克氏锥虫体外生命周期三个阶段的超微结构扩展显微镜

Summary

这项研究显示了在导致美洲锥虫病的病原体克氏锥虫的三个体外生命周期阶段进行超微结构扩增显微镜检查的详细方案。我们包括用于细胞骨架蛋白和泛蛋白质组标记的优化技术。

Abstract

我们在这里描述了超微结构扩展显微镜 （U-ExM） 在 克氏锥虫中的应用，该技术可以提高细胞或组织的空间分辨率以进行显微镜成像。这是通过使用现成的化学品和常见的实验室设备对样品进行物理扩增来实现的。

美洲锥虫病是由 克氏锥虫引起的广泛而紧迫的公共卫生问题。该病在拉丁美洲很普遍，由于移民增加，该病已成为非流行地区的一个重大问题。 T. cruzi 的传播是通过属于 Reduviidae 和 Hemiptera 家族的噬血昆虫媒介发生的。感染后， T. cruzi 无毛体在哺乳动物宿主体内繁殖并分化为锥鞭毛体，即非复制性血流形式。在昆虫媒介中，锥鞭毛体转化为上鞭毛体并通过二元裂变增殖。生命周期阶段之间的分化需要对细胞骨架进行广泛的重排，并且可以在实验室中完全使用不同的细胞培养技术进行重建。

我们在这里描述了 U-ExM 在克氏锥虫的三个体外生命周期阶段中应用的详细方案，重点是优化细胞骨架蛋白的免疫定位。我们还优化了 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （NHS） 的使用，这是一种泛蛋白质组标记，使我们能够标记不同的寄生虫结构。

Introduction

Boyden 等人于 2015 年首次描述了扩增显微镜 （ExM） ¹。这是一种成像方案，传统显微镜可以通过该方案实现低于衍射极限的空间分辨率。由于样品的物理放大而获得这种更高的分辨率。为了实现这一点，荧光标记的分子与水凝胶交联，随后水凝胶与水凝胶各向同性膨胀。由于这种扩展，信号在所有三个维度上几乎各向同性地分离。该方法采用低成本化学品，使用传统（共聚焦）显微镜可实现约 65 nm 的空间分辨率，大约是共聚焦显微镜标准分辨率（约 250 nm）的四倍¹。

使扩增显微镜在许多生物领域的使用成为可能的下一个里程碑是免疫荧光标记与常规抗体的适应²。最初发布的 ExM 方案的另一种改编是蛋白质组的放大分析 （MAP）³。该方法在样品水凝胶浸泡之前引入了高浓度丙烯酰胺和多聚甲醛的使用，以防止蛋白质内部和蛋白质间交联，从而更好地保存样品的蛋白质含量和亚细胞结构。该替代方案经过优化，以通过使用较低浓度的固定剂（甲醛/多聚甲醛和丙烯酰胺）来增强分离细胞器整体超微结构的保守性;这种方法被称为超微结构扩增显微镜 （U-ExM）⁴。

为了获....

Protocol

注意: 图 1 说明了完整的实验设计。

图 1:克氏锥虫三个体外生命周期阶段的 U-ExM 工作流程。请单击此处查看此图的较大版本。

1. 聚-D-赖氨酸包被的盖玻片的制备

1. 将 10 cm x 10 cm 见方的密封膜放入培养皿中。通过在 35 mm 玻璃培养皿中用无水乙醇浸泡来清洗盖玻片。
2. 用镊子从乙醇浴中取出盖玻片，然后用薄....

Results

如果协议已正确执行（图 1），样品将显示为平面和半透明凝胶，在水中可以膨胀至 4-4.5 倍（图 3A）。这种扩展提供了约 70 nm 的有效分辨率，该分辨率可能因最终膨胀因子和所采用的成像系统而异。在共聚焦显微镜中进行第二次膨胀过程和图像采集后，我们能够观察到大约 4.5 的膨胀因子。为了量化这种膨胀，我们测量了步骤 7.1 之前和之后的凝胶。此外，我们在非扩增和扩增寄生虫中用 α-微管蛋白抗体标记了表皮鞭毛体（图 3B）。

当使用抗微管蛋白抗体等细胞骨架标志物染色时，我们在上鞭毛体、锥鞭毛体和无鞭毛体中观察到这种蛋白质在微管和鞭毛轴丝的蝶结下紧身胸衣中的正确定位，突出了该技术在克氏锥虫的三个体外生命周期阶段中的价值（图 3C）。此外，当用 DAPI 染色时，可以清楚地区分细胞核中染色质的浓缩状态（插图

Discussion

超微结构膨胀显微镜是一种通过将生物样品物理膨胀到其原始尺寸的几倍来获得生物样品高分辨率图像的技术。U-ExM 协议涉及几个关键步骤，必须仔细执行这些步骤才能获得最佳结果⁴。首先，必须用 CP 试剂固定样品并包埋在可膨胀的水凝胶基质中。CP 溶液中存在的甲醛与丙烯酰胺的游离共价键相互作用，以防止与样品形成不需要的键。在该协议中，我们建议不要在 CP 步骤之前固定细胞，因为它会降低膨胀因子;但是，对于某些细胞器（例如基于膜的细胞器）来说，这是必要的¹⁵。值得一提的是，据报道，避免有时与化学固定相关的伪影形成的另一种方法是在扩增¹⁶ 之前对样品进行冷冻固定。

