纳米级红外光谱技术在多相聚合物体系研究中的进展

摘要

本方案描述了原子力显微镜与纳米级红外光谱技术的应用，用于评估光热型纳米级红外光谱在三维多聚合物样品表征中的性能。

摘要

多相聚合物体系包含局部区域，其尺寸可从几十纳米到数微米不等。通常采用红外光谱法评估其组成，该方法可提供被测体积内各种材料的平均指纹信息。然而，该方法无法揭示材料中各相排列的具体细节。此外，两个聚合物相之间的界面区域（通常处于纳米尺度范围）也难以表征。光热纳米红外光谱技术利用原子力显微镜（AFM）的高灵敏探针，监测材料在红外光激发下的局部响应。尽管该技术适用于探测小尺度特征（例如在洁净金表面上的单个蛋白质），但对三维多组分材料的表征仍具有挑战性。这主要是因为受激光在样品上的聚焦情况以及聚合物组分热学性质的影响，发生光热膨胀的材料体积相对较大，远超过AFM针尖所探测的纳米尺度区域。本文以聚苯乙烯（PS）微球和聚乙烯醇（PVA）薄膜为例，评估光热纳米红外光谱在表面分析中的空间响应范围，并研究PS在PVA薄膜中不同位置对纳米红外成像结果的影响，同时获取相应的光谱数据。最后，针对含有嵌入式聚合物结构的复杂体系的表征需求，展望了光热纳米红外光谱技术未来的发展方向。

引言

原子力显微镜（AFM）已成为以纳米级分辨率成像和表征多种样品形貌的必备工具^1,2,3。通过测量AFM悬臂因尖端与样品表面相互作用而产生的偏转，已发展出用于局部刚度测量和针尖-样品粘附力的纳米级功能成像方法^4,5。对于软凝聚态物质和聚合物分析，探索局部区域纳米力学和纳米化学性质的AFM测量备受关注^6,7,8。在纳米级红外（nanoIR）光谱技术出现之前，通常对AFM针尖进行化学修饰，以通过AFM力曲线判断不同区域的存在，并推断针尖-样品相互作用的本质。例如，该方法曾被用于揭示经环己烷处理的聚苯乙烯-嵌段-聚（丙烯酸叔丁酯）嵌段共聚物薄膜表面微区在低于50 nm尺度下的转变行为⁹。

将红外（IR）光与原子力显微镜（AFM）相结合，已对高分子科学领域产生了重大影响⁶。传统的红外光谱法是一种广泛用于研究聚合物材料化学结构的技术^10,11，但由于待测区域尺寸远小于用于探测样品的红外光束尺寸，该方法无法提供关于各个相态及界面行为的信息。这一问题同样存在于红外显微光谱中，因其受限于光学衍射极限⁶。此类测量对红外光激发的整个区域内的信号进行平均；而探测区域内纳米尺度相态所产生的信号，要么在后期处理中呈现出需要解卷积的复杂谱图特征，要么因信号强度低于可检测水平而丢失。因此，开发具备纳米级空间分辨率和高红外灵敏度的工具，对于探索复杂介质中的纳米级化学特征至关重要。

为实现纳米红外（nanoIR）光谱技术，已开发出多种方案：最初采用金属原子力显微镜（AFM）探针作为纳米天线^12,13，而近期则利用AFM悬臂检测样品在红外光照下产生的光热膨胀变化^12,14,15。该方法使用脉冲式可调谐红外光源，将其调谐至被测材料的某一吸收峰，使样品吸收辐射并发生光热膨胀。此技术特别适用于有机物和聚合物材料。脉冲激发使AFM悬臂在与样品表面接触时能够检测到以振荡形式表现的信号。通过监测系统在频率谱中某一接触共振模式的振幅随光照波长的变化，即可获得AFM探针下方材料的nanoIR吸收光谱¹⁵。nanoIR成像与光谱的空间分辨率受到材料光热膨胀多种效应的限制。研究表明，采用接触模式AFM的光热nanoIR光谱技术可实现优于50 nm空间分辨率的材料振动吸收光谱测量¹⁴，近期工作已成功检测到α-突触核蛋白的单体与二聚体^16,17。然而，针对不同构型下异质聚合物材料的nanoIR测量性能，尤其是有限尺寸吸光体嵌入多种聚合物薄膜内部的情况，其定量研究仍较为有限。

