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方法文章

测量 O2 消耗在 黑腹果蝇 使用库仑法微量呼吸测定技术

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⸱

DOI：

10.3791/65379

⸱

2023年7月7日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland, College Park, Universities at Shady Grove

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

库仑呼吸测定法适用于测量小型生物的代谢率。经改进后可用于 黑腹果蝇 在本研究中，测定了 O2 消耗量处于野生型报道的范围内 D. melanogaster 由先前的研究。每只果蝇的O2 消耗由 CASK 突变体体积更小且活性更低，其活性显著低于野生型。

摘要

库仑微呼吸测定法是一种简单且低成本的方法，用于测量小型生物体的 O2 消耗，同时维持稳定的环境条件。库仑微呼吸计由一个密闭的腔室组成，在该腔室内生物体消耗 O2，其产生的 CO2 则被吸收剂介质清除。由此引起的压力下降会触发电解产生 O2，并通过记录生成该 O2 所消耗的电量来测定其产量。在本研究中，该方法已针对小群体测试的 Drosophila melanogaster 进行了优化，仪器的灵敏度和环境条件均调整至高度稳定状态。野生型果蝇在此装置中测得的 O2 消耗量与先前研究结果一致。CASK 突变体体型较小且活动能力已知较弱，其按质量标准化的 O2 消耗率与同源背景对照组相比无显著差异。然而，由于 CASK 突变体个体体型较小，导致单只果蝇的 O2 消耗总量显著降低。因此，该微呼吸计能够准确测量 D. melanogaster 的 O2 消耗，可区分不同基因型之间的细微差异，为代谢速率的测定提供了一种多功能工具。

引言

测量代谢率的能力对于全面理解生物体在其环境背景下的生理特征至关重要。例如，要理解代谢率在寿命1、饮食对代谢的影响2或缺氧应激阈值3中的作用，均需对代谢率进行测定。

测量代谢率主要有两种通用方法4直接量热法通过测量产热量来直接测定能量消耗。间接量热法通过其他方式测量能量产生，通常通过呼吸测量法测定氧气消耗量。2 消耗（VO₂），CO2 产热或两者兼有。尽管直接量热法已应用于包括小型变温动物在内的研究， 黑腹果蝇5呼吸测量法在技术上更简单，且更为常用。

已成功使用多种形式的呼吸测定法来测量野生型和突变型的代谢率 D. melanogaster 并揭示了温度对代谢的影响6社会环境3，饮食3,7,以及神经发育障碍8。这些方法可分为两类，其成本和复杂性差异较大。测压法是最简单且最经济的方法。9,10，其中将果蝇放入含有CO的密闭 chamber 中2 吸收性且相连的 通过 细毛细管连接至流体储液池。随着O2 被消耗，且产生 CO2 吸收后，腔内压力降低，液体被吸入毛细管。因此，毛细管中充满液体的体积与 V 成正比O₂更复杂的版本，可补偿毛细管内液体施加的力，也已应用于 D. melanogaster1测压法具有操作简单、成本低廉的优点，但因其对压力敏感，需要保持恒定的环境条件。此外，由于消耗的 O₂2 未被替换时，O的分压2 (PO₂) 在腔室内逐渐降低。

利用气体分析进行的呼吸测定也常用于黑腹果蝇（D. melanogaster）。在此方法中，定期从密闭的果蝇饲养 chamber 中采集气体样本，并送至红外分析仪进行检测2,6,11。此类装置的优点在于可商业化获取、对环境条件的敏感性较低，且在采样过程中气体得以更新，从而维持氧分压（PO2）的稳定。然而，该设备可能价格昂贵且操作复杂。

一种新近开发的库仑微呼吸测定仪12为现有系统提供了一种低成本、高灵敏度且稳定的替代方案。在实际操作中，将生物体置于一个密闭腔室内，其消耗O2，呼出的CO2则被吸收材料清除，从而导致腔室内压力净下降。当内部压力降至预设阈值（开启阈值）时，电流通过电解O2发生器，使压力回升至第二个阈值（关闭阈值），电解过程随之停止。通过O2发生器的电荷转移量与重新加压腔室所需的O2量成正比，因此可用于测量生物体消耗的O2量4。该方法灵敏度高，可精确测定VO2，且通过定期补充O2，可在数小时甚至数天内将PO2维持在近乎恒定的水平。

