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方法文章

mRNA 富集及亚硫酸氢盐处理mRNA文库构建用于高通量测序

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DOI：

10.3791/65352

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2023年7月7日

 , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

本文内容

摘要

本方案提供了一套易于遵循的工作流程，用于对目标生物样本进行多聚腺苷酸化RNA纯化、亚硫酸氢盐转化以及文库制备，且可使用标准化设备完成。

摘要

多种RNA转录本中的转录后修饰与真核细胞中多样的RNA调控相关。异常的RNA 5-甲基胞嘧啶修饰以及RNA甲基转移酶表达失调已被证实与多种疾病（包括癌症）相关。为在单碱基分辨率下鉴定经亚硫酸氢盐转化的RNA中胞嘧啶甲基化位点及其定量水平，已开发出全转录组亚硫酸氢盐测序技术。本文所述实验方案详细介绍了两轮poly(A) RNA纯化、三轮亚硫酸氢盐反应及文库构建的具体步骤，以实现mRNA 5-甲基胞嘧啶修饰位点的全转录组定位。在主要反应步骤后对RNA数量和质量进行评估，对于监测RNA完整性并确保获得高质量测序文库至关重要。理想情况下，整个流程可在三天内完成。采用本方案，以高质量的总RNA为起始材料，可高效构建适用于高通量测序的亚硫酸氢盐处理mRNA文库。

引言

在150多种转录后修饰中1，5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰已被发现存在于多种RNA类型中，包括核糖体RNA、转运RNA、信使RNA、微小RNA、长链非编码RNA、vault RNA、增强子RNA以及小 Cajal 体特异性RNA2。RNA上的m5C修饰与多种生物学和病理学机制相关，例如调控植物根系发育3、病毒基因表达4以及癌症进展5。本实验方案旨在提供简化的流程，用于表征不同发育阶段或疾病状态下生物样本中全转录组mRNA的m5C修饰谱。全转录组亚硫酸氢盐测序技术已被开发用于在单碱基分辨率下鉴定亚硫酸氢盐转化RNA中胞嘧啶的甲基化位点及其定量水平6,7,8,9。该方法在研究m5C与基因表达及RNA命运之间的关联时尤为有用，有助于揭示细胞内参与生物学调控机制的潜在规律。在哺乳动物细胞中，目前已知有两种m5C识别蛋白：ALYREF可在细胞核内识别m5C，并作为mRNA从细胞核向细胞质转运的载体10；而YBX1则可在细胞质中识别m5C并增强mRNA的稳定性11。已有研究报道，在系统性红斑狼疮患者的CD4+ T细胞中，与免疫通路相关的m5C修饰mRNA出现异常12。研究表明，mRNA上的m5C修饰与癌症免疫调节及癌症进展之间存在关联13,14。因此，绘制mRNA上m5C修饰的图谱可为阐明其潜在的调控机制提供关键信息。

为了研究特定生物学条件下RNA m5C修饰的功能作用，可将基于亚硫酸氢盐转化的方法（bsRNA-seq）与基于抗体亲和富集的技术（如m5C-RIP-seq、miCLIP-seq和5-Aza-seq）结合高通量测序平台，从而在转录组范围内高效检测具有m5C修饰的靶向区域和序列15,16。本方案的优势在于能够以单碱基分辨率全面描绘RNA m5C修饰图谱，因为基于抗体亲和富集的方法依赖于高质量抗体的可获得性，并可实现m5C甲基化图谱的单片段分辨率17。

所有RNA样本将使用oligo(dT)磁珠进行两轮mRNA富集，三轮亚硫酸氢盐反应，并进行测序文库制备。为监测RNA质量，每个RNA样本在mRNA纯化和亚硫酸氢盐反应前后均需通过毛细管凝胶电泳检测片段分布情况。纯化后的文库将通过PCR扩增产物质量、毛细管凝胶电泳检测DNA片段大小分布，并在测序前使用基于荧光染料的定量检测方法评估其总体数量。该系统还可用于分析多种生物样本，如农产品、分离的病毒颗粒、细胞系、模式生物以及病理标本。

