建立与验证新生小鼠右心室容量负荷过重模型

摘要

本方案介绍了通过建立小鼠腹部动静脉瘘（AVF）来构建和验证出生后右心室容量负荷（VO）模型的方法，该模型可用于研究容量负荷对出生后心脏发育的影响。

摘要

右心室（RV）容量超负荷（VO）在患有先天性心脏病的儿童中较为常见。由于存在不同的发育阶段，与成人相比，儿童的右心室心肌对容量超负荷的反应可能有所不同。本研究旨在通过改良的腹部动静脉瘘术建立小鼠出生后的右心室容量超负荷模型。为确认容量超负荷的建立以及右心室随后发生的形态学和血流动力学变化，术后3个月内进行了腹部超声、超声心动图及组织化学染色检测。结果显示，出生后小鼠手术的存活率和动静脉瘘成功率均处于可接受水平。在容量超负荷小鼠中，右心室腔扩大，游离壁增厚，术后2个月内每搏输出量增加了约30%–40%。此后，右心室收缩压升高，出现相应的肺动脉瓣反流，并伴有小肺动脉的重塑。综上所述，改良动静脉瘘（AVF）手术可用于建立出生后小鼠的右心室容量超负荷模型。考虑到瘘管闭合及肺动脉阻力升高的可能性，应用前必须通过腹部超声和超声心动图确认模型状态。

引言

右心室（RV）容量超负荷（VO）在先天性心脏病（CHD）患儿中较为常见，可导致病理性心肌重构及不良的长期预后^1,2,3。深入理解右心室重构机制及相关早期靶向干预措施，对于改善CHD患儿的预后至关重要。成人与儿童心脏在分子结构、生理功能以及对刺激的反应方面存在诸多差异^1,4,5,6。例如，在压力超负荷作用下，新生心脏主要表现为心肌细胞增殖，而成人心脏则以纤维化为主^5,6。此外，许多对成人心力衰竭有效的药物在儿童心力衰竭治疗中无效，甚至可能造成进一步损伤^7,8。因此，从成年动物实验中得出的结论不能直接应用于幼年动物。

多年来，动静脉瘘（AVF）模型已被用于在不同物种的成年动物中诱导慢性心脏容量超负荷（VO）及相应的心功能障碍^{9,10,11,12,13}。然而，关于该模型在出生后小鼠中的应用知之甚少。在我们之前的研究中，通过建立腹部动静脉瘘成功构建了出生后小鼠的容量超负荷模型，并进一步证实了出生后心脏右心室（RV）发育轨迹的改变^14,15,16,17。

为了探讨当前模型中经过改进的手术过程及其特征，本文提供了一份详细的操作方案；本研究对该模型进行了为期3个月的评估。

方案

本研究中所有操作均遵循《赫尔辛基宣言》所规定的原则，并经上海儿童医学中心动物福利与人体研究委员会批准（SCMC-LAWEC-2023-003）。实验采用C57BL/6小鼠幼崽（出生第7天，雄性，体重3-4 g）。动物购自商业来源（见材料表）。小鼠幼崽及其哺乳母鼠（幼崽数与母鼠数之比为6:1，同笼饲养）在SPF级实验动物环境中饲养，光照-黑暗周期为12小时交替，温度控制在22 ± 2 °C，自由饮水并饲喂营养饲料。将幼崽随机分为两组：视神经损伤（VO）组和假手术（sham）组。

1. 设备和手术器械准备

注意：所有材料/设备的商业信息均列在材料表中。

1. 确保以下设备已准备就绪并正常运行：手术台（泡沫塑料板）、吸入式麻醉机、带垂直照明和内置摄像头的显微镜、配备24 MHz换能器的超声设备以及恒温加热平台。
2. 对手术器械进行灭菌处理（即微型持针器、尖头镊子和圆柄Vannas弹簧剪刀）。
3. 准备以下耗材：带线的11-0和9-0外科缝合针（锥形针头）、胶带条、5 mL注射器针头、2-0丝线（用于手术固定）、无菌棉签以及超声耦合剂。
4. 确保备有以下试剂：聚维酮碘、70%乙醇、无菌生理盐水、异氟烷、对乙酰氨基酚、眼科软膏和脱毛膏。