本研究中使用的库仑法微量呼吸计采用了一种多模式（压力、温度和湿度）电子传感器。该传感器由单片机控制，可检测微小的压力变化，并在达到低压阈值时启动 O2 生成12。该装置由现成部件组装而成，可与多种不同类型的呼吸室和实验环境配合使用，已成功用于研究体重和温度对黄粉虫甲虫 Tenebrio molitor 的影响。在本研究中，微量呼吸计已改进用于测量黑腹果蝇 D. melanogaster 的 O2 消耗量，其质量约为 T. molitor 的 1%。通过降低启动 O2 生成的阈值，提高了装置的灵敏度；同时，通过在控温水浴中进行实验并将呼吸室内湿度维持在 100% 或接近 100%，增强了实验环境的稳定性。

CASK（钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶）蛋白属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族，是多种多蛋白复合物中的分子支架蛋白；CASK 基因的突变与人类及D. melanogaster13,14中的神经发育障碍相关。一种可存活的D. melanogaster突变体CASKΔ18会破坏多巴胺能神经元的活性15，与同源对照相比，其活动水平降低超过50%14,16。鉴于CASK突变体活动水平降低，以及儿茶酚胺在调节代谢中的作用17，我们假设其标准代谢率以及相应的O2消耗量将显著低于对照组。

在CASKΔ18突变体果蝇及其野生型同窝果蝇w(ex33)中测量了O2消耗量。将多组果蝇放入呼吸测定室，测定O2消耗，计算O2消耗量，并以单位质量特异性及每只果蝇为基础进行表达。该装置记录到野生型果蝇的VO2值与先前研究结果一致，并能区分野生型果蝇与CASK突变体果蝇在每只果蝇基础上的O2消耗差异。

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方案

1. 果蝇的培养与收集

  1. 将果蝇饲养在含有标准 Drosophila 食物的窄瓶中，温度保持在 25 °C。
    注意：每种基因型的样本量应至少包含九个重复，每个重复为一个呼吸测定室，内含 15–25 只果蝇，具体设置如下文所述。
  2. 每隔 2–3 天转移一次果蝇。
  3. 用 CO2 麻醉果蝇，收集每种基因型的 15–25 只雄性果蝇，将每组果蝇放入装有新鲜未接种酵母的食物瓶中。
    注意：使用雄性果蝇可减少因生殖状态不同带来的变异性。该方法同样适用于雌雄两性。
  4. 让果蝇在 25 °C 下恢复至少 24 小时。
    注意：实验时果蝇应为 1–4 日龄。通过调整步骤 1.3 中所述收集频率，可进一步缩小果蝇的年龄范围。