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方案

1. 多聚(A) RNA 纯化

注意：使用经 DNase I 处理的总 RNA，并在进行 poly(A) RNA 纯化前，通过毛细管电泳或常规凝胶电泳评估总 RNA 的质量和完整性。研究者应能够在电泳图的高分子量区域观察到 28S 和 18S rRNA 核糖体条带，在低分子量区域观察到 5.8S rRNA 条带，且电泳图中无明显拖尾条带。纯化步骤基本遵循制造商说明书，仅在特定步骤中进行了微小修改。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

  1. 准备
    1. 在进行以下操作前，将试剂、洗涤缓冲液、寡聚(dT)磁珠和裂解缓冲液在室温下预热30分钟。
    2. 为分离富集poly(A)的RNA，取适量高质量总RNA转移至无核酸酶的1.5 mL微量离心管中，作为起始材料，总量为10–20 µg。在热循环仪中于70 °C孵育5 min，随后冰上放置2 min。
      注：起始总RNA的用量应根据所需mRNA量及所用细胞类型适当调整。经验表明，poly(A)富集RNA在总RNA中约占1–5%。10 µg高质量总RNA通常可获得100–500 ng范围内的高质量poly(A)富集RNA，适用于后续亚硫酸氢盐转化。
    3. 同时，充分重悬寡聚(dT)磁珠。将所需体积的磁珠悬液转移至新的1.5 mL微量离心管中，置于磁力架上3 min，直至磁珠形成沉淀。
      注：每10 µg总RNA输入量使用50 µL寡聚(dT)磁珠。此步骤中磁珠体积可根据所用细胞类型进一步优化。
    4. 去除上清液，用等体积（即步骤1.1.3中所用磁珠悬液体积）的裂解缓冲液重悬寡聚(dT)磁珠，再次置于磁力架上3 min，然后去除上清液。
      注：切勿过度干燥磁珠；操作者应迅速进入步骤1.2.1。
  2. 第一轮纯化
    1. 向RNA样品管中加入裂解缓冲液（体积比4:1），充分混匀后转移至寡聚(dT)磁珠中。
      ​注：若RNA样品体积为20 µL，则加入80 µL裂解缓冲液。
    2. 通过移液器反复吹打至少10次，充分重悬RNA与裂解缓冲液的混合物及寡聚(dT)磁珠。
    3. 将样品在室温下持续旋转孵育15 min。
    4. 将样品置于磁力架上5 min或直至上清液澄清，弃去上清液。
    5. 向磁珠中加入600 µL洗涤缓冲液1，轻轻混匀以重悬磁珠。
    6. 将离心管置于磁力架上5 min或直至上清液澄清，弃去上清液，并重复步骤1.2.5一次。
    7. 加入300 µL洗涤缓冲液2洗涤磁珠，并轻柔重悬磁珠。
    8. 将离心管置于磁力架上5 min或直至上清液澄清，弃去上清液，并重复步骤1.2.7一次。
    9. 向样品管中加入30 µL冰冷的10 mM Tris-HCl（洗脱缓冲液），在70 °C孵育5 min。
    10. 迅速将离心管转移至磁力架上，待悬液在20秒或更长时间后变得澄清，将含有洗脱的poly(A)富集RNA的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。
  3. 第二轮纯化
    1. 向洗脱后的RNA样品中加入120 µL（为洗脱样品体积的4倍）裂解缓冲液，并充分混匀。
    2. 用与步骤1.1.4等体积的裂解缓冲液洗涤第一轮纯化所用磁珠，移液吹打10次以重悬磁珠，随后置于磁力架上5 min，弃去上清液。
    3. 将RNA与裂解缓冲液的混合物转移至已洗涤的磁珠中，通过移液器反复吹打至少10次，充分混匀。
    4. 将样品在室温下持续旋转孵育15 min。
    5. 重复步骤1.2.4至1.2.8，以去除盐分及其他RNA亚型。
      注：洗涤缓冲液体积可减少至300 µL洗涤缓冲液1和150 µL洗涤缓冲液2。
    6. 向样品管中加入25 µL（所需体积）冰冷的10 mM Tris-HCl（洗脱缓冲液），在70 °C孵育5 min。
    7. 迅速将离心管转移至磁力架上，待悬液在20秒或更长时间后变得澄清，将含有洗脱的poly(A)富集RNA的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    8. 取2.2 µL转移至8联管中，用于RNA定量和质量评估（采用RNA高灵敏度检测方法）。
    9. 样品可短期储存于-20 °C，长期储存应置于-70 °C。
      注：此步骤可作为实验流程中的暂停点。