2. 手术步骤

注意：动静脉瘘手术步骤根据先前描述的方法进行了修改¹¹。图1展示了新生小鼠动静脉瘘手术的示意图。

1. 麻醉与固定
   1. 将新生小鼠放入麻醉诱导箱中，以1 L/min的流速通入2%异氟烷/氧气，持续2分钟 。使用结核菌素注射器经口给予对乙酰氨基酚（0.1 ml，80 mg/2.5 ml）。
   2. 将幼鼠仰卧位固定于手术台上，通过鼻吸入1.5%异氟烷，气体流速为0.8 L/min以维持麻醉状态。用固定针头绑住幼鼠四肢以调整其体位。在幼鼠眼部涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
   3. 轻捏麻醉后幼鼠尾部以检测其疼痛反应；若无明显躯体活动，则表明麻醉效果充分。
2. 动静脉瘘手术
   1. 用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次进行皮肤消毒，然后铺巾。从下腹部至剑突下切开腹壁和腹膜，充分暴露腹腔，注意避免损伤腹腔内器官。滴加无菌生理盐水以保持外露器官湿润。
   2. 使用棉签轻轻将胃肠道和膀胱移离手术区域，以清晰观察腹膜后方的腹主动脉（AA）和下腔静脉（IVC）。将手术台逆时针旋转90°，并调节显微镜放大倍数，以便清晰观察两条横向走行的血管。
   3. 在肾动脉远端约1 cm处，以11-0缝合针（直径 = 0.07 mm）从腹主动脉斜向穿刺进入下腔静脉建立动静脉瘘。通过观察下腔静脉是否出现血液搏动性充盈及动静脉血混合现象，确认造瘘成功。
   4. 随后，立即使用干燥棉签施加适当压力压迫出血点15秒。尽快将胃、肠和膀胱复位至腹腔内，以促进止血。
   5. 使用9-0缝线以毯边缝合法缝合腹壁和腹膜。停止麻醉，给予幼鼠100%氧气1分钟。
3. 麻醉复苏
   1. 将幼鼠置于38 °C加热平台上。待其完全清醒并恢复活力后，将其送回哺乳母鼠身边。整个操作过程约持续15分钟。
      ​注意：本研究中假手术组接受相同操作步骤，但不进行穿刺。

3. 瘘管的超声确认

注意：超声设备的常规操作与先前报道一致^18,19。

1. 通过腹部超声确认瘘管
   1. 麻醉诱导后（步骤 2.1.1），用胶带将小鼠仰卧位固定在加热平台上。然后使用超声耦合剂将小鼠连接至心电图（ECG）监测仪。以 0.8 L/min 的流速维持 1.5% 异氟烷麻醉。
   2. 使用脱毛膏处理胸部和腹部皮肤。数秒后，用浸有温水的棉签擦除脱毛膏。将探头（24 MHz）置于腹部中线，并将探头标记旋转至小鼠头部方向。
   3. 将平台向小鼠左侧或右侧移动，使用 B 模式和彩色多普勒模式观察血管的长轴视图及血流信号^18,19。通过脉冲波多普勒模式测量腹主动脉（AA）、下腔静脉（IVC）和瘘管处的血流速度，以确认动静脉瘘（AVF）通畅性。
      注：超声下成功建立瘘管的表现为在腹主动脉与下腔静脉之间可见湍流信号（图 2C）。动静脉瘘部位的多普勒血流速度显著升高，相比之下腹主动脉的收缩期速度相对较低（图 2A、C）。此外，与下腔静脉正常的血流模式（图 2B）相比，靠近动静脉瘘的下腔静脉血流呈现脉动波形，也证实了瘘管的成功建立（图 2D）。
2. 通过超声心动图确认容量超负荷
   1. 将平台尾端部分向下倾斜，将探头（24 MHz）置于胸部，并将探头标记旋转至小鼠右肩方向。使用 B 模式和彩色多普勒模式观察改良胸骨旁长轴切面中的肺动脉（PA）。
   2. 采用脉冲波多普勒模式测量肺动脉内的血流信号，包括速度时间积分（PA-VTI）、肺动脉瓣直径（PAD）、肺动脉加速时间（PAT）和右心室射血时间（RVET）（图 2E、F 和 图 3A、B）。
   3. 取连续三次测量结果的平均值作为超声参数。使用以下公式计算右心室每搏输出量（RVSV，mL）和右心室收缩压（RVSP，mmHg）²⁰：
      RVSV [mL] = 1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - index + 63.7
      注：考虑到超声测量的偏差，若容量超负荷（VO）小鼠的右心室每搏输出量（RVSV）或肺动脉速度时间积分（VTI_PA）较假手术组小鼠增加>15%，则认为存在右心室容量超负荷（图 2E、F）。

