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整体荧光成像 原位 用于研究精子发生过程的杂交技术 按蚊属 蚊子

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DOI：

10.3791/65356

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2023年5月26日

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

鉴于其结构简单， 按蚊属 睾丸是研究精子发生过程的良好细胞学模型。本方案描述了完整组织荧光染色的方法 原位 杂交技术，用于研究该生物过程以及携带参与精子生成基因突变的转基因品系的表型。

摘要

精子发生是一个复杂的生物学过程，期间二倍体细胞经历连续的有丝分裂和减数分裂，并伴随显著的结构变化，最终形成单倍体的精子。除了其生物学意义外，研究精子发生对于理解和开发基因驱动技术以及合成型性别比例扭曲因子等遗传技术至关重要。这些技术分别通过改变孟德尔遗传规律和精子性别比例，有望用于控制害虫昆虫的种群数量。这些技术在实验室环境中已显示出极大的应用前景，并可能被用于调控野生种群 按蚊属 蚊子，疟疾的传播媒介. 由于睾丸解剖结构的简单性及其医学重要性， Anopheles gambiae，撒哈拉以南非洲地区主要的疟疾传播媒介，是研究精子发生过程的良好细胞学模型。本方案描述了如何进行整体荧光染色 原位 杂交（WFISH）可用于研究精子发生过程中细胞核结构的显著变化，通过使用特异性标记X和Y染色体的荧光探针实现。常规FISH通常需要破坏生殖器官以暴露有丝分裂或减数分裂染色体，从而允许用荧光探针对特定基因组区域进行染色。WFISH则能够在保持睾丸天然细胞学结构的同时，实现对靶向重复DNA序列的荧光探针信号的良好检测。这使得研究人员能够沿器官结构追踪减数分裂细胞中染色体行为的变化，其中该过程的各个阶段均可被清晰区分。该技术可能特别适用于研究染色体减数分裂配对，以及探究与合成性比偏移因子、杂交雄性不育和参与精子发生相关基因敲除相关的细胞学表型。

引言

疟疾对全球人类的健康与福祉造成了巨大负担。根据世界卫生组织（WHO）2021年的估计，疟疾导致了619,000人死亡，其中96%发生在撒哈拉以南非洲1。该疾病由按蚊属（Anopheles）的蚊子传播，在撒哈拉以南非洲，冈比亚按蚊（Anopheles gambiae，An. gambiae）、科卢齐按蚊（Anopheles coluzzi，An. coluzzi）和阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis，An. arabiensis）在疟疾传播中起着不成比例的重要作用，占全球疟疾病例的95%。依赖杀虫剂和抗疟药物等传统方法的防控项目已挽救了数百万人的生命；然而，近年来对这些防控手段的抗性不断上升，对其有效性构成了挑战1,2。此外，由于COVID-19大流行所实施的限制措施影响了关键疟疾防控干预措施的可及性，据2022年世界卫生组织《世界疟疾报告》指出，这已导致疟疾发病率上升1。在过去二十年中，实验室已开发出多种针对 Anopheles蚊子的新型遗传防控方法3,4,5,6,7,8,9,10。在这些策略中，基于基因驱动系统（GDSs）和合成性性别比例扭曲系统（SDs）的方法显示出良好前景。基因驱动系统依赖于以极高频率传递一种遗传修饰，该修饰可影响雌性生育力或干扰疟原虫在蚊体内的生命周期5,11,12。而性别比例扭曲系统则通过使蚊子后代的性别比例偏向雄性发挥作用，随着时间推移，由于缺乏雌性，目标种群将最终崩溃4,6,13。这些遗传系统的主要组分主要作用于蚊子的生殖器官，在减数分裂后，配子、卵子和精子在这些器官中生成14。

