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方法文章

常温的 离体 小鼠肝脏离体灌注

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DOI：

10.3791/65363

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2023年9月25日

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Menoufia University

本文内容

摘要

常温的 离体 为小鼠肝脏建立了离体常温机械灌注（NEVLP）系统。该系统需要显微外科操作经验，但可实现可重复的灌注效果。利用小鼠肝脏有助于研究分子通路以鉴定新型灌注液添加剂，并可开展以器官修复为目标的实验研究。

摘要

本方案介绍了一种使用小鼠肝脏的优化无红细胞常温机械灌注（NEVLP）系统。ex vivo 小鼠肝脏保存通过改良的套管及源自商用ex vivo 灌注设备的适配技术实现。该系统用于评估灌注12小时后的保存效果。以C57BL/6J小鼠作为肝脏供体，通过门静脉（PV）和胆管（BD）插管并用温热（37 °C）肝素化生理盐水冲洗器官后，将肝脏摘除。随后，将离体肝脏转移至灌注腔室，并接受常温氧合机械灌注（NEVLP）。每隔3小时采集一次灌流液的流入和流出样本，用于灌流液分析。灌注结束后，取肝脏组织进行组织学分析，并通过苏木精-伊红（HE）染色结合改良Suzuki评分评估其形态学完整性。优化实验得出以下结果：（1）体重超过30 g的小鼠更适用于本实验，因其胆管（BD）尺寸较大；（2）与聚丙烯套管相比，外径为0.66 mm的2 Fr聚氨酯套管更适用于门静脉（PV）插管，这归因于聚氨酯材料具有更强的抓握力，从而在从体内转移至器官腔室过程中显著减少导管滑脱；（3）在胆管（BD）插管方面，外径为0.33 mm的1 Fr聚氨酯套管相比外径为0.30 mm的聚丙烯UT-03套管更为有效。采用该优化方案，小鼠肝脏成功实现了长达12小时的保存，且未对组织学结构造成显著影响。苏木精-伊红（HE）染色显示肝脏形态结构保存良好，主要表现为大量存活的肝细胞，细胞核清晰可见，肝窦轻度扩张。

引言

肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗方法。遗憾的是，供体器官的需求量超过了可获得的供应量，导致严重的短缺。2021年，约有24,936名患者在等待肝移植，而仅成功完成了9,234例移植手术1。肝移植物供需之间的巨大差距凸显了迫切需要探索替代策略，以扩大供体来源并提高肝移植物的可及性。扩大供体池的一种方法是使用边缘供体2。边缘供体包括高龄或存在中度至重度脂肪变性的供体。尽管边缘器官的移植可能取得良好效果，但总体结果仍不理想。因此，目前正在进行旨在改善边缘供体功能的治疗策略的研发3,4。

其中一种策略是使用机械灌注，特别是常温氧合机械灌注，以改善这些边缘器官的功能5。然而，目前对常温氧合机械灌注（NEVLP）有益作用背后的分子机制仍了解有限。小鼠因其拥有大量可获得的基因修饰品系，是研究分子通路的宝贵模型。例如，自噬通路在减轻肝脏缺血-再灌注损伤中的重要性已日益受到关注6,7。肝脏缺血-再灌注损伤中的一个重要分子通路是miR-20b-5p/ATG7通路8。目前已有多种ATG基因敲除和条件性敲除小鼠品系，但尚无相应的大鼠品系9。

基于这一背景，本研究旨在为小鼠肝脏移植物构建一个微型化的NEVLP平台。该平台将有助于探索和评估旨在改善供体肝脏功能的潜在基因修饰策略。此外，该系统还需适用于长期灌注，以实现 离体 肝脏治疗，通常称为 "器官修复"

鉴于小鼠肝脏灌注相关的体外（in vitro）数据较为有限，文献综述主要聚焦于大鼠的研究。通过系统检索2010年至2022年期间的文献，使用诸如"常温肝脏灌注"、"离体（ex vivo）或体外（in vitro）"以及"rats"等关键词，旨在确定啮齿类动物中的最佳实验条件，从而帮助我们选择最合适的研究方法。

灌流系统由一个带水套的密封玻璃缓冲液储液罐、一个蠕动滚轴泵、一个氧合器、一个气泡捕获装置、一个热交换器、一个器官腔室以及一个封闭循环管路系统组成（图1）。该系统通过专用的恒温装置，确保灌流温度精确维持在37 °C。蠕动滚轴泵驱动灌流液在整个回路中流动。灌流回路始于带隔热水套的储液罐。随后，灌流液被导入氧合器，在此处接收来自专用气瓶的95%氧气和5%二氧化碳混合气体。完成氧合后，灌流液流经气泡捕获装置，其中任何滞留的气泡均被蠕动泵重新导回储液罐。剩余的灌流液则通过热交换器，进入器官腔室，随后返回储液罐。

