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从皮肤活检样本中生成患者来源的足细胞

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DOI：

10.3791/65364

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2023年5月26日

 , 
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

本文内容

摘要

本文描述了一种两步法方案，用于从皮肤成纤维细胞生成患者特异性的足细胞 通过 通过附加体型重编程获得人诱导性多能干细胞（hiPSCs）及其向足细胞的后续分化

摘要

足细胞是位于肾小球滤过屏障尿液侧的上皮细胞，参与肾小球选择性滤过功能。足细胞特异性基因的突变可导致局灶节段性肾小球硬化（FSGS），许多其他原发性和继发性肾病也累及足细胞。由于其高度分化的特性，足细胞的原代细胞培养模型十分有限。 因此，通常使用条件性永生化细胞。然而，这些条件性永生化足细胞（ciPodocytes）存在若干局限性：细胞在培养过程中可能发生去分化，尤其是在达到汇合状态时；此外，多种足细胞特异性标志物的表达水平极低甚至完全不表达。这使得ciPodocytes在生理学、病理生理学及临床研究中的应用价值受到质疑。本文介绍一种通过皮肤穿刺活检获取人源足细胞（包括患者特异性足细胞）的实验方案：首先将皮肤成纤维细胞经附加体型重编程为人诱导多能干细胞（hiPSCs），再进一步定向分化为足细胞。这些足细胞在形态和功能上均接近 体内 足细胞在形态学特征方面表现更佳，例如足突的形成以及足细胞特异性标志物的表达。最后但同样重要的是，这些细胞保留了患者的基因突变，从而实现了更优的 离体 用于以个体化方法研究足细胞疾病及潜在治疗物质的模型。

引言

足细胞是一种特化的终末分化肾上皮细胞，与肾小球基底膜（GBM）、肾小球内皮细胞及糖萼共同构成肾脏的肾小球滤过屏障。形态学上，足细胞包括胞体以及由微管驱动的一级膜突起和称为足突的二级突起1,2。肾小球滤过屏障可将血液滤过形成尿液，该屏障由有孔内皮、GBM以及连接相邻足细胞足突的一种特殊类型细胞间连接——足细胞裂孔隔膜——所构成3。在健康状态下，由于分子大小和电荷的限制，大于白蛋白的蛋白质无法通过滤过屏障而被保留4。

细胞骨架或足细胞特异性基因的突变，以及影响足细胞信号通路的循环因子，已知可诱导足细胞足突融合、脱落或凋亡，从而导致蛋白尿和肾小球硬化。其中，细胞骨架重排、足细胞极性的改变或足突损伤伴裂孔隔膜的丢失尤为关键5由于足细胞具有终末分化特性，一旦从肾小球基底膜（GBM）上脱落便难以再生替代。然而，若足细胞仍附着于GBM，则仍可从足突融合状态中恢复，并重新形成相互交错的足突结构。6,7,8进一步了解导致各种肾小球疾病中足细胞损伤的事件，可能为开发这些疾病的治疗手段提供新的治疗靶点。足细胞损伤是多种肾小球疾病（包括局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）、糖尿病肾病、微小病变性肾病及膜性肾小球肾炎）的标志性特征，因此需要可靠的足细胞模型 离体 用于研究这些疾病的病理机制及潜在治疗方法的模型9,10. 足细胞可以被研究 离体 通过差速筛分法分离肾小球并进行经典原代细胞培养11然而，由于终末分化的足细胞增殖能力有限，大多数研究人员使用表达SV40大T抗原温度敏感变体的小鼠或人源永生化足细胞系。 Alternatively，也可从携带SV40 Tag永生化基因的转基因小鼠中分离获得永生化足细胞1,12.

CiPodocytes 增殖于 33 °C，但会进入生长停滞并开始分化 37 °C13,14需要牢记的是，使用这些细胞获得的实验数据应谨慎解读，因为这些细胞是通过非自然的基因插入方式产生的。15由于这些细胞携带永生化基因，其细胞生理状态因持续增殖而发生改变12. 近期有研究对通过该方法建立的足细胞系提出质疑，因为小鼠、人和大鼠的条件永生化足细胞（ciPodocytes）在蛋白水平上表达的突触足蛋白（synaptopodin）和肾病蛋白（nephrin）均低于5%，且在mRNA水平上NPHS1和NPHS2的表达量相较于肾小球中的表达也显著降低16此外，大多数足细胞系不表达nephrin17,18Chittiprol 等人还描述了 ciPodocytes 在细胞运动性以及对嘌呤霉素和多柔比星的反应方面存在显著差异16在不同肾小球疾病中，足细胞可从肾小球基底膜脱落并出现在尿液中19,20,21,22可培养存活的尿液足细胞 离体 最多可维持2-3周，但大多数细胞会经历凋亡23,24有趣的是，足细胞不仅存在于肾小球疾病患者的尿液中，也存在于健康个体的尿液中，这很可能发生在其衰老时——此时它们在培养中复制能力有限24此外，尿液来源的足细胞数量有限，且在培养过程中会发生去分化，足突减少，形态改变，最重要的是增殖能力有限。足细胞特异性基因的表达缺失，或在数周内消失，或在不同细胞克隆间表达不一。部分表达足细胞特异性标志物的细胞同时表达肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞或系膜细胞的标志物，提示培养的尿源性足细胞存在去分化和/或转分化现象。24,25.