在本方案中，采用细胞遗传学技术的最新进展来研究精子发生过程 An. gambiae 重点关注染色体的行为 原位 蚊子睾丸的结构及其内部发生的生物学过程此前已通过多种细胞学方法进行了研究，例如免疫荧光、荧光报告转基因、DNA和RNA荧光标记 原位 荧光原位杂交（FISH）15,16,17,18,19,20；器官呈纺锤形，下极连接一条与雄性附属腺相连的输精管。在上极，生殖系干细胞微环境增殖并分化为精原细胞，这些精原细胞嵌入由体细胞形成的精 cyst 内。经过多轮有丝分裂后，精原细胞分化为初级精母细胞并进入减数分裂。在前期，常染色体和性染色体分别与其同源染色体配对，并发生交叉互换。减数分裂完成后，产生圆形的单倍体精子细胞，随后进入精子形成阶段，最终发育为成熟的单倍体精子。在此过程中，细胞质被去除，核染色质高度浓缩，鞭毛从细胞核基部伸出21,22 (图1 和 图2).

一般来说，精子形成过程始于蛹期中期，到蛹期晚期可在精巢贮精囊中检测到成熟的精子23精子囊的成熟过程在成年期持续进行23,24,25。在 按蚊属 睾丸中，通过观察每个精母细胞囊中细胞的细胞核形态，可轻松识别精子发生的各个阶段。图2）。整体荧光 原位 杂交（WFISH）技术，如本方案所述，可实现对染色体特定区域的特异性标记，并在精子发生过程中对其进行追踪，同时保持器官的天然结构以及细胞核的原始位置；相较于标准的DNA FISH方法（通常需压碎组织，易造成结构损伤），该技术具有明显优势19在本实验方案中，采用荧光探针标记性染色体上的重复序列，从而追踪其在精子发生过程中从二倍体分裂细胞到成熟单倍体精子细胞的行为变化。全染色体荧光原位杂交（WFISH）特别适用于研究性染色体的减数分裂配对，以及探究与合成性比扭曲因子、杂交雄性不育、精子发生相关基因敲除等现象相关的细胞学表型4,19,26,27.

鉴于其作为疟疾传播媒介的作用， 按蚊属 蚊子是越来越多遗传性媒介控制策略的目标，这些策略通常作用于这些生物的生殖器官。已产生多种蚊子突变体和细胞学表型，其研究需要借助新的细胞学技术。26,27,28,29本研究中描述的方法有助于深入理解精子发生过程，以及控制疟疾传播蚊虫的遗传策略背后的细胞学机制。

方案

1. DNA探针标记

注意：以下是用于生成特异性标记冈比亚按蚊（An. gambiae）性染色体的荧光DNA探针的技术步骤。

  1. 使用PCR进行探针标记
    1. 从蛹或成年雄性个体中提取基因组DNA，用于标记X或Y染色体，采用市售的基因组DNA提取试剂盒（参见 材料表).
    2. 配制PCR反应混合物：200 ng基因组DNA，0.05 mM未标记核苷酸（dATP、dCTP、dGTP），0.015 mM dTTP，1 μL荧光标记的dUTP（Cy3、Cy5或其他荧光染料），以及各50 pmol的正向引物和反向引物表1)，5 µL 10x PCR缓冲液，以及10 U Taq DNA聚合酶（参见 材料表).
    3. 对18S rDNA和卫星序列AgY53B进行标记表1), 使用以下PCR参数进行PCR反应：95 °C预变性10分钟；35个循环（95 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸45秒）；72 °C最终延伸5分钟；最后在4 °C保存。
      注意：为了通过PCR标记方法获得理想的探针浓度（约1 µg/5 µL），这对于成功的全染色体荧光原位杂交（WFISH）至关重要，PCR反应必须具有高效率。因此，强烈建议在标记探针前，先检测所选扩增引物的有效性。此外，在PCR反应中设置阳性对照（不加荧光标记的dUTP）有助于验证标记反应的有效性。
    4. 将探针置于 -20 °C 避光保存。
  2. 获得3'端荧光标记的寡核苷酸探针
    1. 获取市售的荧光寡核苷酸探针，通过在核苷酸序列的3'端添加Cy3或Cy5荧光染料（或其他任何荧光染料）对寡核苷酸进行修饰（参见 材料表）。参见引物/寡核苷酸 表1 用于标记Y连锁卫星AgY477-AgY53B连接区域和Contig_240中X连锁卫星的参考序列。
      ​注意：3'端标记的寡核苷酸浓度不涉及技术障碍，因为用户通常可在购买前自行选择。我们建议在杂交缓冲液中稀释约800 ng寡核苷酸探针溶液，以实现使用寡核苷酸探针的高效标记。X和Y特异性寡核苷酸探针此前已被Liang和Sharakhov用于WFISH。19，参考序列可在 表1.