2. 呼吸室的设置与组装

  1. 打开水浴锅，并将温度设定为实验所需的温度。
    注意：以下实验均在 25 °C 下进行，使用 50 mL 施伦克管作为反应室。各组件应按照 图 1A、1B 和 1C 所示进行组装。
  2. 用实验室擦拭纸喷上 70% 乙醇（切勿直接喷在磨口接头处），彻底清洁反应室和传感器塞的磨口接头，擦去传感器塞上的灰尘和旧润滑脂（图 1A）。再用一张干净的实验室擦拭纸将乙醇擦净。
  3. 将一段长约 1 cm、浸透纯水的棉卷放入反应室底部，以稳定湿度。
    1. 加入足量水（约 0.5 mL），使棉卷底部形成一小片水池。
  4. 擦去溅到反应室接头处的任何水分。
  5. 使用漏斗将果蝇转移至已标记的聚丙烯管中。
    1. 用棉卷塞住管口。
      注意：这些管子由 5 mL 聚丙烯试管裁剪而成，长度为 5.5 cm，并用热刀打孔，以便与实验腔室自由交换空气。已知 CO2 麻醉会引起代谢异常，因此果蝇在无麻醉条件下转移，此过程需更加小心以避免丢失果蝇。
  6. 将装有果蝇的通气管放入每个呼吸测定室中（置于湿润棉卷上方）。
  7. 在苏打石灰 cartridge 中填充 4–5 粒苏打石灰颗粒，并将其放置在反应室内装有果蝇的管子顶部。
    注意：苏打石灰 cartridge 由 800 µL 离心管制成，用电动钻头打孔 4–5 次。
  8. 向 O2 发生器中加入饱和硫酸铜（CuSO4）溶液，液面低于通气孔位置。
    注意：O2 发生器由带螺帽的离心管制成，螺纹下方钻有 4 个孔。铂（Pt）和铜（Cu）电极焊接在双针连接器上，插入管盖上钻出的孔中，并用环氧树脂固定。通过电解 CuSO4 溶液产生实验生物消耗的 O2。CuSO4 对无脊椎动物有毒，应避免溢出或泄漏，并立即清理。
  9. 将装填好的 O2 发生器连接到传感器塞上的双针连接器。
    注意：铜阴极必须连接控制器的负极输出端，铂阳极连接正极导线。若接反会导致实验失败。
  10. 在传感器塞的磨口接头两侧相对位置涂抹两小点透明硅脂。
  11. 将塞子插入反应室，并施加适度压力旋转塞子（或反应室），使硅脂在接头内均匀分布。
    1. 用实验室擦拭纸擦去多余的硅脂。
  12. 将塑料 Keck 夹扣在接头处，以固定反应室中的塞子。组装完成的反应室应如 图 1C 所示。
  13. 根据当天实验所用反应室数量，重复上述步骤。
    注意：可同时记录的反应室数量受限于可用反应室、控制器及计算机 USB 接口的数量。在本实验中，通常并行运行七个反应室。实验果蝇（如突变体）应配备相应的对照组。每次实验均应包含一个完全相同但不放置果蝇的反应室，作为环境变化的对照。含有不同处理条件（突变体、野生型、无果蝇）的反应室应在不同实验间轮换使用。
  14. 将组装好的反应室放入水浴锅的支架中，旋塞保持打开状态（图 1E）。
    注意：为避免昼夜节律的影响，所有实验中的反应室均在上午 9:30 至 9:50 之间放入水浴锅。
  15. 保持旋塞打开（手柄与旋塞平行）。
    注意：注意不要让水进入旋塞。
  16. 让反应室在旋塞打开状态下平衡约 30 分钟。
    ​注意：在反应室平衡期间，请连接电子设备并按以下说明设置数据采集系统。

3. 设置控制器和计算机

  1. 确保为O供电的开关2 发生器处于关闭位置（远离连接器）； 图1D).
  2. 将每个控制器盒插入可用的通用串行总线（USB）端口。
    注意：控制器单元的构建和编程在其他地方已有描述12.
  3. 使用六芯电缆将控制器连接到呼吸室。
  4. 检查控制器的有机发光二极管（OLED）显示屏图1D正在显示环境参数。
  5. 短暂开启 O2 使用控制器上的开关启动发生器（图1D).
    1. 若电流值从零增加至35至55 mA之间，则控制器和腔室已准备就绪，可进行实验。
  6. 确定控制器正在使用哪些COM端口，具体方法如下所述。
    1. 点击 开始 Microsoft Windows 中的图标
    2. 点击 设置 图标
    3. 点击 蓝牙 和 设备.
    4. 确保控制器及其COM端口出现在设备列表中。
  7. 在桌面上打开 PuTTY，并按照下述说明为呼吸计的每个通道设置日志文件。
    注意：PuTTY 是一款免费的安全外壳（SSH）和 Telnet 客户端，用于通过 COM 端口向计算机传输数据。
    1. 为控制器选择 COM 端口，请输入端口号 "串行线路" 盒图2A).
    2. 点击 记录.
    3. 选择可打印输出 "会话日志记录" (图2B).
    4. 在“日志文件名”下点击 浏览.
    5. 在所选文件夹中，创建一个包含描述性信息的文件名（例如、日期、物种、COM端口号）。
    6. 点击 保存.
    7. 点击 开放将打开一个窗口，显示以逗号分隔的记录数据（图2C).
    8. 对实验中使用的所有其他控制器重复上述步骤。每个COM端口的输入将显示为一个独立的窗口图 2D).