最近有研究报道，通过使用温度敏感型SV40大T抗原和hTERT转导，可从患者和健康志愿者的尿液中建立ciPodocyte细胞系26。在这些细胞中可检测到突触足蛋白（synaptopodin）、巢蛋白（nestin）和CD2相关蛋白的mRNA表达，但所有克隆均未检测到足蛋白（podocin）mRNA。除了尿源性足细胞本身存在的问题外，这些细胞还含有插入的永生化基因，从而带来上述种种弊端。

相比之下，人诱导多能干细胞（hiPSCs）在适当条件下具有强大的自我更新能力，并可分化为多种细胞类型。已有研究表明，hiPSCs 可作为足细胞近乎无限的来源27,28。

本文描述了一种两步法方案，通过皮肤穿刺活检获取患者皮肤成纤维细胞，经表观遗传重编程为hiPSCs，再进一步分化为hiPSC来源的足细胞，从而生成患者特异性的足细胞（图1）。

足细胞基因治疗过程、hiPSC重编程示意图、药物筛选、个体化治疗。
图1：生成患者特异性hiPSC来源足细胞的实验方案。 本图展示了从皮肤活检获取的真皮成纤维细胞出发，通过重编程为hiPSC并进一步分化为足细胞，以生成患者特异性足细胞的流程示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

首先，从皮肤活检穿刺样本中分离培养体细胞真皮成纤维细胞，并通过电穿孔技术将表达转录因子OCT3/4、KLF4、SOX2和c-MYC的质粒导入细胞，采用无整合方法将其重编程为人诱导多能干细胞（hiPSCs）29,30,31。随后挑选并扩增获得的hiPSC克隆。分化过程始于激活WNT信号通路以诱导中胚层谱系，接着生成仍具有增殖能力的肾单位祖细胞。最后，将这些细胞进一步分化为足细胞。在本实验流程中，我们对先前已发表的方案进行了修改与整合，包括Bang等人32和Okita等人33报道的基于附加体的hiPSC重编程方法，以及Musah等人28,34,35提出的hiPSC向足细胞分化的方案。

事实上，通过本方案生成的足细胞在发育出明确的初级和次级足突网络以及表达足细胞特异性标志物（如synaptopodin、podocin和nephrin）方面，其表型更接近体内（in vivo）的足细胞。利用由hiPSC分化而来的足细胞，可在重编程和分化过程中保留患者的遗传背景。这使得能够在近乎无限的细胞数量基础上，进行患者特异性的足细胞疾病建模，并在体外（ex vivo）发现潜在的治疗物质。此外，该方案具有微创性、成本效益高、符合伦理要求，可能为药物开发开辟新的途径。

方案

该方案已获得埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学伦理委员会批准（编号：251_18B），所有患者和受试者均签署了书面知情同意书。所有实验均按照相关指南和规定进行。本研究中所用培养基和溶液的组成详见表1。

1. 从皮肤穿刺活检样本中培养真皮成纤维细胞

  1. 将皮肤钻孔活检组织转移至含有10 mL预热的成纤维细胞培养基的无菌15 mL锥形管中。
  2. 移除培养基，用 5 mL 无菌预热的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗皮肤钻孔活检组织三次。用无菌镊子将皮肤钻孔活检组织转移至 10 cm 细胞培养皿中，用无菌手术刀将其横向切成三到四块，保留表皮和真皮。
  3. 将每块组织转移至无菌的35 mm塑料细胞培养皿中，并轻轻按压使其贴附于培养皿表面。去除组织块周围的过量培养基，静置干燥5-10分钟，直至液体完全蒸发，组织块牢固贴附于细胞培养用塑料表面。
  4. 用1,000 µL移液器将1 mL成纤维细胞培养基沿组织活检块边缘逐滴加入，再小心补充培养基至终体积3 mL。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 7天内不更换培养基且不移动培养皿。小心地将培养基更换为新鲜的预热成纤维细胞培养基。7天后，可在皮肤活检组织周围使用相差显微镜观察到向外生长的梭形成纤维细胞。36.
    注意：当原代成纤维细胞生长至培养皿边缘时，需从步骤1.3重新开始，以制备另一批成纤维细胞。
  5. 为扩增长出的成纤维细胞，用 2 mL 预热的 1x PBS 洗涤，加入 1 mL 1x 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化成纤维细胞，并于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟2将脱离的细胞转移至15 mL锥形管中，并用2 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基洗涤细胞培养皿。
  6. 将洗涤液收集至离心管中以中和解离试剂，于200 x g离心 g 在20 °C下孵育5分钟。吸除上清液，用1 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色及血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，并接种2.5 × 103 至 5 × 103 每平方厘米的成纤维细胞2 在新的细胞培养瓶中。
  7. 将培养瓶放回培养箱，并在每个方向上移动培养瓶三次以均匀分布细胞。次日，更换为新鲜的预热成纤维细胞培养基。. 每周更换培养基两次，当成纤维细胞融合度达到约80%时进行传代。

2. 冻存真皮成纤维细胞

  1. 为冻存成纤维细胞，先用 5 mL 预热的 1× PBS 洗涤细胞。吸除 PBS，加入 4 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA 消化液使成纤维细胞解离。将培养瓶放回培养箱，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5–7 分钟。使用相差显微镜观察细胞脱落情况，并轻敲培养瓶侧壁以促进细胞脱落。
  2. 将脱落的细胞转移至 15 mL 圆底离心管中。用 5 mL 新鲜预热的成纤维细胞培养基洗涤细胞培养瓶，将洗涤液一并收集至同一离心管中，于 20 °C 以 200 × g 离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液，用 2 mL 新鲜预热的成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀。计数细胞后，将 1 × 106 个细胞转移至新的离心管中，于 20 °C 以 200 × g 离心 5 分钟。
  4. 吸除上清液，用 1 mL 冷冻的成纤维细胞冻存液 （含 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO））重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至冻存管中，放入程序降温盒，于 -80 °C 过夜冷冻。长期保存时，次日将冻存管转移至液氮罐中储存。