2. 杂交溶液的制备

注意：步骤 1 中生成的荧光探针必须加入能够与目标序列杂交的化学溶液中。

  1. 荧光前探针沉淀 原位 杂交
    1. 向一个1.5 mL离心管中加入5 µL标记的DNA探针（若通过PCR标记法获得）或步骤1中制备的2.2 µL 3'修饰寡核苷酸探针（约800 ng探针）以及5 µL鲑鱼精子DNA（参见 材料表将针对不同基因组区域的探针混合于同一管中，并在后续步骤中将其作为单一溶液使用。
    2. 加入0.1体积的3 M醋酸钠和2体积的100%乙醇，使DNA探针沉淀。在−20 °C下孵育至少2.5小时（延长−20 °C孵育时间可提高最终得率）。此步骤中，探针也可在离心前于−20 °C过夜保存。
    3. 在 17,000 x g 条件下离心 g 4 °C 下孵育 20 分钟，去除乙醇，将沉淀物在室温避光条件下空气干燥约 20 分钟。
  2. 杂交溶液
    1. 在进行睾丸解剖（步骤3）之前，于1.5 mL离心管中混合以下试剂以配制杂交缓冲液：500 µL 甲酰胺、0.2 g 硫酸葡聚糖、100 µL 20×柠檬酸钠盐水（SSC）和200 µL 无菌H20（参见 材料表涡旋混合杂交液1分钟，于37 °C孵育30分钟，使硫酸葡聚糖充分溶解。
    2. 将2.1.3步骤中获得的沉淀物溶解于20–30 µL杂交缓冲液中（涡旋约1分钟，短暂离心，并将试管置于37 °C避光保存），以获得杂交溶液。

3. 睾丸解剖与固定

  1. 在室温（RT）下解剖21 至少取20个左右的蛹期或1日龄成虫的精巢，置于无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中，并转移至含有新鲜1× PBS溶液液滴的洁净载玻片上。
  2. 使用P1,000宽孔滤芯吸头或解剖针尖将睾丸从1x PBS液滴转移至含有3.7%多聚甲醛（溶于含0.1% Tween-20的1x PBS缓冲液，即PBST）的胚胎培养皿中，室温孵育10分钟。
  3. 在室温下用1×PBST洗涤睾丸5分钟。将睾丸置于0.1 mg/mL RNAse A中孵育（参见 材料表在37 °C下，用无菌1x PBS稀释，孵育30分钟。
  4. 移除RNA酶溶液，加入通透溶液（1% Triton/0.1 M HCl溶于1x PBST），室温孵育10分钟。
    注意：蛋白酶K可用作穿透剂，以10 µg/mL的终浓度加入1x PBST中，以增强睾丸组织的通透性。
  5. 用1×PBST在室温下洗涤睾丸，每次5分钟，共洗两次。