2. 亚硫酸氢盐转化

注意：所有离心步骤均在室温下进行。实验步骤基本按照制造商说明书操作，但在亚硫酸氢盐反应步骤 2.3 之前增加了一个额外的步骤 2.2，用于加入外源对照 mRNA 序列。

  1. 将19 µL纯化的poly(A)富集RNA样品转移至0.2 mL 8联管中。
  2. 向第2.1步的RNA样品中加入1.0 µL的外源性对照（spike-in control），该对照以预定的1:10,000数量比加入（即0.1 ng荧光素酶mRNA : 1 µg纯化的poly(A)富集RNA），且不含任何修饰。
    注意：外参对照序列可以是萤光素酶（Firefly luciferase）RNA、海肾荧光素酶（Renilla luciferase）或 体外 未甲基化胞嘧啶的转录RNA序列。
  3. 向管中加入130 µL转化试剂，轻轻颠倒数次以充分混匀。
  4. 将试管放入PCR仪中，进行三个循环的反应：每个循环先在70 °C加热10分钟，随后在64 °C孵育45分钟；最后一步降温至4 °C。
  5. 将柱子置于收集管上，加入250 µL RNA结合缓冲液至柱中。
  6. 将步骤2.4中的样品转移 从步骤2.5中将溶液加入柱中，并用移液器充分混匀。
  7. 向柱中加入 400 µL 95-100% 乙醇，迅速盖紧盖子，倒置混匀数次。
  8. 在 10,000 × g 条件下离心 g 在25 °C下孵育30秒，弃去流穿液。
  9. 向柱中加入 200 µL RNA 洗涤缓冲液。
  10. 在 10,000 × g 离心 g 在25 °C下孵育30秒，弃去流穿液。
  11. 加入200 µL脱磺酸化缓冲液，室温孵育30分钟。
  12. 在 10,000 × g 条件下离心 g 25 °C 下孵育 30 秒，弃去流穿液。
  13. 加入 400 µL RNA 洗涤缓冲液，于 10,000 × g 25 °C 下孵育 30 秒，弃去流穿液。重复此步骤一次。
  14. 再次以 10,000 × g 在25 °C下孵育2分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。
    注意：在洗脱前另有一个2分钟的离心步骤（2.14），目的是彻底去除洗涤缓冲液。洗涤步骤进行两次，以洗去柱上残留的亚硫酸氢盐试剂中的高盐成分和脱磺酸化缓冲液。
  15. 将柱子转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。
  16. 加入 20–30 µL 无核酸酶水2将样品加入柱中，在室温下静置1分钟。
  17. 在 10,000 × g 离心 g 在25 °C下持续30秒。
  18. 将2.2 µL转移至8联管中，用于RNA浓度和质量的检测。
  19. 将亚硫酸氢盐处理的RNA样本短期储存于-20 °C，长期储存于-70 °C。
    ​注意：此处可作为本实验方案的暂停点。

3. 亚硫酸氢盐处理的 mRNA 文库制备

注意：对于纯化的 mRNA 或 rRNA 耗尽的 RNA，请遵循文库构建说明方案第 4 节。由于亚硫酸氢盐处理会使 RNA 断裂，第一步引物退火应遵循 FFPE RNA 方案。所有步骤均需在层流罩内操作，并将反应混合物置于冰上预冷的冷却架上进行添加。