3. 通过附加体型重编程将成纤维细胞重编程为人诱导多能干细胞（hiPSCs）

  1. 进行附加体质粒重编程时，使用第4至第8代的1.5 × 106个成纤维细胞。为达到此细胞数量，使用两到三个250 mL培养瓶，每个培养瓶细胞融合度约为70%。
  2. 重编程前一天，以1:2比例传代成纤维细胞，以确保其处于增殖状态。因此，吸除培养基，并用每瓶5 mL预热的1×PBS洗涤培养瓶。吸除PBS，每瓶加入4 mL 1×胰蛋白酶-EDTA进行消化。将培养瓶放回培养箱，在37 °C、5% CO2条件下孵育5–7分钟。使用相差显微镜观察细胞脱落情况，并轻敲培养瓶侧面以促进细胞从塑料表面脱落。
  3. 将脱落的细胞转移至50 mL锥形管中，并用每瓶5 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基洗涤细胞培养瓶。将洗涤液合并至锥形管中，在20 °C下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基中。
  4. 准备六个新的细胞培养瓶，每瓶加入5 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基。向每瓶中加入1 mL成纤维细胞悬液。将培养瓶放回培养箱，并通过在每个方向上移动培养瓶三次使细胞均匀分布。
  5. 进行附加体质粒重编程时，用每板4 mL冷包被液包被两个适用于hiPSC培养的10 cm细胞培养板。在37 °C孵育1小时。
    注意：培养hiPSC需要不同类型的细胞培养器皿及额外的细胞外基质包被（参见材料表）。
  6. 吸除成纤维细胞的培养基，并用每瓶10 mL预热的1×PBS洗涤。吸除PBS，每瓶加入4 mL 1×胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育5–7分钟进行消化。使用相差显微镜监测细胞脱落情况，必要时轻敲培养瓶侧面以使细胞从塑料表面脱落。
  7. 将脱落的细胞转移至50 mL锥形管中。用每瓶6 mL预热的成纤维细胞培养基洗涤空瓶以收集残留细胞，并将洗涤液合并至锥形管中。在20 °C下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL新鲜预热的1×PBS中。
  8. 计数细胞，并将1.5 × 106个成纤维细胞转移至新的锥形管中。在20 °C下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL电穿孔缓冲液中，再次离心。在此期间，吸除已包被的10 cm细胞培养板中的包被液，并每板加入7 mL预热的成纤维细胞培养基。
  9. 离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于电穿孔缓冲液中，终体积为250 µL，细胞浓度为1.5 × 106个细胞。将250 µL细胞悬液转移至具有4 mm间隙的电穿孔比色皿中（参见材料表）。
  10. 配制质粒转染混合液：将每种质粒（pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN）各4 µg加入电穿孔缓冲液中，总体积为50 µL。将混合液转移至比色皿中，轻轻弹击混匀。以280 V施加一次电脉冲进行电穿孔。
  11. 使用无菌剪刀剪去移液器吸头尖端，将125 µL电穿孔后的成纤维细胞悬液分别转移至已准备好的两个10 cm细胞培养板中。通过在各个方向轻轻晃动培养板三次使细胞分布均匀，然后放回培养箱。在37 °C、5% CO2条件下静置过夜孵育。
  12. 为去除死细胞，次日更换为每板7 mL新鲜预热的成纤维细胞培养基。电穿孔后第2天更换为hiPSC培养基，并在此后每两天更换一次，持续20天。

4. 人诱导多能干细胞的筛选、扩增与质量控制

  1. 电转染后，使用10倍或20倍物镜的相差显微镜每天观察细胞至少20天，以监测hiPSC集落的形成。若hiPSC集落直径约为300 µm，边界清晰，且hiPSC细胞核质比较高，则表明hiPSC集落已适合进行挑取筛选（图2B、C 和 图3）。
  2. 挑取前，用100 µL包被液对适用于hiPSC培养的96孔板每孔进行包被，并在37 °C下孵育1小时。孵育期间，用记号笔在细胞培养皿底部标记感兴趣的集落。96孔板最终准备时，吸除包被液，每孔加入100 µL预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。
  3. 用预热的1×PBS洗涤细胞，并在挑取前加入新鲜预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基，以去除死细胞。挑取hiPSC集落时，使用针头在每个集落上划出网格，将hiPSC集落切割成小块。
  4. 在相差显微镜下确认集落已被成功分割成小块后，用100 µL移液器将这些小块转移至已准备好的96孔板中。移液时保持移液器垂直于集落上方，避免接触细胞，以防刮伤或丢失集落。
  5. 将96孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，静置过夜使细胞贴壁。保留含有成纤维细胞与hiPSC混合物的培养皿，以防挑取失败。此时，通过更换为不含ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基 来去除ROCK抑制剂，并将培养板重新放回培养箱中。
  6. 次日，将96孔板中的培养基更换为200 µL新鲜hiPSC培养基，并每隔一天更换一次。次日观察96孔板，标记成功挑取的克隆所在孔。
    ​注意：若首次挑取后hiPSC克隆尚未完全分离，孔中仍可见成纤维细胞，则需从96孔板中重复挑取，或刮除板上的成纤维细胞。

5. 扩增筛选出的 hiPSC 克隆

  1. 使用相差显微镜监测hiPSC克隆。若所选的hiPSC达到约70%融合度，则hiPSC克隆已准备好进行扩增。
  2. 用250 µL包被液在37 °C条件下对适用于hiPSC培养的48孔板进行包被，每孔加入250 µL，孵育1小时。弃去包被液，每孔加入200 µL新鲜预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基 。
  3. 为使hiPSC从96孔板中脱离，使用1,000 µL移液枪头刮取塑料表面。将脱离的hiPSC从96孔板转移至48孔板。次日更换为新鲜预热的hiPSC培养基，以去除死细胞和ROCK抑制剂Y27632。
  4. 若hiPSC克隆达到约70%融合度，将hiPSC转移至24孔板。因此，用400 µL包被液在37 °C条件下对适用于hiPSC培养的24孔板进行包被，每孔加入400 µL，孵育1小时。弃去包被液，每孔加入400 µL新鲜预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。 吸去48孔板中的培养基，并用500 µL预热的1x PBS洗涤。
  5. 弃去PBS，每孔加入100 µL含10 µM ROCK抑制剂Y27632的酶解细胞解离溶液，在37 °C孵育4分钟。使用1,000 µL移液枪将hiPSC从孔板上冲洗下来。将解离的细胞转移至15 mL锥形管中。用含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基 洗涤空的48孔板，并将洗涤液合并至锥形管中。
  6. 在20 °C下以200 x g 离心5分钟。吸去上清液，将hiPSC重悬于1 mL含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基中 ，并转移至24孔板。将孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，通过在各个方向轻轻晃动孔板三次使细胞分布均匀。让细胞在无扰动条件下贴附过夜。
  7. 次日，更换为不含ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。
    ​注意：若hiPSC克隆达到约70%融合度，可通过重复步骤5.4 至 5.7 ，并调整为适用于12孔板的体积，将hiPSC转移至12孔板。若12孔板中的hiPSC达到约70%融合度，则将hiPSC克隆以适用于6孔板的更大体积转移至6孔板。