4. 杂交

注意：本节描述了最终步骤 原位 杂交。

  1. 洗涤步骤（步骤 3.5）后，将睾丸转移至 1.5 mL 离心管中，加入 20–30 µL 含有先前制备探针（步骤 2.2.2）的杂交溶液。用移液器枪头轻轻混匀溶液。在进行下一步操作前，轻轻弹击管壁 5 次。
  2. 在 75 °C 下孵育 5 分钟，以实现 DNA 变性。
  3. 在 37 °C 下过夜孵育（如有可能，以低于 100 rpm 的速度振荡），以进行 DNA-DNA 杂交。
  4. 使用 P1,000 宽口滤芯枪头将睾丸转移回胚胎培养皿中，并用预热至 50 °C 的 2x SSC 溶液洗涤 5 分钟。
    注意：杂交步骤后，需进行一次最终洗涤步骤，使用 2x SSC 溶液；该步骤对于去除器官组织内未杂交探针引起的背景信号具有重要作用。若存在较强背景信号，建议重复最终洗涤步骤。
  5. 去除 2x SSC 溶液，使用市售含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质（见材料表），将睾丸置于磨砂玻片上，加盖盖玻片密封剂封片，并在室温避光条件下孵育至少 2 小时。
  6. 进行共聚焦成像。可使用 40x 或 63x 油镜观察整个睾丸。若进行 z 轴层扫，建议设置 z 轴步长为 1.25 µm。

结果

在本研究中，WFISH 被用于分析An. gambiae精子发生过程中染色体的行为。应用该方案的第一个关键步骤是获取解剖后形态学改变较少的睾丸组织。成功进行睾丸解剖需要掌握蚊子的基本解剖学知识，以下提供了一些相关操作指导。在按蚊（Anopheles）中，成熟的睾丸位于蛹期和成虫期的第六腹节内21。如图1所示，输精管将睾丸与位于腹部末节的雄性附属腺体（MAGs）相连。MAGs 进一步连接到一条独特的射精管，将精子和精液输送至交配器官及雄性生殖装置的外部结构21。整个雄性内部生殖装置的解剖方法可根据蚊子所处的发育阶段而有所不同。在蛹期，可通过体视显微镜透过较透明的体壁，在腹部腹面第六节附近清晰识别睾丸（图1）。为分离睾丸，可使用一对解剖针切下包含第六腹节的腹部下部，并将其转移至一滴新鲜的1x PBS中。随后去除最后一节腹段，再用解剖针轻轻施压，即可将整个生殖装置从腹部挤出。对于成年雄性蚊子的睾丸解剖，首先需将整个腹部置于一滴新鲜的1x PBS中，然后拉出携带抱握器（即雄性交配结构）的最后一节腹段（图1）。此时，MAGs 的下部应会随之露出，因其呈黄色而易于识别。接着可在1x PBS液滴中借助解剖针或镊子缓慢拉出整个雄性生殖装置，直至看到连接在输精管上的成对睾丸。在进行固定前，应于输精管下部附近将其切断，以将睾丸与其他雄性生殖结构分离（图1）。

蛹期或成年雄性蚊虫的年龄是一个重要考虑因素，具体取决于所研究的精子发生阶段。在冈比亚按蚊（An. gambiae）中，精子发生始于早期/中期蛹阶段，并持续贯穿个体整个生命周期24。在化蛹后3小时至10小时内，睾丸中主要为前期减数分裂和减数分裂阶段（减数分裂前期、减数分裂过程），精子细胞DNA相对未浓缩，且尚未形成成熟精子。晚期蛹和1日龄成虫的睾丸中，减数分裂前、减数分裂及减数分裂后各阶段比例较为均衡（图2 和 图3）。而在4日龄以上的成虫中，减数分裂前阶段和精母细胞囊数量减少，睾丸主要被储精囊中储存的成熟精子所占据。

为了研究性染色体在精子发生不同阶段的行为，对晚期蛹期解剖获得的睾丸进行WFISH分析，以充分代表整个发育过程。为追踪这些染色体的行为，使用了特异性识别仅位于X或Y染色体上的重复序列的荧光探针。荧光探针可通过PCR方法制备，或以3'端标记的寡核苷酸形式从商业途径获得。使用长度为 >建议使用40 bp的探针长度，以确保荧光寡核苷酸探针具有良好的信号检测效果。根据我们的经验，3'端标记的寡核苷酸探针在信号检测方面优于PCR标记的探针。此外，目标序列的拷贝数也可能影响WFISH的检测效率。若标记不成功，建议采用PCR标记法对更长的片段进行标记，或设计多个针对目标区域的特异性寡核苷酸探针。