结果

术后3个月内生存率及动静脉瘘通畅率
在VO组中，共有30只（75%）小鼠在动静脉瘘手术后存活，而假手术组中有19只（95%）小鼠存活（图4A）。在VO组中，有8只小鼠于术后1天内死亡，其中5只死于出血过多，3只死于同类相食；另有2只小鼠在术后1个月时因不明原因死亡。

在存活的VO小鼠中（n = 30），术后超声证实21只小鼠成功建立了动静脉瘘，这些动静脉瘘在术后1周（P14）保持通畅，并持续至术后2周（P21）。然而，7只小鼠的动静脉瘘在术后1个月时闭合，2只小鼠在术后2个月时闭合。在术后3个月的随访中，仅有12只小鼠仍维持动静脉瘘通畅。术后1周、2周、1个月和2个月的动静脉瘘通畅率分别为70%、70%、46.7%和40%（图4B）。

右心血流动力学变化
血流动力学参数的3个月随访显示，在术后2个月内，各组小鼠的PAD和RVS...

讨论

既往通常采用瓣膜反流方法建立经典的右心室容量超负荷（RV VO）模型²¹；然而，与动静脉瘘（AVF）相比，开胸心脏瓣膜手术可能需要更复杂的技术，且术后死亡率显著更高，尤其是在新生小鼠中。动物实验已表明，动静脉瘘（AVF）可达到与瓣膜反流相同的容量超负荷效果²²，因此本研究采用创伤更小的改良腹部动静脉瘘手术。

在手术过程中需考虑若干因素，以成功建立瘘管。首先，该手术在未进行气管插管和辅助通气的新生小鼠中进行，因此必须根据幼鼠的动态状况及时调整麻醉参数，以避免因呼吸衰竭导致死亡。其次，幼鼠在手术期间胃部和膀胱常处于充盈状态，因此需要轻柔细致的操作，以充分暴露腹膜后血管结构，同时避免损伤脆弱的腹腔器官。第三，在幼鼠中结扎腹主动脉（AA）以防止严重动脉出血的操作难度较大，因此在穿刺后需立即使用棉签进行止血压迫。此后，腹膜后组织和腹腔器官可能进一步对出血部位产生压迫作用。此外，需注意过度压迫可能导致瘘管早期失效。

与成年小鼠右心室流出道梗阻（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇	Tiandz,Chia
对乙酰氨基酚口服溶液	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
麻醉机	RWD Life Science,中国	R550IP
麻醉面罩	RWD Life Science,中国	68680
C57BL/6 小鼠	Xipu’er-bikai 实验动物有限公司（中国上海）
脱毛膏	Veet, 法国	VT-200
苏木精-伊红染色试剂盒	碧云天生物技术	C0105M
异氟烷	RWD Life Science,中国	R510-22-10
显微镜	玉研仪器, 中国	SM-301
外科缝合针	宁波医用针厂有限公司, 中国
恒温加热平台	青岛聚创环保集团有限公司, 中国
超声设备	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	成像模式包括B型模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式
超声耦合剂	Parker Laboratories,美国	REF 01-08
超声探头	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400