4. 运行实验

  1. 待室温平衡30分钟后，关闭旋塞以密封腔室。
  2. 用聚苯乙烯泡沫箱覆盖浴槽和腔室，以维持稳定的环境。
  3. 再平衡一小时。
  4. 打开电流至 O2 使用控制器盒上的开关启动每个腔室的发电机。
  5. 一旦 O2 发生器启动后，确保压力上升至预设的关闭压力。
    注意：使用1017 hPa，略高于大气压，作为参考压力 "关闭" 本系列实验中的压力。恢复至环境压力将指示腔室存在气体泄漏。此外，无论环境大气压如何，该方法均可在不同实验中使用相同的压力。 "开启" 气压为1016 hPa，意味着气压只需下降1 hPa，即可达到O2 发生器启动。这提供了足够的灵敏度以测量 O2 果蝇中的消耗量。一旦某个腔室被加压至 "关闭" 设置后，电流应降至零。
  6. 让实验持续运行3小时或更长时间。
    注意：较高的 VO₂ 在 较高温度可缩短实验时间。需偶尔监测以确保设备正常运行，但应避免在培养室附近频繁活动，以免影响温度稳定性。

5. 结束实验

  1. 关闭所有控制器上的 O2 发生器。
    注意：应首先执行此操作，以避免在舱室打开时运行 O2 发生器。
  2. 打开旋塞阀，解除舱室的密封状态。
  3. 保持 PuTTY 窗口开启 5–15 分钟，以提供最终基线数据。
  4. 关闭每个控制器的 PuTTY 窗口，结束记录。
    ​注意：所有实验均在下午 4:50 至 5:10 之间结束。
  5. 将传感器与电缆断开连接。
  6. 将舱室移至干燥架。
  7. 逐个从舱室中取出传感器塞。
  8. 断开 O2 发生器，并将其放入试管架中。
  9. 擦去传感器塞上的润滑脂，并将其保存在支架中。
  10. 清洁舱室接头处的润滑脂，并取出装有果蝇和苏打石灰的管子。
  11. 用 CO2, 对每根管子中的果蝇进行麻醉，轻敲至称量舟中，并用微量天平称重。
    1. 记录每根管子中果蝇的重量和数量。
  12. 丢弃果蝇，或将其保留用于其他附加实验步骤。
  13. 将筒 cartridge 中的苏打石灰倒入废液容器中。
  14. 打开 O2 发生器，将 CuSO4 溶液倒入废液容器中。
    1. 用纯化水冲洗电极和管子。
    2. 将试管架放置于干燥处。

6. 电荷转移数据的分析

  1. 将数据以逗号分隔的文本格式导入电子表格，每条记录分别构成一个独立的工作表。
  2. 记录 O2 发生器每次脉冲的电流和时间数据。从加压舱加压后的第一次脉冲开始，记录每次电流脉冲的起始时间和结束时间（以行号表示），即电流从零以上（通常升至约 45–50 mA）的第一行到电流最后一次高于零的行号。
  3. 在工作表中创建一个表格，用于记录以下数据：
    1. 脉冲期间的平均电流幅度：对每次脉冲（来自电流列），使用公式 = AVERAGE([脉冲首行]:[脉冲末行]) 计算。
    2. 脉冲持续时间：对每次脉冲（来自以毫秒为单位的时间列），使用公式 ([脉冲末行] - [脉冲首行 - 一行]) / 1000 计算。
    3. 总实验时间：[最后一次脉冲开始时的时间] - [加压舱加压后第一次脉冲结束时的时间]（来自以分钟为单位的时间列）。
  4. 然后计算每次脉冲的电荷转移量（Q）（平均电流 × 持续时间）。
  5. 对所有脉冲的电荷量求和，计算总电荷量（Qtot）。

7. O的分析2 消耗

  1. 为所有数据建立一个新的电子表格，并为每个腔室输入或计算以下内容：
    1. Qtot（总电荷）
    2. 摩尔数（= Q ÷ 96485 × 4）
    3. mL O2（= 摩尔数 × 22413 mL/mol）
    4. 总时间（来自上述数据分析）
    5. mL min-1（= mL O2 ÷ 总时间）
    6. 重量（克）（实验后麻醉并称重的果蝇）
    7. mL min-1 g-1（= mL min-1 ÷ 克重）
    8. mL/h/g（上述数值 × 60）
    9. mg/只（= 果蝇总重量 ÷ 果蝇数量）
    10. μL 只-1 h-1（= (mL min-1 × 3600) ÷ 果蝇数量）。
  2. 将每种处理条件（如基因型等）的数据制表
  3. 使用方差分析（ANOVA）、t检验或Mann-Whitney u检验13比较不同处理组。