本文中，我们报告了建立小鼠肝脏非氧合体外灌注（NEVLP）系统的经验，并分享了使用不含氧载体的氧合介质进行的初步实验所取得的有前景的结果。

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方案

动物实验根据现行的德国动物福利法规和指南以及动物研究报道的ARRIVE指南进行。动物实验方案已获得德国图林根州消费者保护局（Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, 图林根州，德国）批准（批准编号：UKJ - 17 - 106）。

注意：使用体重为 34 ± 4 g（均值 ± 均值标准误 [SEM]）的雄性 C57BL/6J 小鼠作为肝脏供体。小鼠饲养于环境受控的条件下（50% 湿度，18 - 23 °C），可自由摄取标准小鼠饲料和水。在整个手术过程中，维持呼吸频率超过 60 次/分钟，并保持体温高于 34 °C。

1. 准备

  1. 准备手术台
    1. 将所有手术器械和耗材进行高压灭菌处理。
    2. 开启所有设备，包括加热板和电凝装置。
    3. 将一支装有25 mL肝素化生理盐水（2,500 U/L）的50 mL注射器放入37 °C温育箱中预热。
    4. 将手术器械、6-0丝线、无菌小棉签、兽用生理盐水（500 mL）和非织造纱布垫（10 cm × 10 cm）合理放置于手术台上。
    5. 在手术台上放置一根26 G针头，用于在0.5 mL微量离心管盖上打一个小孔，以便插入胆汁引流管收集胆汁。
    6. 将导管（1 Fr聚氨酯导管或UT-03聚乙烯导管）和一个已灭菌的0.5 mL微量离心管（用于胆汁收集）放置于手术台上。
  2. 自制门静脉导管
    1. 用镊子夹住2 Fr导管，在距导管末端1 cm处用30 G针头刺穿管壁，推动针头穿过导管直至针尖露出。
    2. 修剪导管末端，形成一个尖锐的三角形。
  3. 肝素化生理盐水的配制
    1. 配制25 mL肝素化生理盐水，终浓度为2,500 IU/mL。
    2. 排除所有气泡，并将注射器置于40 °C温育箱中备用。
  4. 灌注系统的示意图说明
    1. 参见图1了解机器灌注系统的主要组成部分。
  5. 器官腔室的设置
    1. 参见图2了解器官腔室的布局。
  6. 灌注系统的安装
    1. 启动实验室数据记录程序以监测压力。
    2. 在器官腔室水平位置连接压力校准仪和压力传感器。
    3. 调节压力校准仪至0 mmHg，并在压力控制软件中核对相应读数。
    4. 调节压力校准仪至20 mmHg，并再次在压力控制软件中核对相应读数。
    5. 开启水浴，将器官腔室预热至40 °C。
    6. 用去离子蒸馏水冲洗整个管路系统两次，每次30分钟，确保彻底清除消毒液。
    7. 启动消毒液循环，使其在整个系统中持续流动20分钟，以实现充分消毒。
    8. 开启混合气体（95%氧气（O2）和5%二氧化碳（CO2））。
  7. 灌注液填充
    1. 在250 mL Williams' E培养基中加入50 mL胎牛血清、3 mL青霉素/链霉素（1 mg/mL）、0.17 mL胰岛素（100 IE/mL）、0.34 mL肝素（5000 U/mL）和0.07 mL氢化可的松（100 mg/2 mL），配制成完全Williams' E培养基。
    2. 向储液器和器官腔室中各加入等体积（150 mL）的灌注液，以启动系统。
      注意：填充过程中必须特别注意保持无菌状态。灌注液将在闭合循环机器灌注系统的这两个关键部件中持续泵送。
    3. 以中等速度（15 mL/min）启动蠕动泵，用氧合培养基预充灌注系统。

