常温的 离体 为小鼠肝脏建立了离体常温机械灌注（NEVLP）系统。该系统需要显微外科操作经验，但可实现可重复的灌注效果。利用小鼠肝脏有助于研究分子通路以鉴定新型灌注液添加剂，并可开展以器官修复为目标的实验研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本方案介绍了一种使用小鼠肝脏的优化无红细胞常温机械灌注（NEVLP）系统。ex vivo 小鼠肝脏保存通过改良的套管及源自商用ex vivo 灌注设备的适配技术实现。该系统用于评估灌注12小时后的保存效果。以C57BL/6J小鼠作为肝脏供体，通过门静脉（PV）和胆管（BD）插管并用温热（37 °C）肝素化生理盐水冲洗器官后，将肝脏摘除。随后，将离体肝脏转移至灌注腔室，并接受常温氧合机械灌注（NEVLP）。每隔3小时采集一次灌流液的流入和流出样本，用于灌流液分析。灌注结束后，取肝脏组织进行组织学分析，并通过苏木精-伊红（HE）染色结合改良Suzuki评分评估其形态学完整性。优化实验得出以下结果：（1）体重超过30 g的小鼠更适用于本实验，因其胆管（BD）尺寸较大；（2）与聚丙烯套管相比，外径为0.66 mm的2 Fr聚氨酯套管更适用于门静脉（PV）插管，这归因于聚氨酯材料具有更强的抓握力，从而在从体内转移至器官腔室过程中显著减少导管滑脱；（3）在胆管（BD）插管方面，外径为0.33 mm的1 Fr聚氨酯套管相比外径为0.30 mm的聚丙烯UT-03套管更为有效。采用该优化方案，小鼠肝脏成功实现了长达12小时的保存，且未对组织学结构造成显著影响。苏木精-伊红（HE）染色显示肝脏形态结构保存良好，主要表现为大量存活的肝细胞，细胞核清晰可见，肝窦轻度扩张。
引言
肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗方法。遗憾的是，供体器官的需求量超过了可获得的供应量，导致严重的短缺。2021年，约有24,936名患者在等待肝移植，而仅成功完成了9,234例移植手术1。肝移植物供需之间的巨大差距凸显了迫切需要探索替代策略，以扩大供体来源并提高肝移植物的可及性。扩大供体池的一种方法是使用边缘供体2。边缘供体包括高龄或存在中度至重度脂肪变性的供体。尽管边缘器官的移植可能取得良好效果，但总体结果仍不理想。因此，目前正在进行旨在改善边缘供体功能的治疗策略的研发3,4。
其中一种策略是使用机械灌注，特别是常温氧合机械灌注，以改善这些边缘器官的功能5。然而，目前对常温氧合机械灌注（NEVLP）有益作用背后的分子机制仍了解有限。小鼠因其拥有大量可获得的基因修饰品系，是研究分子通路的宝贵模型。例如，自噬通路在减轻肝脏缺血-再灌注损伤中的重要性已日益受到关注6,7。肝脏缺血-再灌注损伤中的一个重要分子通路是miR-20b-5p/ATG7通路8。目前已有....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
动物实验根据现行的德国动物福利法规和指南以及动物研究报道的ARRIVE指南进行。动物实验方案已获得德国图林根州消费者保护局（Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, 图林根州，德国）批准（批准编号：UKJ - 17 - 106）。
注意：使用体重为 34 ± 4 g（均值 ± 均值标准误 [SEM]）的雄性 C57BL/6J 小鼠作为肝脏供体。小鼠饲养于环境受控的条件下（50% 湿度，18 - 23 °C），可自由摄取标准小鼠饲料和水。在整个手术过程中，维持呼吸频率超过 60 次/分钟，并保持体温高于 34 °C。
1. 准备
- 准备手术台
- 将所有手术器械和耗材进行高压灭菌处理。
- 开启所有设备，包括加热板和电凝装置。
- 将一支装有25 mL肝素化生理盐水（2,500 U/L）的50 mL注射器放入37 °C温育箱中预热。
- 将手术器械、6-0丝线、无菌小棉签、兽用生理盐水（500 mL）和非织造纱布垫（10 cm × 10 cm）合理放置于手术台上。
- 在手术台上放置一根26 G针头，用于在0.5 mL微量离心管盖上打一个小孔，以便插入胆汁引流管收集胆汁。
- 将导管....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
手术步骤的建立
本实验共使用17只动物：其中14只小鼠用于优化器官获取流程，包括门静脉（PV）和胆管（BD）的插管，另外3只小鼠用于验证该操作流程（表1）。通过比较组织学结果（图3），以确定最佳灌注条件。
灌注液的选择
本研究选用了一种先前使用的肝细胞培养基10,11威廉姆斯E培养基最初由Williams和Gunn设计，作为一种减少血清含量的培养基，用于长期培养 体外 成年大鼠肝上皮细胞的培养12然而，它也被用于支持啮齿类动物肝细胞的生长与维持13胎牛血清（FBS）是一种广泛应用的细胞培养添加剂，因其富含促进细胞生长、增殖和存活所必需的营养成分和生长因子
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
实验方案中的关键步骤
肝脏离体切除过程中的两个关键步骤是门静脉（PV）插管和随后的胆管（BD）插管。这两个步骤对于确保器官成功获取以及后续的灌注或移植操作至关重要。
挑战与解决方案
门静脉插管存在三个挑战：血管壁损伤、导管移位以及插管操作的可行性。门静脉血管壁结构精细，在插管过程中若操作不慎，容易发生穿孔并导致后续出血。此外，门静脉任何血液流失都会降低门脉压力，从而使门静脉导管插入更加困难。进一步地，门静脉壁的损伤可能将空气栓子引入肝内血管系统。因此，在门静脉插管过程中保持精确和谨慎至关重要，以最大限度地降低并发症风险。