  1. 起始RNA的预处理
    1. 将所需量的亚硫酸氢盐处理后的mRNA样本转移至总体积最多为5 µL的离心管中，或加入无核酸酶水（Nuclease-free H2O）使总体积达到5 µL。
      注意：建议此类RNA文库构建的起始量至少为10 ng亚硫酸氢盐处理后的mRNA，以生成最终浓度为4 nM的文库产物。
    2. 向样本中加入1 µL随机引物（紫色），并通过移液器吹打混匀。
    3. 将样本管放入预设温度为65 °C、热盖温度为105 °C的PCR仪中，孵育5分钟，随后保持在4 °C。
  2. 第一链cDNA合成
    1. 向样本中加入4 µL合成反应缓冲液（紫色）、8 µL链特异性试剂（棕色）和2 µL合成酶混合物（棕色），总体积为20 µL。通过移液器至少吹打10次充分混匀，并短暂离心。
    2. 将样本管放入PCR仪中，程序设置为：25 °C孵育10分钟，42 °C孵育50分钟，70 °C孵育15分钟，最后保持在4 °C。
      注意：对于插入片段长度超过200个碱基的样本，建议在42 °C孵育50分钟；若插入片段小于200个碱基，则建议在42 °C孵育15分钟。
  3. 第二链cDNA合成
    1. 向样本中加入8 µL含dUTP混合物的合成反应缓冲液（橙色）、4 µL合成酶混合物（橙色）和48 µL无核酸酶水（Nuclease-free H2O）。通过移液器至少吹打10次充分混匀，并短暂离心。
    2. 将样本管放入PCR仪中，程序设置为16 °C孵育1小时，热盖关闭或设定为≤40 °C。
  4. 使用DNA纯化磁珠纯化双链cDNA
    1. 在进行纯化前30分钟将DNA纯化磁珠预热，并涡旋振荡以重悬磁珠。
    2. 向第3.3.2步所得cDNA样本中加入144 µL重悬后的DNA纯化磁珠 ，并通过移液器至少吹打10次充分混匀。
    3. 室温孵育5分钟。
    4. 将样本管置于磁力架上5分钟，直至溶液澄清，然后移除上清液，保留含有DNA的磁珠。
    5. 在保持样本处于磁力架上的同时，向含磁珠的离心管中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇，室温孵育30秒。
    6. 移除上清液，并重复步骤3.4.5 一次，但此次需小心彻底去除所有残留上清液。
    7. 在样本仍置于磁力架上的情况下，将磁珠风干1–5分钟。
      注意：切勿过度干燥磁珠；磁珠颜色应呈深棕色。
    8. 将样本从磁力架上取下，向磁珠中加入53 µL 0.1x TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）以洗脱DNA。通过移液器至少吹打10次充分混匀，室温孵育2分钟。
    9. 将离心管放回磁力架上5分钟，或直至溶液澄清。
    10. 将含有双链cDNA的50 µL上清液转移至新的8联管中。
      注意：本步骤可作为暂停点，样本可在-30 °C条件下保存。
  5. cDNA文库末端修复
    1. 向洗脱所得的双链cDNA样本中加入7 µL末端修复反应缓冲液（绿色）和3 µL末端修复酶混合物（绿色）。
    2. 使用50 µL体积设定通过移液器吹打10次混匀反应体系，避免产生气泡，随后短暂离心。
    3. 将样本放入PCR仪中，程序设置为20 °C孵育30分钟，65 °C孵育30分钟，最后保持在4 °C。
  6. 接头连接
    1. 根据制造商说明书对接头（红色）进行稀释。
    2. 向样本中加入2.5 µL稀释后的接头、1 µL连接增强剂（红色）和30 µL连接主混合液（红色）。
    3. 使用80 µL体积设定通过移液器吹打10次混匀反应体系，避免产生气泡，随后短暂离心。
    4. 将样本放入PCR仪中，20 °C孵育15分钟。
    5. 向样本中加入3 µL尿嘧啶DNA糖基化酶与DNA糖基化酶-裂解酶内切酶VIII混合物（蓝色），并充分吹打混匀。