6. 冻存选定的 hiPSC 克隆

  1. 从6孔板中吸出培养基，用2 mL 1× PBS清洗各孔。吸除PBS后，加入1 mL含有10 µM Y27632的酶解细胞解离液解离hiPSCs。将培养板放回培养箱，在37 °C、5% CO2条件下孵育4分钟。
  2. 使用1,000 µL移液器将解离的hiPSCs从培养板上冲洗下来，并转移至15 mL锥形管中。用2 mL新鲜预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基清洗培养板，一并收集至同一锥形管中。在20 °C下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀用2 mL新鲜预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基重悬。
  3. 计数细胞后，将1 × 106个细胞转移至新的锥形管中。在20 °C下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀用1 mL冰冷的无血清hiPSC冻存液重悬，分装至冻存管中，置于冻存盒内于-80 °C过夜。次日转移至液氮罐中进行长期保存。

7. 人诱导多能干细胞质量控制

  1. hiPSC 形态学表征
    1. 使用20倍物镜的相差显微镜检查hiPSC的典型形态。重编程后，细胞形态由细长的纺锤形成纤维细胞转变为小而圆形的hiPSC，核质比高，呈克隆状生长，克隆边界清晰。图2C).
    2. 如果hiPSC集落生长过于密集并出现自发分化，可使用移液器吸头将分化的部分从培养板上刮除（图3由于hiPSCs具有较高的增殖速率，需每天使用新鲜的预热hiPSC培养基对hiPSC培养物进行换液。
  2. 通过免疫荧光染色对多能性标志物的表征
    1. 检测所获得的hiPSCs的多能性标志物 通过 免疫荧光染色，将塑料盖玻片放入24孔板中，加入250 µL包被液，在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时2更换为1 mL预热的含10 µM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。
    2. 种子 1.9 x 104 每24孔板接种解离的hiPSCs。置于37 °C、5% CO₂条件下过夜，使hiPSCs贴壁。2 无干扰。参见步骤 5.4 至 5.6 用于hiPSC的解离。次日更换为不含ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。
    3. 染色时，用1 mL预热的1×PBS洗涤细胞，随后在室温下用4%多聚甲醛固定hiPSCs 10分钟。用1×PBS洗涤固定后的hiPSCs，并在每孔中加入200 µL预孵育液，在室温下封闭非特异性结合位点1小时。用抗体稀释液将一抗Ki67（1:300）、OCT3/4（1:200）、SSEA4（1:100）稀释。
    4. 用70%乙醇清洁塑料膜，将其放入含有水槽的染色盒中。在膜上滴加30 µL一抗稀释液。将固定的样品倒置在抗体稀释液滴上，于4 °C孵育过夜。
    5. 次日，用1×PBS将样品清洗3次，每次5分钟。在铝箔的洁净区域滴加30 µL的二抗稀释液（1:1,000），将盖玻片倒扣于稀释液滴上。室温避光孵育1小时。
    6. 孵育后，用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。将样品置于含DAPI的封片剂中，盖在载玻片上。室温避光干燥过夜，然后使用共聚焦显微镜观察样品（图4).
  3. 排除细菌和支原体污染
    1. 排除细菌 污染，将 500 µL 解离的 hiPSCs 转移至 5 mL 预热的 Luria-Bertani (LB) 培养基中。参见步骤 5.4 至 5.6 用于hiPSCs的解离。在37 °C下孵育过夜。如果LB培养基出现浑浊，则表明有细菌 很可能发生了污染。弃用该细胞。
    2. 为排除支原体污染，从6个培养孔中收集已培养约90%融合度的hiPSCs且未更换的培养基，培养时间为2天。采用定量聚合酶链式反应（qPCR）检测支原体污染。目前有多种商用支原体检测试剂盒可供使用。