2. 肝脏移植术

  1. 术前准备
    1. 称量动物体重。准备镇痛药布托啡诺（0.3 mg/mL）（剂量为0.05 mg/kg体重）。
    2. 将诱导室连接至墙壁氧气接口，调节氧气流速至0.5 L/min，异氟烷浓度调至3%。
    3. 将动物放入诱导室，直至达到深度麻醉状态（翻正反射消失）。
    4. 使用微量注射器皮下注射按体重调整剂量的镇痛药。
    5. 使用电动剃毛器剃除腹部皮肤上的毛发。
    6. 将小鼠转移至手术台，开启异氟烷挥发罐至2.5%以维持麻醉状态，并通过检测趾间反射确认麻醉深度。
  2. 小鼠腹部准备
    1. 将小鼠置于仰卧位。
    2. 再次检测趾间反射以确认麻醉深度合适，用胶带固定四肢。
    3. 使用碘酒-酒精连续消毒腹部两侧至腋中线区域三遍。用无纺灭菌纱布覆盖手术区域周围。
    4. 使用梅岑鲍姆婴儿剪刀和手术镊在小鼠腹部剑突下1 cm处做一长度为3 cm的横向切口。
    5. 将皮肤切口向两侧延伸至双侧腋中线。
    6. 使用弹簧剪沿腹白线小心做一2 cm的纵向切口。
    7. 使用电凝和范纳斯弹簧剪剪开腹肌层。
    8. 小心放置一块湿润纱布，以保护肝脏免受电凝损伤。
    9. 使用带圆针的6-0丝线缝线牵拉剑突，以更好地暴露冠状韧带。
    10. 使用两个肋骨牵开器充分暴露小鼠腹腔。
    11. 用湿润棉签小心将小肠移出腹腔，以充分暴露肝门区域。
  3. 胆总管准备
    1. 使用锐利剪刀切断镰状韧带、膈韧带和胃肝韧带。
    2. 使用无齿精细弯镊小心游离胆总管。
      ​注意：胆总管极易受损破裂，一旦破裂则无法插管。由于解剖位置的方向性，建议使用弯镊操作。
    3. 在胆总管上预先放置两根6-0丝线环，为下一步操作做准备。
  4. 胆总管插管
    1. 使用30 G针头小心穿刺胆总管，用尖头弯镊扩大穿刺孔以适配胆总管插管。
    2. 使用血管插管镊夹持胆总管插管并将其推入胆总管内。
    3. 使用预先放置的两根6-0缝线环双重固定插管。
      注意：插管过程中可感受到胆汁带来的阻力。若施力控制不当，插管可能被胆汁流出压力推出胆道。需仔细调整插管深度：过深可能损伤胆总管，过浅则可能导致插管滑脱。
    4. 成功插管后观察插管内胆汁流动情况。
  5. 门静脉准备
    1. 使用平头镊夹住门静脉，并用弯镊小心分离周围结缔组织。避免用力牵拉，以防门静脉撕裂。一旦门静脉受损，再次插管将非常困难。
    2. 在门静脉分叉上方进行解剖，并在靠近汇合处使用6-0丝线做第一个缝线环，以备后续使用。
    3. 在尽可能靠近肝门的位置放置第二个缝线环，用于后续门静脉固定。
  6. 门静脉插管
    1. 使用动脉夹闭合远端门静脉。
    2. 极为小心地使用上述门静脉插管之一穿刺门静脉。成功穿刺后可在插管内清晰观察到血液流动。
    3. 使用预先放置的6-0缝线环固定门静脉插管。
  7. 肝脏灌流
    1. 将异氟烷浓度提高至5%，通过过量吸入异氟烷实施安乐死。
    2. 从培养箱中取出预温的肝素化生理盐水溶液，排除肝素化盐水中产生的所有气泡。
    3. 将装有预温肝素化生理盐水的注射器固定于注射泵上。
    4. 将注射泵的延长管连接至门静脉插管，调节流速至2 mL/min，开始肝脏灌流。
    5. 在灌流结束时观察肝脏颜色。当肝脏颜色变为均匀黄色时，即可切除肝脏。
    6. 切断膈肌、肝上段下腔静脉、肝下段下腔静脉、肝动脉、远端门静脉以及任何残留的结缔组织。
    7. 将肝脏放入培养皿中。

3. 肝脏与灌流腔的连接

  1. 肝脏转移
    1. 使用培养皿小心地将肝脏转移至器官腔室中。
    2. 在培养皿中保留少量生理盐水，以防止肝脏干燥。
      注意：在此操作过程中，门静脉和胆管容易发生扭转，可能影响肝脏灌注和胆汁收集。
  2. 门静脉插管连接
    1. 用注射器将生理盐水缓慢注入门静脉插管，以排出插管内的气泡。
    2. 将门静脉插管连接至器官腔室中的灌注液流出管。
  3. 胆管插管连接
    1. 将小鼠胆管插管穿过连接于器官腔室的橡胶帽阀门。
    2. 将胆管插管插入预先准备好的、瓶盖上带有小孔的0.5 mL微量离心管中。
    3. 将该微量离心管放置于器官腔室外的黏土上。

4. 根据门静脉压力调整流速

  1. 从 1 mL/min 开始启动蠕动泵。
  2. 检查门静脉压力读数，以调节流速。
  3. 通过调节流速，将门静脉压力维持在 7 - 10 mmHg 的生理范围内。
    注意：标称流速可能因管路的使用情况和位置而略有差异。

5. 样品采集

  1. 每3小时从门静脉流入管采集灌注液入口样本，并从器官腔室采集灌注液出口样本。
  2. 在12小时灌注期结束时，从所有肝叶采集样本用于组织学分析。

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结果

手术步骤的建立
本实验共使用17只动物：其中14只小鼠用于优化器官获取流程，包括门静脉（PV）和胆管（BD）的插管，另外3只小鼠用于验证该操作流程（表1）。通过比较组织学结果（图3），以确定最佳灌注条件。