    6. 将样本重新放回PCR仪中，37 °C孵育15分钟，热盖温度设定为75 °C。
  7. 连接反应后cDNA的纯化
    注意：可使用SPRIselect磁珠或可选的AMpure XP磁珠进行片段大小选择18。
    1. 在进行纯化前30分钟将磁珠预热，并涡旋振荡以重悬磁珠。
    2. 向第3.6.6步所得cDNA样本中加入25 µL重悬后的磁珠，通过移液器至少吹打10次充分混匀。
    3. 室温孵育5分钟。
    4. 将样本管置于磁力架上5分钟，直至溶液澄清，然后将上清液转移至新的8联管中，弃去磁珠。
    5. 向上清液中加入10 µL重悬后的磁珠，通过移液器至少吹打10次充分混匀。
    6. 将样本管置于磁力架上5分钟，直至溶液澄清，然后弃去上清液，切勿扰动磁珠。
    7. 在保持样本处于磁力架上的同时，向含磁珠的离心管中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇，室温孵育30秒。
    8. 移除上清液，并重复步骤3.7.7一次，但此次需小心彻底去除所有残留上清液。
    9. 在样本仍置于磁力架上的情况下，将磁珠风干1–5分钟。
      ​注意：切勿过度干燥磁珠；磁珠颜色应呈深棕色。
    10. 将样本从磁力架上取下，向磁珠中加入17 µL 0.1x TE缓冲液以洗脱DNA。通过移液器至少吹打10次充分混匀，室温孵育2分钟。
    11. 将离心管放回磁力架上5分钟，或直至溶液澄清。
    12. 将15 µL上清液（含目标末端修复后的双链DNA）转移至新的8联管中。
  8. 接头连接后DNA的PCR富集
    1. 向接头连接后的DNA样本中加入25 µL主混合液（蓝色）、5 µL 5'接头引物和5 µL 3'接头引物。通过移液器至少吹打10次充分混匀。
    2. 将样本放入PCR仪中，进行PCR扩增，程序如下：(1) 98 °C预变性30秒，(2) 98 °C变性10秒，(3) 65 °C退火延伸75秒，(4) 65 °C最终延伸5分钟，(5) 4 °C保存；其中步骤(2)和(3)需重复N+2个循环，N为说明书中的RNA起始量。这意味着由于第3.7步中进行了双端片段大小选择，需额外增加两个循环。
      注意：例如，若纯化后的mRNA起始量为8 ng，建议进行9–10个PCR循环；但若为第3.7步中经双端大小选择并连接的cDNA，则建议进行11–12个PCR循环。
  9. PCR扩增文库的纯化
    1. 在进行纯化前30分钟将DNA纯化磁珠预热，并涡旋振荡以重悬磁珠。
    2. 向第3.8.2步所得PCR产物中加入45 µL（0.9x）重悬后的磁珠，通过移液器至少吹打10次充分混匀。
    3. 室温孵育5分钟。
    4. 将样本管置于磁力架上5分钟，直至溶液澄清，然后移除上清液，保留含有DNA的磁珠。
    5. 向含磁珠的离心管中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇，保持样本在磁力架上，室温静置30秒。
    6. 移除上清液，并重复步骤3.9.5一次，但此次需小心彻底去除所有残留上清液。
    7. 在样本仍置于磁力架上的情况下，将磁珠风干1–5分钟。
      注意：切勿过度干燥磁珠；磁珠颜色应呈深棕色。
    8. 将样本从磁力架上取下，向磁珠中加入22 µL 0.1x TE缓冲液以洗脱DNA。通过移液器至少吹打10次充分混匀，室温孵育2分钟。
    9. 将离心管放回磁力架上，室温静置5分钟或直至溶液澄清。
    10. 将20 µL上清液转移至新的8联管中。
    11. 取2.2 µL转移至8联管中，用于文库浓度与质量的检测。
      注意：文库浓度也可通过qPCR检测（见材料表）。
    12. 将bsRNA-seq文库样本在-20 °C条件下保存。