8. 将人诱导多能干细胞分化为足细胞

  1. 生长因子的制备与保存
    1. 配制10 mM Y27632储备液：将10 mg Y27632（分子量为320.26 g/mol）溶于3.12 mL无菌水中。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。使用时按1:1,000比例加入细胞培养基，使终浓度为10 µM。
    2. 配制30 mM CHIR99021储备液：将5 mg CHIR99021（分子量465.34 g/mol）溶于358.2 µL无菌DMSO中。分装为50 µL每份，于-20 °C保存。使用时按1:10,000比例加入细胞培养基，终浓度为3 µM。
    3. 为制备100 µg/mL的激活素A储备液，将100 µg激活素A溶解于1 mL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS中。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。使用时以细胞培养基按1:2,000比例稀释，得到终浓度为50 ng/mL的溶液。
    4. 制备100 µg/mL的储备液 骨形态发生蛋白7（BMP7），将100 µg BMP7溶解于含0.1% BSA的1 mL无菌水中。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。使用时以细胞培养基按1:2,000比例稀释，终浓度为50 ng/mL。
    5. 配制100 µg/mL的血管内皮生长因子（VEGF）储备液，将100 µg VEGF溶解于1 mL无菌水中。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。使用时按1:4,000比例加入细胞培养基，使终浓度为25 ng/mL。
    6. 为制备10 mM的全反式维甲酸储备液，将10 mg全反式维甲酸溶解于3.33 mL无菌DMSO中。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。使用时以细胞培养基按1:100稀释，得到终浓度为0.5 µM的工作液。
  2. 激活WNT信号通路以诱导中胚层谱系分化
    1. 将适合 hiPSC 培养的细胞培养板或培养瓶用包被液在 37 °C、5% CO₂ 条件下包被 1 小时，用于 hiPSC 向 hiPSC 来源足细胞的分化2每6孔培养板使用1 mL包被液，每10 cm细胞培养板使用4 mL包被液。
    2. 吸弃培养基，用预热的1×PBS洗涤hiPSC。吸弃PBS，加入含有10 µM Y27632的酶解细胞解离溶液，每6孔培养板加入总体积1 mL，每10 cm细胞培养板加入4 mL。
    3. 将培养板放回培养箱，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 4 分钟2用1,000 µL移液器将hiPSCs从培养板上冲洗下来，转移至锥形管中。
    4. 用含有 10 µM ROCK 抑制剂 Y27632 的新鲜预热的 hiPSC 培养基洗涤培养板。将洗涤液收集至锥形管中，以中和消化试剂。在 200 x g 在20 °C下孵育5分钟。吸除上清液，用2 mL含有10 µM ROCK抑制剂Y27632的新鲜预热hiPSC培养基重悬细胞沉淀。
    5. 计数细胞并接种 1 x 104 hiPSCs/cm2. 通过在各个方向轻轻摇晃三次使细胞分散均匀。将hiPSCs置于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使其贴壁。2 无干扰地
    6. 次日，将培养基更换为2 mL预热的中胚层分化培养基，其中含有1× B27添加剂、1%青霉素-链霉素、3 µM CHIR99021、50 ng/mL激活素A和10 µM ROCK抑制剂Y27632。
  3. 分化为肾单位祖细胞
    1. 2天后，将中胚层诱导培养基更换为2 mL预热的肾单位祖细胞分化培养基（每6孔板）或6 mL（每10 cm细胞培养皿），培养基中含1× B27添加剂、1%青霉素-链霉素、3 µM CHIR99021、50 ng/mL activin A和50 ng/mL BMP7。此后每隔一天换液一次，持续14天。
      注意：在肾单位祖细胞扩增培养基中分化7天后，肾单位祖细胞可增殖，并可传代和冻存。
    2. 将适合 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿用包被液在 37 °C 下包被 1 小时，以分离肾单位祖细胞。弃去包被液，加入肾单位祖细胞扩增培养基。吸除培养基，用预热的 1x PBS 洗涤细胞。移除 PBS，用 1x 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞。
    3. 37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟2使用相差显微镜观察细胞脱落情况。如有必要，轻敲塑料器皿侧面以促进细胞从表面脱落。用预热的肾祖细胞扩增培养基冲洗细胞并转移至锥形管中。用与解离试剂相同体积的预热肾祖细胞扩增培养基洗涤空的培养瓶或培养板。
    4. 将洗涤液收集至锥形管中，在200 x g条件下离心 g 在20 °C下孵育5分钟。吸除上清液，用2 mL新鲜预热的肾单位祖细胞扩增培养基重悬细胞沉淀。计数细胞，并以1.5 × 10⁵个细胞接种4 每平方厘米肾单位祖细胞2 以进行进一步分化。
      注意：要冻存肾单位祖细胞，将 1 x 106 将细胞重悬于1 mL冷的无血清冻存液中，转移至冻存管。于-80 °C冻存容器中过夜，随后转移至液氮罐中长期保存。
    5. 将培养板放回培养箱，通过在各个方向振荡三次使细胞均匀分布。次日更换为新鲜的预热肾单位祖细胞分化培养基。每隔一天更换一次培养基，持续在肾单位祖细胞分化培养基中培养细胞至第14天完成分化。
  4. 终末分化为hiPSC来源的足细胞
    1. 吸弃培养基，每孔6孔板加入2 mL预热的足细胞分化培养基（含1× B27补充剂、1%青霉素-链霉素、3 µM CHIR99021、50 ng/mL activin A、50 ng/mL BMP7、25 ng/µL VEGF和0.5 µM全反式维甲酸），或每10 cm细胞培养皿加入6 mL。将培养板放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。2每隔一天更换一次培养基，共更换4次，每次均使用新鲜的预热足细胞分化培养基.
    2. 为维持分化后的hiPSC来源足细胞的培养，每周使用足细胞维持培养基喂养细胞两次 含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒。
      ​注意：终末分化的hiPSC来源的足细胞不再增殖。然而，可在细胞培养中维持长达4周。
  5. 解冻与扩增冻存的肾单位祖细胞
    1. 在37 °C、5% CO₂条件下，用适合hiPSC培养的包被液对新的细胞培养塑料培养瓶进行包被处理1小时2用5 mL肾单位祖细胞扩增培养基替换包被液。
    2. 在15 mL锥形管中加入7 mL预热的肾祖细胞扩增培养基。将冻存的细胞在37 °C水浴中静置解冻约20秒。当细胞部分融化且仍有冰晶存在时，立即将冻存管从水浴中取出。
    3. 用70%乙醇喷洒冻存管，并置于生物安全柜中。将解冻后的细胞转移至含有预热肾祖细胞扩增培养基的锥形管中。使用1,000 µL移液器，缓慢沿管壁滴加细胞悬液。
    4. 用1 mL肾祖细胞扩增培养基冲洗空的冻存管，以收集残留细胞，并将冲洗液合并至锥形管中。在200 x g 在20 °C下孵育5分钟，将细胞沉淀重悬于新鲜的预热肾单位祖细胞扩增培养基中。
    5. 将解冻的细胞转移至包被好的培养瓶中，并于次日更换为新鲜的预热肾单位祖细胞扩增培养基。在进一步分化前，使用肾单位祖细胞扩增培养基培养细胞，每隔一天换液一次，使其增殖，随后进行步骤8.3.5。