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结果

呼吸测定仪控制器的压力和电流输出显示了某次实验中一个腔室的数据 图3A第一个长电流脉冲使腔室从环境压力（约992 hPa）加压至预设的关闭阈值1017 hPa。当果蝇消耗氧气时2 和 CO2 被吸收后，压力缓慢下降，直至达到1016 hPa的开启阈值，从而激活了通过O的电流2 发生器。在所示示例中，每个脉冲的平均幅度为50.1 mA，持续时间为16.1 s，每次脉冲的电荷转移量约为0.81库仑（C）。该腔室在总时长240.0 min内的总电荷转移量为3.28 C。根据操作步骤中所述的计算方法，结合果蝇的质量和数量（23只果蝇，总质量为14.9 mg），O2 该组在此室内的消耗量为 3.19 mL h-1 g-1 或 2.07 µL h-1 果蝇-1.

该设备易于安装，仅需最少的培训即可操作，并可在多次组装和拆卸循环中稳定运行。然而，必须定期对设备进行...

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讨论

上述步骤展示了 O 的测量方法2 消耗在 D. Melanogaster 使用电子库仑微呼吸仪。所得氧气数据2 野生型中的消耗 D. melanogaster 均在以往大多数使用不同方法的研究报道的范围内（表1）尽管略低于其他研究报道的结果3,6.

关键步骤解决了该方法的两个绝对要求：气密性密封和环境稳定性。维持气密环境虽然直接但需要谨慎操作。施伦克烧瓶和试管非常适合作为呼吸测定室。玻璃材质可避免许多塑料材料中存在的气体渗透问题19，这在长时间实验中尤为关键。标准磨口接头可与含有传感器和电子连接件的塞子实现气密连接。活塞阀提供可靠的密封，并可在实验过程中根据需要打开或关闭。为确保每次实验的气密性，需检查活塞阀，彻底清洁接头，适量涂抹洁净的硅脂，并使用凯克夹具固定接头。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢亚利桑那大学的Linda Restifo博士建议测试CASK突变体的O2消耗，并提供了CASK突变体及其同源对照品系。出版费用由学院公园大学生物系的部门再投资基金提供。研究空间和部分设备由Shady Grove校区各大学提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
19/22 温度计适配器Wilmad-LabglassML-280-702传感器插头
2 ml 螺口管Fisher3464O2 发生器
2针连接器Zyamy40PIN-RFB10O2 发生器：剪裁为2针
4针母头连接器TE Connectivity215299-4传感器插头
5 ml 聚丙烯管Falcon352063剪裁至5.5 cm并打孔 
50 ml 施伦克管，19/22 接口LaboyHMF050804反应室
6芯电缆Zenith6-Conductor 26 ga电缆
6针母头面板连接器Switchcraft17982-6SG-300控制器
6针母头连接器Switchcraft18982-6SG-522传感器插头
6针公头连接器Switchcraft16982-6PG-522电缆
800 µl 离心管Fisher05-408-120苏打石灰滤芯
ABS 塑料外壳Bud IndustriesPS-11533-G控制器
Arduino Nano EveryArduino LLCABX00028控制器
BME 280 传感器DIYMallFZ1639-BME280传感器插头
电路板Lheng5 X 7 cm控制器
硫酸铜BioPharmBC2045O2 发生器
计算机AzulleByte4数据采集
棉卷Kajukajudo#2对半剪开用于堵塞果蝇管
四等分用于调节湿度
环境培养箱PercivalI30 VLC8果蝇饲养
环氧树脂JB WeldPlastic Bonder固定 O2 发生器中的电极
果蝇饲料Lab ExpressType R果蝇饲养
Keck 夹具uxcella20092300ux0418将反应室玻璃接口固定至插头
低粘度环氧树脂LoctiteE-30CL传感器插头
OLED 显示屏IZOKEEIZKE31-IIC-WH-3控制器
24号铂丝uGems14349O2 发生器
硅脂Dow-Corning高真空润滑脂密封反应室与插头连接处
苏打石灰JorvetJO553CO2 吸收
拨动开关E-Switch100SP1T1B1M1QEH控制器
USB 线缆SabrentCB-UM63控制器
USB 集线器AtollaHub 3.0连接控制器与计算机
水浴锅Amersham56-1165-33温度控制
水浴槽Glass Cages15升无边亚克力呼吸测定仪用水浴

参考文献

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