灌注液的选择
本研究选用了一种先前使用的肝细胞培养基10,11威廉姆斯E培养基最初由Williams和Gunn设计，作为一种减少血清含量的培养基，用于长期培养 体外 成年大鼠肝上皮细胞的培养12然而，它也被用于支持啮齿类动物肝细胞的生长与维持13胎牛血清（FBS）是一种广泛应用的细胞培养添加剂，因其富含促进细胞生长、增殖和存活所必需的营养成分和生长因子

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讨论

实验方案中的关键步骤
肝脏离体切除过程中的两个关键步骤是门静脉（PV）插管和随后的胆管（BD）插管。这两个步骤对于确保器官成功获取以及后续的灌注或移植操作至关重要。

挑战与解决方案
门静脉插管存在三个挑战：血管壁损伤、导管移位以及插管操作的可行性。门静脉血管壁结构精细，在插管过程中若操作不慎，容易发生穿孔并导致后续出血。此外，门静脉任何血液流失都会降低门脉压力，从而使门静脉导管插入更加困难。进一步地，门静脉壁的损伤可能将空气栓子引入肝内血管系统。因此，在门静脉插管过程中保持精确和谨慎至关重要，以最大限度地降低并发症风险。

在门静脉插管过程中，导管移位的风险是常见问题，尤其是在使用由光滑材料制成的插管时。与聚丙烯相比，聚氨酯插管在门静脉插管中更具优势。聚氨酯材质柔软且富有弹性，能显著降低导管移位或脱落的风险，这可能归因于其材料特性。此外，使用柔软的插管可最大程度减少对血管内皮层的损伤。在本研究中，比较了三种血管通路插管用于门静脉插管，分别...

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披露

不存在需要披露的经济利益冲突。

致谢

在撰写本文的过程中，我得到了大量的支持与帮助。我特别要感谢我的团队成员XinPei Chen，感谢他在我的实验操作过程中给予的出色合作与耐心支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 ml 微量离心管 PPSarstedt72699
1 Fr 橡胶导管Vygon样本套管
10 µL型微量注射器Hamilton701N
2 Fr 橡胶导管Vygon样本套管
24 G 蝶形针头TerumoSR+OF2419
26 G 蝴蝶型留置针TerumoSR+DU2619WX
30 G皮下注射针斯特里坎100246
50 ml 注射泵布劳恩110356
6-0 Perma-Hand SeideEthicon639H
动脉夹布劳恩BH014R
可高压灭菌的湿化培养室Hugo Sachs Elektronik73-4733
大棉签涂抹器 NOBA 绷带用品 Danz 公司974018
气泡捕集器Hugo-Sachs-ElektronikV83163
Buprenovet（0.3 mg / ml）Elanco/
CIDEX OPA 溶液（2 L）Cilag GmbH20391
单极电切电外科工作站 VIO® 50 ℃ERBE/
胎牛血清（500 ml） Sigma-AldrichF7524-500ML
气体混合物（95% 氧气 & 5% 二氧化碳)房屋供应/
加热循环水浴锅Harvard-Apparatus75-0310
肝素 5000（国际单位/5 ml）布劳恩1708.00.00
氢化可的松（100 mg / 2 ml）辉瑞15427276
胰岛素（100 IE / ml）SigmaI0516-5ML
虹膜剪 Fine Science Instruments15000-03
异氟烷（250 ml）Cp-Pharma1214
膜式氧合器Hugo Sachs ElektronikT18728
显微外科手术显微镜 LeicaM60
小鼠牵开器套装 Carfil 质量180000056
NanoZoomer 2.0 HT滨松/
非织造海绵 纱布绷带866110
青霉素-链霉素（1 mg/ml） C.C.ProZ-13-M
灌注延长管（30 cm）布劳恩4256000
蠕动泵哈佛-阿帕拉图斯P-70
培养皿 100×15 mmVWR®391-0578
聚维酮碘（Vet-Sep 喷雾）Livisto799-416
压力传感器模拟器UTAH Medical Products650-950
可重复使用的血压传感器AD InstrumentsMLT-0380/D
S & T 血管插管镊Fine Science Instruments00608-11
小型棉签 applicatorNOBA 连接件 Danz 公司974116
直型镊子 10 cm Fine Science Instruments00632-11
缝合打结钳Fine Science Instruments11063-07
50 ml 注射器，原装输注泵布劳恩8728810F-06
UT - 03 套管针日本Unique Medical/
万纳斯弹簧剪Fine Science Instruments15018-10
兽用生理盐水（500 ml）WDT18X1807
水套式储液槽  2 LHarvard-Apparatus73-3441
William's E 培养基（500 mL）赛默飞世尔科技A1217601

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