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测量 O2 消耗在 黑腹果蝇 使用库仑法微量呼吸测定技术

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DOI：

10.3791/65379

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2023年7月7日

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1Department of Biology, University of Maryland, College Park, Universities at Shady Grove

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

库仑呼吸测定法适用于测量小型生物的代谢率。经改进后可用于 黑腹果蝇 在本研究中，测定了 O2 消耗量处于野生型报道的范围内 D. melanogaster 由先前的研究。每只果蝇的O2 消耗由 CASK 突变体体积更小且活性更低，其活性显著低于野生型。

摘要

库仑微呼吸测定法是一种简单且低成本的方法，用于测量小型生物体的 O2 消耗，同时维持稳定的环境条件。库仑微呼吸计由一个密闭的腔室组成，在该腔室内生物体消耗 O2，其产生的 CO2 则被吸收剂介质清除。由此引起的压力下降会触发电解产生 O2，并通过记录生成该 O2 所消耗的电量来测定其产量。在本研究中，该方法已针对小群体测试的 Drosophila melanogaster 进行了优化，仪器的灵敏度和环境条件均调整至高度稳定状态。野生型果蝇在此装置中测得的 O2 消耗量与先前研究结果一致。CASK 突变体体型较小且活动能力已知较弱，其按质量标准化的 O2 消耗率与同源背景对照组相比无显著差异。然而，由于 CASK 突变体个体体型较小，导致单只果蝇的 O2 消耗总量显著降低。因此，该微呼吸计能够准确测量 D. melanogaster 的 O2 消耗，可区分不同基因型之间的细微差异，为代谢速率的测定提供了一种多功能工具。

引言

测量代谢率的能力对于全面理解生物体在其环境背景下的生理特征至关重要。例如，要理解代谢率在寿命1、饮食对代谢的影响2或缺氧应激阈值3中的作用，均需对代谢率进行测定。

测量代谢率主要有两种通用方法4直接量热法通过测量产热量来直接测定能量消耗。间接量热法通过其他方式测量能量产生，通常通过呼吸测量法测定氧气消耗量。2 消耗（VO₂），CO2 产热或两者兼有。尽管直接量热法已应用于包括小型变温动物在内的研究， 黑腹果蝇5呼吸测量法在技术上更简单，且更为常用。

已成功使用多种形式的呼吸测定法来测量野生型和突变型的代谢率 D. melanogaster 并揭示了温度对代谢的影响6社会环境3，饮食3,7,以及神经发育障碍8....

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方案

1. 果蝇的培养与收集

  1. 将果蝇饲养在含有标准 Drosophila 食物的窄瓶中，温度保持在 25 °C。
    注意：每种基因型的样本量应至少包含九个重复，每个重复为一个呼吸测定室，内含 15–25 只果蝇，具体设置如下文所述。
  2. 每隔 2–3 天转移一次果蝇。
  3. 用 CO2 麻醉果蝇，收集每种基因型的 15–25 只雄性果蝇，将每组果蝇放入装有新鲜未接种酵母的食物瓶中。
    注意：使用雄性果蝇可减少因生殖状态不同带来的变异性。该方法同样适用于雌雄两性。
  4. 让果蝇在 25 °C 下恢复至少 24 小时。
    注意：实验时果蝇应为 1–4 日龄。通过调整步骤 1.3 中所述收集频率，可进一步缩小果蝇的年龄范围。

2. 呼吸室的设置与组装

  1. 打开水浴锅，并将温度设定为实验所需的温度。
    注意：以下实验均在 25 °C 下进行，使用 50 mL 施伦克管作为反应室。各组件应按照 图 1A、1B 和 1C 所示进行组装。
  2. 用实验室擦拭纸喷上 70% 乙醇（切勿直接喷在磨口接头处），彻底清洁反应室和传感器塞的磨口接....