本文旨在构建一种具有已知尺寸嵌入特征的聚合物组装体，用于评估纳米红外（nanoIR）在表面分析过程中光热膨胀的灵敏度及空间分辨率。该实验方案涵盖了在硅基底上制备聚乙烯醇（PVA）聚合物薄膜，以及将三维聚苯乙烯（PS）微球放置于PVA薄膜表面或嵌入其中，从而形成模型体系。文中描述了纳米红外成像与光谱测量方法，用于评估同一PS微球位于PVA薄膜表面或下方时所产生的信号，并分析微球位置对纳米红外信号的影响。同时讨论了评估纳米红外图谱中微球空间占位范围的方法，并考虑了多个参数的影响。

方案

1. 制备聚乙烯醇（PVA）溶液

1. 称取水和PVA聚合物颗粒（参见材料表），按重量比配制10 mL、20% PVA的水溶液。
2. 将水置于玻璃器皿中，在设定为100 °C的加热板上加热。
3. 将PVA聚合物颗粒加入已加热的水中，并放入磁力搅拌子。
4. 将温度降至80 °C，持续搅拌直至PVA完全溶解。
5. 覆盖玻璃器皿口部，防止污染。
6. 待PVA完全溶解后，将20% PVA溶液转移至合适的储存容器中，在室温下保存。

2. 准备聚乙烯醇（PVA）包被的硅（Si）晶圆

1. 将硅（Si）晶圆（参见材料表）切割成约 10 × 10 mm² 的正方形。
2. 使用异丙醇清洗 Si 基底，并使其自然干燥。
3. 将清洁的 Si 晶圆放置在旋涂仪的卡盘上（参见材料表）。
   1. 在 Si 基底中心滴加约 10 µL 的 PVA 溶液，尽量避免产生气泡。
   2. 以每分钟 1,500 转（rpm）的速度旋涂 30 秒，在 Si 基底上形成均匀的 PVA 薄膜。
      注意：指定的液体体积和旋涂参数可在基底表面形成一层厚度均匀的 PVA 膜，该厚度足以防止在旋涂完成后至下一步将 PS 微球转移至 PVA 表面期间薄膜过快干燥。
4. 从旋涂仪上取下样品，并将其放入洁净的样品容器中，以防止在转移 PS 微球前受到污染。

3. 将PS微球放置到PVA包被的表面

1. 使用异丙醇清洁硅基底，并使其干燥。
2. 用移液器将1 µL悬浮于水中的聚苯乙烯（PS）微球滴加到基底中心。
3. 将样品置于含有膨润土干燥剂的储存容器中，使水分自然蒸发。
   注意：此步骤通过减少湿度暴露来保护样品。
4. 将涂有聚乙烯醇（PVA）的基底（步骤2.4）和已干燥PS微球的基底（步骤3.3）置于光学显微镜下观察。根据微球尺寸大小，单个微球可能通过普通双目镜即可观察，或需更高光学放大倍数。
5. 使用超细镊子轻轻松动微球（参见材料表）。用细毛画笔收集少量松散微球，轻敲画笔毛尖，使微球散落到新鲜涂覆PVA的晶圆表面。多次扫动可使微球在刷毛间聚集。轻敲画笔毛顶端，扰动PS微球粉末，使其释放到具有粘性的PVA表面。
   注意：必须使用高质量且洁净的画笔，以避免纤维或污染物落入PVA薄膜表面。此步骤操作需迅速，以防PVA完全干燥。
6. 重复此步骤，直至通过光学显微镜检查确认单个PS微球已牢固附着于PVA表面。
7. 将样品存放在洁净容器中，使其完全干燥。
   注意：在进行后续分析前，应确保样品充分冷却并完全干燥。可通过原子力显微镜（AFM）高度测量或表面轮廓仪测量评估多层PVA薄膜的厚度。