目前的方法基于使用穿透液（1% Triton/0.1 M HCl 溶于1x PBST），可实现良好的睾丸组织通透性和探针渗透，从而获得成功的杂交反应。针对性染色体重复序列的寡核苷酸探针可根据 Hall 等人对重复元件的广泛表征进行设计20。此外，可利用 RedKmer 分析流程等生物信息学平台获取特异性针对X或Y染色体连锁重复元件的一致性序列30。需要注意的是，性染色体探针可靶向卫星序列和逆转录转座子等重复元件，其对X或Y染色体的杂交效率可能因所研究物种的不同而有所差异20,31,32。如图3所示，探针具有良好的杂交信号且背景较低，可在整个精子发生过程中清晰显示靶向染色体。标记的性染色体配对现象可在减数分裂前及减数分裂阶段观察到，随后可在减数分裂产生的单倍体细胞核染色体中分别检测到X或Y染色体。接着，可追踪携带X或Y染色体的精子细胞在整个精子形成过程中的变化，该过程以不同程度的DNA浓缩为特征，直至最终形成箭头状的成熟精子。在本实验设置中，采用共聚焦显微镜Z轴层扫技术获取该过程中细胞三维空间结构的信息（视频1）。

昆虫解剖学显微图像：背侧与腹侧视图，标注部分A-D。
图1蛹期及1日龄成虫中解剖获得的睾丸 Anopheles gambiae 雄性 (A晚期蛹阶段解剖的腹部，显示睾丸位于第六腹节附近。睾丸可通过体壁观察到，呈褐色结构，分布于腹部两侧（箭头所示）。B蛹期解剖的睾丸，显示成熟的睾丸（1） 输精管 （2）、MAGs（3）和射精管（4）。C) 切除基部抱器节后，从1日龄成年雄性个体分离的腹部。通过施加轻柔压力，可将附腺从腹部挤出（白色箭头）。D) 从1日龄成年雄性个体解剖获得的雄性内部生殖器官。白色箭头指示成熟精子所在的位置，精子在睾丸基部呈现为白色团块状聚集物。比例尺：(A,C) 200 µm; (B,D) 100 µmI 至 VIII 的罗马数字表示腹部节段。 请点击此处以查看此图的放大版本。

精子发生过程示意图，包含细胞阶段：干细胞、精母细胞、减数分裂、精子细胞。
图 2：Anopheles gambiae 精子发生过程示意图。左侧图像显示经整体DAPI染色后的An. gambiae晚期蛹期睾丸。右侧为便于观察的示意图。通过观察细胞核形态和染色质凝集程度，可较为清晰地追踪从二倍体细胞到单倍体精子的各个精子发生阶段。干细胞微环境位于器官顶端，此处开始分化为精原细胞。精原细胞经有丝分裂后数量增加（绿色细胞），精母细胞囊（spermatocysts）体积随之增大（黄色细胞）。经过多轮有丝分裂后，精原细胞分化为初级精母细胞（蓝色细胞）。初级精母细胞的细胞核相对较大，明显区别于其他阶段的细胞，是进行减数分裂的细胞类型。通过观察不同减数分裂阶段的染色体形态，可识别处于减数分裂过程中的细胞；即使在较低放大倍数下，也可观察到交叉结构（chiasmata）和中期染色体。在早期蛹期解剖的睾丸中，减数分裂前的各阶段细胞占比较高。经过第一次和第二次减数分裂后，形成精子细胞，通常位于睾丸中部。精子细胞的细胞核在形态上具有一定变异，从圆形到箭头状不等。随后精子细胞进入精子形成期（spermiogenesis），在此过程中细胞核开始凝集，结构逐渐转变为箭头状小点。蚊虫羽化后性成熟时，含有成熟精子的精母细胞囊可占据睾丸大部分体积，而处于其他发育阶段的精母细胞囊则相应减少。比例尺：20 µm。星号（*）表示睾丸的顶端区域。请点击此处查看该图的放大版本。