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结果

呼吸测量仪控制器的压力和电流输出显示了某次实验中一个腔室的数据 图3A第一个长电流脉冲使腔室从环境压力（约992 hPa）加压至预设的关闭阈值1017 hPa。当果蝇消耗氧气时，腔室内的压力下降2 和 CO2 被吸收后，压力缓慢下降，直至达到1016 hPa的开启阈值，从而激活了通过O的电流2 发生器。在所示示例中，每个脉冲的平均幅度为50.1 mA，持续时间为16.1 s，每次脉冲的电荷转移量约为0.81库仑（C）。该腔室在总时长240.0 min内的总电荷转移量为3.28 C。根据操作步骤中所述的计算方法，结合果蝇的质量和数量（23只果蝇，总质量为14.9 mg），O2 该组在该室内的消耗量为 3.19 mL h-1 g-1 或 2.07 µL h-1 果蝇-1.

该设备易于安装，仅需最少的培训即可操作，并可在多次组装和关闭循环中稳定运行。然而，.......

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讨论

上述步骤展示了 O 的测量方法2 消耗在 D. Melanogaster 使用电子库仑微呼吸仪。所得氧气数据2 野生型中的消耗 D. melanogaster 均在以往大多数使用不同方法的研究报道的范围内（表1）尽管略低于其他研究报道的结果3,6.

关键步骤解决了该方法的两个绝对要求：气密性密封和环境稳定性。维持气密环境虽然直接但需要谨慎操作。施伦克烧瓶和试管非常适合作为呼吸测定室。玻璃材质可避免许多塑料材料中存在的气体渗透问题19，这在长时间实验中尤为关键。标准磨口接头可与含有传感器和电子连接件的塞子实现气密连接。活塞阀提供可靠的密封，并可在实验过程中根据需要打开或关闭。为确保每次实验的气密性，需检查活塞阀，彻底清洁接头，适量涂抹洁净的硅脂，并使用凯克夹具固定接头。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢亚利桑那大学的Linda Restifo博士建议测试CASK突变体的O2消耗，并提供了CASK突变体及其同源对照品系。出版费用由学院公园大学生物系的部门再投资基金提供。研究空间和部分设备由Shady Grove校区各大学提供。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
19/22 温度计适配器Wilmad-LabglassML-280-702传感器插头
2 ml 螺口管Fisher3464O2 发生器
2针连接器Zyamy40PIN-RFB10O2 发生器：剪裁为2针
4针母头连接器TE Connectivity215299-4传感器插头
5 ml 聚丙烯管Falcon352063剪裁至5.5 cm并打孔 
50 ml 施伦克管，19/22 接口LaboyHMF050804反应室
6芯电缆Zenith6-Conductor 26 ga电缆
6针母头面板连接器Switchcraft17982-6SG-300控制器
6针母头连接器Switchcraft18982-6SG-522传感器插头
6针公头连接器Switchcraft16982-6PG-522电缆
800 µl 离心管Fisher05-408-120苏打石灰滤芯
ABS 塑料外壳Bud IndustriesPS-11533-G控制器
Arduino Nano EveryArduino LLCABX00028控制器
BME 280 传感器DIYMallFZ1639-BME280传感器插头
电路板Lheng5 X 7 cm控制器
硫酸铜BioPharmBC2045O2 发生器
计算机AzulleByte4数据采集
棉卷Kajukajudo#2对半剪开用于堵塞果蝇管
四等分用于调节湿度
环境培养箱PercivalI30 VLC8果蝇饲养
环氧树脂JB WeldPlastic Bonder固定 O2 发生器中的电极
果蝇饲料Lab ExpressType R果蝇饲养
Keck 夹具uxcella20092300ux0418将反应室玻璃接口固定至插头
低粘度环氧树脂LoctiteE-30CL传感器插头
OLED 显示屏IZOKEEIZKE31-IIC-WH-3控制器
24号铂丝uGems14349O2 发生器
硅脂Dow-Corning高真空润滑脂密封反应室与插头连接处
苏打石灰JorvetJO553CO2 吸收
拨动开关E-Switch100SP1T1B1M1QEH控制器
USB 线缆SabrentCB-UM63控制器
USB 集线器AtollaHub 3.0连接控制器与计算机
水浴锅Amersham56-1165-33温度控制
水浴槽Glass Cages15升无边亚克力呼吸测定仪用水浴

参考文献

  1. Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
  2. Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.

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