接下来，通过应用一系列缓冲液使水凝胶膨胀和拉伸，使样品进行物理膨胀。扩增后，用荧光探针对样品进行染色，并使用共聚焦显微镜成像。需要注意的是，固定剂、水凝胶基质和缓冲液条件的选择会极大地影响最终结果，仔细优化这些参数对于获得.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 微米无菌针式过滤器 PES	膜溶液	SFPES030022S
1 L 烧杯	Schott Duran	10005227
1.5 mL SPINWIN 微量离心管	Tarson	T38-500010
10 mL 一次性无菌 serynge	NP	66-32
10 mL 血清移液管 无菌	Jet Biofil	GSP211010
12 mm 盖玻片	Merienfeld GmbH	01 115 20	圆形盖玻片
12 孔板	Jet Biofil	TCP011012
22 mm 盖玻片	康宁	2845-22	方形盖玻片
24 孔板	Jet Biofil	TCP-011-024
250 mL 烧杯	Schott Duran	C108.1
3 mL 巴斯德移液管	Deltalab	200037
35 mm 玻璃底培养皿	松波玻璃工业	D11130H
4′，6-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐	Sigma Aldrich	D9542	DAPI
5 ml 血清移液管 无菌	Jet Biofil	GSP010005
6 孔板	Sarstedt	83.3920
阿克里酰胺	BioRad	1610101
过硫酸铵	Sigma Aldrich	A3678-25G	APS
ATTO 647 NHS 酯	BOC Sciences	F10-0107	用于泛蛋白质组标记
Biosafty 柜	Telstar	Bio II A/P
牛 钠 白蛋白钠	Sigma Aldrich	A7906	BSA
CO2 培养箱	Sanyo	MCO-15A
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 880
一次性 Petridish	Tarsons	460095	直径 90 毫米
DMEM，高葡萄糖	Thermo Fisher Cientific	12100046	粉末
电子数字卡尺	雷达	雷达-滑动-卡尺
乙醇	型 Supelco	1,00,98,31,000
胎牛血清	Internegocios SA	FCS FRA 500	无菌和热灭
斐济图像处理包	ImageJ		doi：10.1038/nmeth.2019
甲醛 37%	Sigma Aldrich	F8775	FA
玻璃 Petridish	Marienfeld Superior	PM-3400300	直径 60 毫米
葡萄糖 D（+）	Cicarelli
戊二醛 70%	Sigma Aldrich	G7776
山羊抗小鼠 IgG 二抗 Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422
山羊抗兔 IgG 二抗 FICT	Jackson Immunoresearch	115-095-003
量筒	Nalgene	3663-1000
刻度玻璃瓶	Glassco	GL-274.202.01	100 mL
加热块	IBR		内部制造
Hemin	Frontier Scientific	H651-9
盐酸 36.8-38.0%	Ciccarelli	918110
冰桶	康宁	1167U68
培养箱	Tecno Dalvo	TOC130
肝脏输液	Difco	226920
磁力搅拌器和加热器	实验室伴侣	HP-3000
金属刮刀	SALTTECH	200MM
金属镊子	Marienfeld Superior	PM-6633002
甲醇绝对值	Cicarelli	897110
微量离心管 1.5 mL	Tarson	500010-N
显微镜级纸 KimWipes	Kimtech Science	B0013HT2QW
Milli-Q 水系统	Merk Millipore	IQ-7003
小鼠抗 α 微管蛋白克隆 DM1A	Sigma Aldrich	T9026
小鼠抗 PFR	抗体		由 Ariel Silber 博士捐赠 （USP）
N，N&急性;-甲基恩比沙利胺	ICN	193997	BIS餐厅
Na 2 HPO 4	Cicarelli	834214
Neubauer 室	Boeco	BOE 01
p1000 移液器	Gilson	PIPETMAN P1000
p1000 移液器吸头	Tarson	TAR-521020B
p20 移液器吸头	Gilson	PIPETMAN P20
p20 移液器吸头	Tarson	TAR-527108
p200移液器	Gilson	PIPETMAN P200
p200 移液器吸头	Tarson	TAR-521010Y
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148	PFA
pH / ORP / °C 计	HANNA Instruments	HI 2211
聚-D-赖氨酸 0.1%	Sigma Aldrich	P8920
氯化钾	Cicarelli	867212	KCl
剃须刀片	Printex	BS 2982：1992
密封膜 "Parafilm M"	Bemis	PM996
丙烯酸钠	Sigma Aldrich	408220-25G	SA
碳酸氢钠	Cicarelli	929211	NaHCO3
> 氯化钠	Cicarelli	750214	NaCl
十二烷基硫酸钠	BioRad	1610302	SDS
Hidroxide 钠	Merk	1-06498	NaOH
Sorvall ST 16 离心机	Thermo Fisher Scientific	75004380
T-25 培养瓶	康宁	430639
TEMED	Invitrogen	15524-010
薄纸	Elite
Triptose	Merck	1106760500
Tris	BioRad	1610719
Tween-20	Biopack	2003-07	聚山梨酯 20
真空泵	Silfab	N33-A
Vero 电池	ATCC	CRL-1587
Vortex MIxer	Dragon Lab	MX-S