9. 通过免疫荧光染色对人诱导多能干细胞分化而来的足细胞进行表征

  1. 为通过免疫荧光染色检测分化足细胞中足细胞特异性标志物，将塑料盖玻片置于24孔板中，每孔加入250 µL包被液，在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。弃去包被液，每孔加入1 mL预热的肾单位祖细胞扩增培养基。每孔接种2.5 × 10⁴个解离的肾单位祖细胞。参见步骤8.3.2 至 8.3.4 用于肾单位祖细胞的解离。
  2. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下静置过夜，使其贴壁。次日，更换为预热的肾单位祖细胞分化培养基。
  3. 每隔一天更换一次培养基，直至细胞在肾单位祖细胞分化培养基中完成总共14天的分化过程 并在足细胞分化培养基中额外培养5天。
  4. 最终分化后，用1 mL预热的1×PBS洗涤细胞。在室温下用4%多聚甲醛固定hiPSC来源的足细胞10分钟。用1×PBS洗涤固定后的细胞，并在室温下每孔加入200 µL预孵育液封闭非特异性结合位点，孵育1小时。
  5. 在含有水槽的染色盒中，将洁净的塑料膜上滴加30 µL抗体稀释液稀释的一抗溶液，一抗包括synaptopodin（1:200）、podocin（1:100）和nephrin（1:25）。
  6. 将固定好的hiPSC足细胞爬片倒置放入稀释液中，4 °C孵育过夜。次日，用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。将二抗按1:1,000比例用1×PBS稀释，在锡箔纸上洁净处滴加30 µL二抗稀释液。将爬片倒置放入二抗稀释液中。
  7. 室温避光孵育1小时。孵育结束后，用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。将样品置于含DAPI的封片剂中，封于载玻片上。室温避光静置过夜，使其干燥。使用共聚焦显微镜对样品进行成像。

结果

通过结合表观遗传重编程与定向分化的分步操作方案，可获得携带患者在足细胞相关基因中突变的足细胞。这使得能够分析疾病特异性的足细胞改变。 离体在整个方案的不同细胞阶段，患者的遗传背景均得以保留。此外，通过使用由hiPSC诱导分化的足细胞，可克服终末分化且无增殖能力的足细胞细胞数量不足的局限性。尽管从皮肤成纤维细胞扩增并诱导生成hiPSC来源的足细胞需要数月时间 通过 将细胞重编程为hiPSCs并进一步分化为足细胞的过程中，可在该实验方案的三个不同步骤冷冻保存细胞（图2）。成纤维细胞、hiPSCs 以及在肾单位前体细胞分化培养基中分化 7 天后的肾单位前体细胞均可进行冻存。因此，可建立工作细胞库并开展大规模实验。

游离型重编程示意图，包含hiPSCs及足细胞分化；显微镜图像。
图2：通过相差显微镜观察本实验方案的各个步骤。(A) 扩展生长的真皮成纤维细胞。(B) 重编程后hiPSC克隆的形成。(C) 筛选后的hiPSC培养物。(D) 分化2天后的中胚层细胞。(E) 在肾单位前体细胞分化培养基中分化14天后的肾单位前体细胞。(F) 终末分化的hiPSC来源的足细胞。标尺代表300 µm (A,B,D-F) 和150 µm (C)。雪花图标标示了可能的冻存步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

由于生成的hiPSC来源的足细胞需经历一个涉及细胞类型和形态剧烈变化的长周期实验流程，因此必须对细胞进行表征。细胞形态（如大小和形状）以及生长行为可通过相差显微镜进行观察。成纤维细胞呈细长的纺锤形表型，大小为150 µm至300 µm（图2A）。重编程后，出现直径约50 µm的小型hiPSC克隆。这些克隆具有清晰的边界，hiPSC表现出较高的核质比和增殖速率（图2C）。由于足细胞为终末分化的细胞，随着分化进程的推进，其增殖速率逐渐降低，细胞形态转变为直径约300 µm的星形足细胞，并具有明显的足突结构（图2F）。

融合度是hiPSC培养中的一个关键指标，当细胞集落生长过于密集时，可能出现自发分化（图3）。在传代前，必须通过刮除培养皿上受影响区域的方式将这些集落清除。

细胞培养显微镜图像，六种类型：细胞形态，300 μm 比例尺。光学分析。
图3：不同质量的hiPSCs示例。 成功（A）重编程的hiPSC克隆和（B）筛选后的hiPSCs的相差显微图像，以及（C）自发分化、（D,E）非hiPSC克隆和（F）密度过高的hiPSC培养物。比例尺为300 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

本方案中不同类型的细胞必须通过特定标志物的表达进行验证。重编程后，人诱导多能干细胞（hiPSCs）恢复多能性，并表达诸如SSEA4、OCT3/4和Ki67等增殖及多能性标志物（图4）38,39,40。已知重编程过程以及hiPSCs的长期培养和分化可能导致核型异常，或诱发突变41。因此，应通过G显带分析和全外显子组测序，在不同传代阶段对培养细胞的遗传背景进行长期监测。

免疫荧光分析：细胞标志物 Ki67、OCT3/4、SSEA4；显微镜图像，比例尺 100 µm。
图 4：通过免疫荧光染色对生成的 hiPSCs 进行表征。 通过染色检测生成的 hiPSCs 中的增殖标志物 Ki67（A），以及多能性标志物（B）OCT3/4 和（C）SSEA4。比例尺为 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

形态学上，hiPSC 分化而来的足细胞呈星形，与 ciPodocytes 相比，具有明显更发达的初级和次级足突网络（图 5）。hiPSC 分化而来的足细胞表达足细胞特异性的标志蛋白，如突触足蛋白（synaptopodin）、肾病蛋白（nephrin）和足蛋白（podocin）（图 6A-C）42。

健康供体来源的hiPSC分化足细胞与ciPodocytes的相差显微镜和扫描电镜图像，显示细胞形态差异。
图5：hiPSC来源的足细胞与ciPodocytes的形态学比较。通过相差显微镜（A,C）和扫描电子显微镜（B,D）比较（A,B）健康供体来源的hiPSC分化足细胞与（C,D）ciPodocytes的细胞形态及伪足结构。比例尺代表150 µm（A,C）和20 µm（B,D）。 请点击此处查看该图的高清版本。