在门静脉插管过程中，导管移位的风险是常见问题，尤其是在使用由光滑材料制成的插管时。与聚丙烯相比，聚氨酯插管在门静脉插管中更具优势。聚氨酯材质柔软且富有弹性，能显著降低导管移位或脱落的风险，这可能归因于其材料特性。此外，使用柔软的插管可最大程度减少对血管内皮层的损伤。在本研究中，比较了三种血管通路插管用于门静脉插管，分别.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
不存在需要披露的经济利益冲突。
致谢
在撰写本文的过程中，我得到了大量的支持与帮助。我特别要感谢我的团队成员XinPei Chen，感谢他在我的实验操作过程中给予的出色合作与耐心支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 ml 微量离心管 PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr 橡胶导管 | Vygon | 样本套管 | |
| 10 µL型微量注射器 | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr 橡胶导管 | Vygon | 样本套管 | |
| 24 G 蝶形针头 | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G 蝴蝶型留置针 | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G皮下注射针 | 斯特里坎 | 100246 | |
| 50 ml 注射泵 | 布劳恩 | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| 动脉夹 | 布劳恩 | BH014R | |
| 可高压灭菌的湿化培养室 | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| 大棉签涂抹器 | NOBA 绷带用品 Danz 公司 | 974018 | |
| 气泡捕集器 | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet（0.3 mg / ml） | Elanco | / | |
| CIDEX OPA 溶液（2 L） | Cilag GmbH | 20391 | |
| 单极电切电外科工作站 VIO® 50 ℃ | ERBE | / | |
| 胎牛血清（500 ml） | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| 气体混合物（95% 氧气 & 5% 二氧化碳) | 房屋供应 | / | |
| 加热循环水浴锅 | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| 肝素 5000（国际单位/5 ml） | 布劳恩 | 1708.00.00 | |
| 氢化可的松（100 mg / 2 ml） | 辉瑞 | 15427276 | |
| 胰岛素（100 IE / ml） | Sigma | I0516-5ML | |
| 虹膜剪 | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| 异氟烷（250 ml） | Cp-Pharma | 1214 | |
| 膜式氧合器 | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| 显微外科手术显微镜 | Leica | M60 | |
| 小鼠牵开器套装 | Carfil 质量 | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | 滨松 | / | |
| 非织造海绵 | 纱布绷带 | 866110 | |
| 青霉素-链霉素（1 mg/ml） | C.C.Pro | Z-13-M | |
| 灌注延长管（30 cm） | 布劳恩 | 4256000 | |
| 蠕动泵 | 哈佛-阿帕拉图斯 | P-70 | |
| 培养皿 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| 聚维酮碘（Vet-Sep 喷雾） | Livisto | 799-416 | |
| 压力传感器模拟器 | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| 可重复使用的血压传感器 | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T 血管插管镊 | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| 小型棉签 applicator | NOBA 连接件 Danz 公司 | 974116 | |
| 直型镊子 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| 缝合打结钳 | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| 50 ml 注射器，原装输注泵 | 布劳恩 | 8728810F-06 | |
| UT - 03 套管针 | 日本Unique Medical | / | |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| 兽用生理盐水（500 ml） | WDT | 18X1807 | |
| 水套式储液槽 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E 培养基（500 mL） | 赛默飞世尔科技 | A1217601 |
参考文献
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