染色体分析中细胞核的荧光显微镜图像；示意图突出显示DNA相互作用。
图3：对来自晚期蛹期的冈比亚按蚊（An. gambiae）睾丸进行的WFISH分析。采用针对X染色体（Contig_240）和Y染色体（特异性识别AgY53B的寡核苷酸探针）的探针进行WFISH实验。(A) WFISH可用于追踪性染色体在精子发生过程中从二倍体细胞到单倍体精子的动态行为。在此图像中，可以清楚观察到细胞核在精子发生过程中经历的显著形态变化。通过标记性染色体，可区分二倍体细胞与单倍体细胞。在二倍体细胞中，性染色体信号位于同一细胞核内；而在单倍体细胞（精子细胞和精子）中，由于减数分裂的减数分裂过程，性染色体信号分离至不同的细胞核中。(B,C) 图(A)中睾丸的高倍放大图像（63倍），沿Z轴不同位置采集。白色虚线框表示成像区域。(B) 精母细胞向精子细胞过渡阶段，显示单倍体细胞的形成以及性染色体信号分离至不同细胞核的过程。(C) 单倍体精子细胞向成熟精子过渡阶段，此阶段表现出细胞核浓缩程度的变化；与精子细胞相比，成熟精子具有更高程度的浓缩和更细长的形态。比例尺：(A)，30 µm；(B,C)，10 µm；灰色：DAPI染色。 请点击此处查看该图的放大版本。

靶序列引物序列与寡核苷酸探针共识序列参考文献
Contig_240 (X)5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		19
AgY53B (Y)5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		本研究
AgY477-
AgY53B
连接区
(Y)		5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		19
18S rDNA (X)F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		19
AgY53B (Y)F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		19

表1：特异性针对冈比亚按蚊（An. gambiae）X或Y染色体的寡核苷酸探针列表。

视频 1：对从晚期蛹阶段解剖获得的冈比亚按蚊（An. gambiae）睾丸进行全视野荧光原位杂交（WFISH）后生成的三维图像序列。 为获得精子发生过程的三维表征，可对结构改变较少的睾丸样本进行共聚焦三维成像。在本研究中，使用63倍或40倍油镜，以每1.25 µm采集一层光学切片的方式获取图像序列，以确保不丢失细胞三维空间结构的信息。灰色：DAPI染色，黄色：Contig_240（X染色体），品红色：AgY53B（Y染色体）。请点击此处下载该视频。

讨论

通常，FISH 实验方案需要压碎目标器官以实现染色体染色，这会导致该器官内细胞空间排列信息的丢失。33本方案描述了如何研究精子发生等生物过程 原位 同时保持睾丸的完整天然结构及其内部细胞学组织。针对不同DNA重复元件的探针，这些元件在性染色体中尤为富集20，可同时用于揭示精子成熟的动态过程。根据睾丸解剖的时间不同，WFISH 可用于研究蚊虫发育过程中精子发生的各个阶段。WFISH 适用于研究特定现象，例如杂交不亲和性，该现象在 按蚊属 蚊子出现减数分裂缺陷，如减数分裂前失败和性染色体不分离，是导致该现象的原因。19,34,35除了生物学角度之外，精子发生也是多种用于控制害虫昆虫的遗传策略的目标，例如 按蚊属 蚊子。在此背景下，X染色体连锁的rDNA位点 An. gambiae 已被用作开发合成型性别比例扭曲因子的靶点，该因子通过损伤携带X染色体的精子，使后代性别偏向雄性4,8,13.