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结果

根据本报告中的实验流程，从细胞系中生成了一系列bsRNA-seq文库19 (图1)。在对细胞系样本进行总RNA纯化并同时进行DNase处理后，通过凝胶电泳和紫外-可见分光光度法（A260/A280）检测RNA质量，随后可进行poly(A) RNA富集。为了评估两次纯化是否能够有效去除大部分核糖体RNA，采用毛细管电泳总RNA检测法对poly(A) RNA的纯化效率进行了分析，该方法可自动计算rRNA污染百分比 (图2)。根据RNA片段峰型图谱及rRNA污染百分比结果可见，在AsPC-1和BxPC-3细胞系中，经过两次纯化的RNA样本的核糖体RNA污染率分别从6.5%降至2.2%，以及从2.6%降至1.1%。在人胰腺癌细胞系中，经过两轮磁珠纯化后，poly(A)富集RNA占总RNA的平均丰度达到2.8 ± 1%。因此，采用寡聚(dT)磁珠结合两次纯化步骤进行poly(A) RNA富集，可显著降低核糖体RNA...

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讨论

本方案中，通过使用标准化组分，实现了多聚(A)富集、亚硫酸氢盐转化及文库构建的详细流程。进一步的测序分析可鉴定目标样本中的mRNA 5-甲基胞嘧啶。

关键步骤在于起始材料——总RNA的质量，因为RNA的降解会影响poly(A) RNA纯化的回收率。在进行poly(A) RNA纯化步骤之前，应小心处理样品，并避免RNase污染。该实验流程的另一个关键环节是文库构建过程中PCR扩增的循环次数。循环次数的选择取决于用于文库构建的经亚硫酸氢盐处理的mRNA量，以及在PCR前步骤中采用单次片段筛选还是双重片段筛选。因此，针对特定样品，需通过预实验并利用毛细管电泳分析PCR产物的片段大小分布，以确定同一细胞系或组织的最佳PCR循环数。

在本实验方案中，采用两轮寡核苷酸(dT)磁珠纯化，以富集和纯化poly(A) RNA，并去除大部分核糖体RNA及其他RNA。此外，也可使用其他方法去除核糖体RNA并保留样本中的其他RNA类型，例如基于寡核苷酸的rRNA耗竭法26。随后，可对其他RNA类型中存在...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到中国台湾国家科学与技术委员会的资助。[NSTC 111-2314-B-006-003]

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 2100 电泳生物分析系统Agilent, Santa Clara, CARNA 质量检测
AMpure XP 磁珠Beckman CoulterA63881纯化 DNA
Bioanalyzer DNA 高灵敏度检测试剂盒Agilent, Santa Clara, CA5067-4626DNA 质量检测
Bioanalyzer RNA 6000 Pico 试剂盒Agilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA 质量检测
DiaMag02 - 磁力架Diagenode, Denville, NJB04000001辅助文库构建
DiaMag1.5 - 磁力架Diagenode, Denville, NJB04000003辅助 poly(A) RNA 纯化
Dynabeads mRNA DIRECT 纯化试剂盒Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011poly(A) RNA 纯化；洗涤缓冲液 1 和洗涤缓冲液 2
乙醇J.T.Baker64-17-5
EZ RNA 甲基化试剂盒Zymo, Irvine, CAR5002亚硫酸氢盐处理
萤火虫荧光素酶 mRNAPromega, Madison, WI, USAL4561内参对照序列 
KAPA 文库定量试剂盒Roche, SwitzerlandKK4824文库定量
Nanodrop 分光光度计Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA总 RNA 定量检测
NEBNext Illumina 多重引物（Index Primer Set1）New England Biolabs, Ipswich, MAE7335S文库构建
NEBNext Ultra figure-materials-1 定向 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina）New England Biolabs, Ipswich, MAE7760S文库构建
无核酸酶水Thermo Fisher ScientificAM9932
P2 移液器Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 荧光计 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MARNA 定量检测
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854DNA 定量检测
Qubit RNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852RNA 定量检测

参考文献

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