-1A
双蒸水（DDW）
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Biological Industries	02-023-1A
经热灭活的胎牛血清（FBS）	Invitrogen	M7514
戊二醛（25%）	Sigma	G5882
HEPES 缓冲液 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
溶酶体/线粒体/细胞核染色 Cytopainter 试剂	Abcam	ab139487
硫酸镁	Sigma	M7506
Nonidet P-40	Sigma	74385
多聚甲醛（16%）	Electron Microscopy Sciences	15720
泊洛沙姆 188 溶液	Sigma	P5556
磷酸二氢钾	Millipore	1.04873.1000
磷酸氢二钾	Sigma	P3786
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50004
氯化钠	Bio-Lab	1903059100
氢氧化钠	Gadot	1310732
十二水合磷酸氢二钠	Sigma	4273
盐酸四环素	Sigma	87128-25G
胰蛋白酶-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850：1,8-二氨基辛烷	专利
玻璃/塑料耗材
0.22 μm 注射器滤器	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL 微量离心管	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm 培养皿	Corning	430167
1,000 mL 锥形瓶	IsoLab, Germany
15 mL 无菌聚丙烯管	Lifegene	LTB15-500
35 mm 培养皿	Bar Naor	BN9015810
500 mL 真空过滤/储存瓶系统，0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL 无菌聚丙烯管	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser 显微镜盖玻片 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
玻璃试管（10 mL-13 x 100 mm），硼硅酸盐玻璃	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 孔 μ-载玻片	iBiDi	80826
显微镜盖玻片 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
铂铱合金丝 0.25 mM	World Precision Instruments	PT1002
仪器
CellDrop BF 细胞计数仪	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
配备 DAPI、FITC 和 TRITC 滤光片及明场成像功能的尼康 Yokogawa W1 转盘共聚焦显微镜，搭载 60x CFI Plan-Apochromat Lambda 型物镜（空气镜）及 NIS-Elements 软件	Nikon	CSU-W1
奥林巴斯 SZ61 体视显微镜	Olympus	SZ61
pH 计	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver 可调式实验室旋转仪	Labnet	H5600