该技术模拟了已在包括蚊子在内的多个分类群中发现的自然性别比例减数分裂驱动机制，但这些机制目前仍 poorly被理解28,36,37,38,39,40,41。WFISH 为研究这一现象提供了机会，并为进一步优化或改进基于性别扭曲的遗传策略铺平了道路，例如通过提供有关精子发生细胞学如何受性染色体切割靶位点选择影响的信息。尽管根据我们的经验，WFISH 具有较高的成功率，但仍可能出现失败。这可能是由于组织通透化程度不足所致，可通过延长渗透溶液的孵育时间来克服。此外，在通透化步骤中可使用蛋白酶 K。在某些情况下，我们观察到探针渗透水平不均，精母细胞核中的信号较强，而在减数分裂和精子形成阶段的信号较弱或缺失。这可能与不同细胞阶段间通透化程度的差异有关。此外，当使用靶向高拷贝数 DNA 序列的荧光探针时，WFISH 被证明具有重要价值。而在靶向单拷贝基因时，信号检测可能不足以被识别。此时必须整合信号放大方法，例如酪胺信号放大技术（tyramide signal amplification, TSA）42。

该方案可与免疫染色或携带生殖系特异性荧光标记的转基因报告品系联用16,18，从而提供有关蛋白质定位和基因表达的原位信息。in situ。本文将WFISH描述为一种用于研究按蚊（Anopheles）精子发生的技术；然而，鉴于雄性生殖器官解剖结构的相似性，该方案也可应用于其他在疾病传播中起作用的蚊种。同样，该技术也可用于研究雌性配子发生。此外，还可利用该技术对特定器官或组织（例如易受寄生虫侵入的蚊子中肠）或非典型遗传背景（如杂交蚊中的遗传背景）进行细胞学研究43。此外，该技术未来有望拓展至双翅目（Diptera）内的其他生物。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由比尔及梅琳达·盖茨基金会（Bill & Melinda Gates Foundation）和开放慈善基金会（Open Philanthropy）的资助支持。我们感谢伦敦帝国理工学院光学显微成像中心（Facility for Imaging by Light Microscopy, FILM）提供的显微成像分析支持。图2使用Biorender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amersham CyDye 荧光核苷酸，Cy3-dUTPCytivaPA53022
Amersham CyDye 荧光核苷酸，Cy5-dUTPCytivaPA55022
ART宽孔滤芯吸头ThermoFisher Scientific2079GPK
CytoBond 可移除盖玻片封固剂SciGene2020-00-1
来自Leuconostoc spp.的葡聚糖硫酸钠盐Sigma-AldrichD8906-5G
DNeasy 血液 & 组织试剂盒 Qiagen69504
胚胎培养皿VWR70543-30
乙醇，分子生物学级Sigma-Aldrich51976
甲酰胺ThermoFisher Scientific17899
GoTaq G2 DNA聚合酶PromegaM7841
盐酸，37%Sigma-Aldrich320331
显微镜载玻片，SuperFrostVWR 631-0114
PBS（10倍浓度），pH 7.4ThermoFisher Scientific70011044
Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇ThermoFisher Scientific28906
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP36941
RNase A/T1 混合物ThermoFisher ScientificEN0551
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 混合物PromegaU1330
乙酸钠溶液ThermoFisher ScientificR1181
SP8 倒置共聚焦显微镜Leica
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure 鲑鱼精子DNA溶液ThermoFisher Scientific15632011
UltraPure SSC 20xThermoFisher Scientific15557044
引物序列
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[荧光染料]		Eurofins GenomicsContig_240（X）
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[荧光染料]		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[荧光染料]		Eurofins GenomicsAgY477-
AgY53B
连接
区域（Y）
F：AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R：TCCACTTGATCCTTGCAAAA		Eurofins Genomics18S rDNA（X）
F：CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R：GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)

参考文献

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
  2. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  3. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
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