4. 进行原子力显微镜表征的样品加载

注意：所述方案基于 nanoIR2（见材料表）平台的标准操作程序，但应根据用于测量的原子力显微镜（AFM）型号进行相应调整。

1. 使用金属原子力显微镜（AFM）载盘和粘附标签，将PVA和PS微球样品固定到AFM载物台上，确保样品牢固地附着在样品支架上。
2. 将nanoIR探针（例如FORTGG）安装到AFM探针支架上。
   ​注意：AFM悬臂梁长度为225 µm，宽度为27 µm，厚度为2.7 µm，针尖半径小于10 nm。悬臂梁两侧均镀有45 nm厚的金膜，以限制其对样品顶部红外照射的响应（参见材料表）。进行nanoIR光谱测量时，建议使用此前储存在无聚二甲基硅氧烷环境中的悬臂梁。
3. 通过调节激光对准旋钮（激光位置的x和y方向调节以及探测器位置的垂直调节），将读出激光对准悬臂梁自由端。
   1. 最大化探测器的SUM信号。
   2. 旋转偏转调节旋钮，调整探测器位置，使激光对准AFM读出系统的位置敏感探测器中心，对应垂直偏转信号约为~0 V。
4. 点击AFM“探针”控制面板中的加载图标。
   1. 按照向导界面中的提示操作。使用聚焦箭头确定nanoIR悬臂梁的焦平面。利用XY位移控制将悬臂梁置于屏幕中央（与白色十字对齐）。
   2. 接着，点击聚焦箭头，找到样品表面的焦平面。
   3. 利用系统的光学视图和XY位移控制，将悬臂梁针尖定位至目标微球上方，然后点击下一步。
   4. 在接近界面中，将“standoff”设置为50 µm，然后点击仅接近。
5. 启动接触程序，使针尖接近样品表面以进行成像。

5. 对多聚合物样品进行形貌和纳米红外成像

1. 在标准“接触模式”下获取形貌图像。一旦设定悬臂相对于聚苯乙烯微球的位置，点击AFM“探针”控制面板中的engage图标以启动接近过程。本研究中全程采用0.2 V的偏转差作为engage设定值，对应的作用力约为100 nN。
   在AFM“扫描”控制面板中，将扫描速率设为0.8 Hz，设定用于成像的扫描尺寸（高度和宽度），以及每行的点数和每幅图像的行数（本实验中使用512 × 512）。点击“扫描”以获取形貌图像。
   注：通过测定悬臂与蓝宝石基底相互作用时获得的偏转-距离曲线的斜率，确定偏转灵敏度（单位：nm/V），从而完成悬臂的校准¹⁸（补充图1A）。悬臂刚度通过热调谐法¹⁹确定（补充图1B）。使用洛伦兹函数拟合悬臂的共振峰。利用能量均分定理 计算悬臂刚度（单位：N/m），其中K_B为玻尔兹曼常数，T为温度（T = 295 K），P为通过对热调谐数据的洛伦兹拟合积分得到的悬臂热涨落功率谱面积²⁰。
2. 进行纳米红外（nanoIR）测量时，将AFM针尖定位在形貌图像中识别出的目标特征位置。
   1. 在nanoIR控制面板中选择音叉图标，以确定悬臂的接触共振频率。设置一个能够激发材料光热膨胀的红外光照波数。设定激光脉冲频率的扫描范围，并设置nanoIR激光的占空比。在“激光脉冲调谐窗口”内选择Acquire。
   2. 通过将标记条（绿色垂直线）置于第二阶接触共振峰的峰值处，选择针尖-样品系统的第二阶接触共振模式用于nanoIR测量。
      注：接触共振模式的选择可能因悬臂类型和样品不同而有所变化。
   3. 点击Optimize，将红外激光焦点区域的中心与悬臂针尖位置对齐。对齐过程在选定的红外照射波数下进行，该波数对应所探测材料的吸收带。将悬臂置于激光光斑的中心位置（补充图2）。
      注：根据激光器型号的不同，不同波数下的对齐效果可能有所差异。
   4. 采集红外激光照射的背景信号。该步骤包括在选定的脉冲频率下，测量中红外量子级联激光器（QCL）在其发射波长范围内的输出（补充图3）。这对于nanoIR光谱的背景校正至关重要。
   5. 通过选择波数范围（本实验中起始和终止分别设为1,530 cm^-1和1,800 cm^-1）、步长（2 cm^-1）以及测量所用的平均次数，采集nanoIR光谱。通过对测得的光热振幅除以衰减后的背景信号进行光谱背景校正，背景信号为第5.2.4步采集的背景乘以测量所选功率的百分比。
3. 进行nanoIR成像时，选择用于成像的感兴趣区域。
   1. 在“激光脉冲调谐窗口”中（通过点击音叉图标进入），启用锁相环（PLL）自动调谐功能。
   2. 在通用控制面板中调整最小和最大频率，以创建一个以第二阶共振模式为中心的扫描范围。
   3. 在PLL控制面板中点击zero将相位归零，然后在“激光脉冲调谐窗口”中点击OK。
   4. 在nanoIR控制面板中，勾选IR Imaging Enabled以启用红外成像功能。
   5. 在“成像视图”控制面板中，选择Height（成像视图1）、Amplitude 2（成像视图2）和Phase 2（成像视图3），以获取样品的形貌和化学图像。将采集方向设为Trace（或Retrace）。通常需要进行Line线性拟合以观察正在采集的样品形貌图像。拟合捕捉模式应设为None。
      注：扫描偏好设置，如采集的扫描方向或使用的颜色调色板，可根据需要进行调整。
   6. 在AFM“扫描”控制面板中，点击Scan图标。
   7. 为保存图像，在“Capture”控制面板中选择Now或End of frame图标。
4. 导出数据时，右键点击数据列表中的图像或光谱文件名，选择Export，并选择要导出的文件格式。将文件保存至目标计算机文件夹中。