因此，不仅可对来自健康供体的 hiPSC 分化足细胞进行比较，还可对来自具有足细胞特异性基因突变患者的 hiPSC 分化足细胞进行比较，从而实现对患者突变的个体化特征分析 离体.

iPSC 分化来源的 cPodocytes 蛋白表达；突触足蛋白、肾足蛋白、足蛋白；显微镜图像
图6hiPSC来源的足细胞和ciPodocytes中足细胞特异性标志物的表征 比较（A-C健康供体来源的hiPSC分化足细胞D-F) 关于足细胞特异性标志物蛋白——synaptopodin（A,D），nephrin（B，E)，以及足蛋白（podocin）C，F。比例尺表示 50 µm. 请点击此处以查看该图的放大版本。

表1. 本研究中使用的所有细胞培养基和溶液的组成。 请点击此处下载该表格。

讨论

本基于细胞培养的实验方案结合了将人皮肤成纤维细胞通过附加体型重编程技术转化为患者特异性hiPSCs，并进一步将hiPSCs分化为足细胞的过程。该方案使我们能够研究遗传性肾小球疾病患者足细胞中与突变相关的损伤性改变。通过电穿孔法采用无整合方式重编程皮肤成纤维细胞的方案改编自Bang等人的已发表研究32以及Okita等人的研究33。将hiPSCs分化为足细胞的方案则改编自Musah等人已发表的方案28,34,35。目前已有多篇文献描述了从hiPSCs生成足细胞的方法27,34,35。然而，本文所提供的方案在hiPSCs向足细胞分化的过程中经过优化，成本更低。与Musah等人已发表的方案相比，我们测试了多种包被试剂，包括玻连蛋白（vitronectin）、层粘连蛋白silk-511（laminin silk-511）以及可溶性基底膜基质。玻连蛋白和层粘连蛋白silk-511的使用浓度可从原先的5 µg/mL降低至2.5 µg/mL28,34,35。此外，两种价格昂贵的生长因子BMP7和激活素A（activin A）的浓度也可降低50%，从100 ng/mL降至50 ng/mL。

这使得分化成本更低。第7天的肾单位祖细胞仍处于增殖状态，且此前已证明其具有冷冻保存的可行性。我们在解冻后、最终分化前，将这些细胞在含有达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）和B27的基礎培养基中扩增数天，进一步降低了成本。除分化步骤外，本方案还描述了从皮肤活检组织中培养出成纤维细胞，并通过附加体型重编程方法继而生成患者特异性hiPSCs的过程。via 这两种方法的结合，可实现患者特异性足细胞的生成。因此，本文提供了一套完整且逐步详尽的方案，用于生成患者特异性的hiPSC来源足细胞，此类方案此前尚未如此详细地报道过。

由于整个实验方案涉及多种不同的细胞类型，因此在不同步骤中对所获得的细胞类型进行表征至关重要。细胞需要长时间培养，因此应在不同的传代阶段进行质量控制。在培养hiPSCs时，必须每天更换培养基，并持续监测细胞状态和形态。分化培养基必须通过0.2 µm滤膜过滤以确保无菌。从皮肤活检到获得hiPSC来源的足细胞，整个流程需要数月时间，但可在不同阶段对细胞进行冻存。成纤维细胞、筛选出的hiPSC克隆，以及在肾单位前体细胞分化培养基中培养7天后的增殖性肾单位前体细胞均可冻存，从而建立工作细胞库。

尽管由hiPSC分化而来的健康足细胞会形成明显的初级和次级足突网络（图 5A，B）并表达 典型的足细胞特异性标志物（图6A-C），特征性的裂孔隔膜，如所见 体内，这在传统的二维细胞培养模型中难以模拟。此外，在这种单层培养体系中，无法实现与其他肾小球细胞类型的细胞间通讯。

由于足细胞处于终末分化状态且缺乏增殖能力，因此难以对其进行研究 离体通过条件性永生化足细胞技术，借助插入温度敏感型开关，可克服这一局限性，从而建立一种细胞培养模型：该模型中的细胞在33 °C时增殖，在37 °C时分化。13,14尽管这些ciPodocytes在足细胞研究中具有很高的应用潜力，但仍存在一些局限性，例如标志物表达缺失、去分化的形态特征以及无法形成足突结构。15,16.

由患者来源的体细胞分化出足细胞，可实现对病变足细胞与健康对照细胞的生成及比较 离体这使我们能够研究足细胞特异性基因突变导致的足细胞损伤。此外，利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）有望构建三维细胞培养疾病模型，即类器官。43,44将hiPSC分化的足细胞与其他肾小球细胞（如肾小球内皮细胞或系膜细胞）进行共培养，可能有助于深入理解健康状态及肾小球疾病中的细胞间通讯机制。

此外，可对患者特异性的足细胞进行表征和治疗 离体 在高通量分析中，这种个体化方法为研究特定突变的新型治疗靶点以及未来实现个体化医疗提供了可能。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学临床跨学科研究中心（IZKF）资助，资助编号为 M4-IZKF-F009，授予雅尼娜·穆勒-德莱尔；同时由德国联邦教育和研究部（BMBF）资助，项目名称为 STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS，资助编号为 01GM2202D，授予雅尼娜·穆勒-德莱尔。我们感谢安娜莱娜·克劳斯在拍摄扫描电镜图像方面提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 无菌滤器RotilabP668.1用于分化培养基的无菌过滤
全反式维甲酸Stem Cell Technologies72262分化过程中的添加物
B27 添加剂（50 倍浓度），无血清Gibco17504044用于无血清分化培养基的添加剂
BG iMatrix-511 SilkbiogemsRL511S包被液中使用的细胞外基质试剂的额外选择，用于包被适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的细胞培养塑料器皿
牛血清白蛋白（BSA） Roth8076.4
CELLSTAR 带滤盖细胞培养瓶，T75，250 mLGreiner bio-one82050-856适用于成纤维细胞培养的细胞培养塑料器皿
CHIR99021（5 mg）Sigma-Aldrich252917-06-9 分化过程中的添加物
Corning Matrigel hESC 认证基质 Corning354277包被液中使用的细胞外基质试剂的额外选择，用于包被适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的细胞培养塑料器皿（溶解的基底膜基质）
Countess 细胞计数板InvitrogenC10283用于细胞计数
Countess II FL  自动细胞计数仪Invitrogen用于细胞计数
冷冻管，2 mL，QuickSeal 螺口盖，白色Sarstedt72380用于细胞冷冻保存的冻存管
二甲基亚砜（DMSO） RothA994.1用于成纤维细胞冻存液
DMEM/F12（1:1）（1 倍浓度）Gibco11320074分化培养基的基础培养液
DMEM/F12 + GlutamaxGibco10565018成纤维细胞培养基的基础培养液
EVOS M5000 成像系统Thermo Fisher ScientificAMF5000相差显微镜
优质胎牛血清，灭活（FCS）PAN BiotechP301902用于成纤维细胞培养基、成纤维细胞冻存液及足细胞维持培养基的血清
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus，4 mm 间隙，800 µL 容量，无菌FisherbrandFB104用于成纤维细胞电穿孔/附加体质粒重编程的比色皿（4 mm 间隙）
含 DAPI 的 Fluoromount-G 封片剂Invitrogen00-4959-52含 DAPI 的封片介质
针头（0.6 × 30 mm）BD Microlance3300700用于将 hiPSC 克隆分离成小块
人重组 Activin A 蛋白78001.1Stem cell technologies分化过程中的添加物
人重组骨形态发生蛋白 7（BMP7）Peprotech120-03P分化过程中的添加物
人 VEGF-165 重组蛋白Thermo ScientificPHC9394分化过程中的添加物
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100 倍浓度）Gibco41400045足细胞维持培养基的添加剂
LB 培养基RothX964.1用于 hiPSC 培养的无菌检测
LookOut 支原体 PCR 检测试剂盒Sigma AldrichMP0035-1KT商用支原体检测试剂盒
显微镜载玻片Diagonal GmbH & Co.KG21,102
微量离心管 1.5 mL Sarstedt72706400
mTeSR1 完整试剂盒Stem Cell Technologies85850无血清 hiPSC 培养基的基础培养液
Nalgene 冷冻容器 Mr.FrostyRothAC96.1 用于确保最佳冷冻条件
正常山羊血清abcamab 7481用于预孵育溶液和抗体稀释液
Nunc 24 孔板Thermo Scientific142485适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
Nunc 48 孔板 Thermo Scientific152640适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
Nunc 6 孔板 Thermo Scientific140685适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
Nunc EasYDish 培养皿 100 mmThermo Scientific150466适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
Nunc MicroWell 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板Thermo Scientific167008适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
NutriFreez D10 冷冻保存培养基Sartorius05-713-1E 无血清冷冻保存培养基，用于 hiPSC 和肾单位前体细胞的冷冻保存
Opti-MEMGibco11058021电穿孔培养基 
pCXLE-hMLNAddgene#27079用于附加体质粒重编程的质粒
pCXLE-hOCT3/4 质粒Addgene#27077用于附加体质粒重编程的质粒
pCXLE-hSK 质粒Addgene#27078用于附加体质粒重编程的质粒
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333-100ML用于防止细菌污染
塑料盖玻片Sarstedt  83.1840.002用于 hiPSC 及 hiPSC 来源足细胞的免疫荧光染色
ROTI HistofixRothP087.3商用多聚甲醛（4%），用于细胞固定
RPMI 1640 + L-谷氨酰胺Gibco21875034足细胞维持培养基的基础培养液
染色室 StainTray 黑色盖RothHA51.1
StemPro Accutase 细胞解离试剂GibcoA1110501用于 hiPSC 解离的酶解细胞脱离溶液
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（1 倍浓度）Gibco14190094用于洗涤和包被
无菌水RothT1432
20 mL 无针头注射器BD Plastipak300629用于过滤灭菌分化培养基
TC 培养皿 100 mmSarstedt8,33,902无菌细胞培养塑料器皿，用于皮肤活检切割和成纤维细胞培养
TC 培养皿 35 mmSarstedt8,33,900无菌细胞培养塑料器皿，用于从皮肤活检中培养出成纤维细胞
曲拉通 X-100Roth3051.3用于预孵育溶液 
台盼蓝染色液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪InvitrogenT10282用于细胞计数
胰蛋白酶-EDTA（10 倍浓度） BiowestX0930-100用于成纤维细胞和肾单位前体细胞的解离试剂
15 mL 离心管Greiner bio-one188271-N
50 mL 离心管Greiner bio-one227261
无动物成分的玻连蛋白（vitronectin ACF）Sartorius05-754-0002包被液中使用的细胞外基质试剂，用于包被适用于 hiPSC 培养的细胞培养塑料器皿
Y-27632 二盐酸盐（10 mg）Tocris1254用于防止 hiPSC 在传代过程中发生凋亡
一抗
OCT4 Stem Cell Technologies60093.1多能性标志物，稀释比例 1:200
SSEA-4Stem Cell Technologies60062FI.1多能性标志物，稀释比例 1:100
Ki67Abcamab15580增殖标志物，稀释比例 1:300
突触足蛋白（synaptopodin）Proteintech21064-1-AP足细胞特异性标志物，稀释比例 1:200
肾病蛋白（nephrin）ProgenGP-N2足细胞特异性标志物，稀释比例 1:25
足蛋白（podocin）proteintech20384-1-AP足细胞特异性标志物，稀释比例 1:100
二抗
山羊抗豚鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555InvitrogenA21435二抗，稀释比例 1:1000
Alexa Fluor 647 山羊抗兔 SFX 试剂盒，高度交叉吸附InvitrogenA31634二抗，稀释比例 1:1000
驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488InvitrogenA21206二抗，稀释比例 1:1000
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555InvitrogenA21422二抗，稀释比例 1:1000
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488InvitrogenA11001二抗，稀释比例 1:1000

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