结果

将聚苯乙烯（PS，(C₈H₈)_n）微球沉积在洁净的硅（Si）基底上（图1A）以及聚乙烯醇（PVA，(CH₂CHOH)_n）上（图1B、C）。由于微球在硅基底上的附着力较差，无法对该样品进行接触模式下的纳米红外（nanoIR）成像。因此，在nanoIR的光学视图下，将镀金的原子力显微镜（AFM）探针以接触模式置于PS微球顶部，施加的力约为100 nN（图2A）。将脉冲红外激光器设定为在1,730 cm^-1处激发样品，因为预计PS和PVA在此波数下均有吸收。通过扫描激光脉冲频率以确定悬臂梁的接触共振频率，用于nanoIR光谱测量。当以接触共振频率进行脉冲激发时，监测悬臂梁的响应以确定振荡幅度（图2B）。随后，通过监测接触共振幅度随照射波数从1,...

讨论

原子力显微镜（AFM）结合纳米红外光谱技术可利用接触模式下的悬臂和脉冲可调谐红外光源提供纳米级化学信息。诸如在聚合物材料体积内嵌入具有有限尺寸的吸收体等模型体系，对于深入理解成像形成机制以及评估仪器性能具有重要意义。针对本文所展示的聚苯乙烯（PS）/聚乙烯醇（PVA）体系，通过优化实验条件实现了聚苯乙烯微球稳定地位于PVA薄膜表面之上或之下。研究发现，在将涂覆有薄膜的硅基底从旋涂仪中取出后立即沉积聚苯乙烯微球，可获得更好的附着效果。PVA层的黏度可能影响微球相对于PVA薄膜表面的位置。将样品在约200 °C下加热约15分钟，可使微球更深入地嵌入薄膜中。

由于PS微球的尺寸较大（此处为5 µm），可利用nanoIR系统内置的光学显微镜快速将悬臂探针尖端与微球中心对齐。尽管在PVA中的PS微球和微泡在光学上难以区分，但通过nanoIR分析可以确认样品的组成。虽然当PS微球被其他聚合物覆盖时，1,600 cm^-1处的红外吸收峰贡献可能较弱（如图5所示），但在探针接触PVA覆盖层的情况下，提高激光功率可增强直...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10|0 2200 Golden Taklon 圆头刷	Zem
5357-8NM 镊子	Pelco
粘性标签	Ted Pella	16079
AFM 金属样品盘	Ted Pella	16208
双目显微镜	AmScope
用于 nanoIR 测量的悬臂梁	AppNano		FORTGG
细胞培养皿	Greiner bio-one GmbH
干燥器
浮动式光学平台	Newport	RS 4000
加热板	VWR
异丙醇
吸水纸（Kimwipes）	KIMTECH
磁力搅拌子
基于聚苯乙烯的微粒，粒径：5 µm	SIGMA-ALDRICH	79633
nanoIR2 显微镜	Bruker		接触模式 NanoIR2
氮气罐	Airgas
培养皿	Greiner bio-one GmbH
聚乙烯醇	SIGMA-ALDRICH	363170	该聚合物的水解度仅为87%-89%，这解释了在1730 cm-1处存在残余C=O峰的现象
量子级联激光器	Daylight Solutions		波数范围：1550-1800 cm-1
硅晶圆	MEMC St. Peters	#901319343000
旋涂仪	Oscilla