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体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

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DOI：

10.3791/65381

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2023年5月12日

 ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。

摘要

本文介绍了超结构扩展显微技术（U-ExM）在Trypanosoma cruzi中的应用，该技术可通过物理方式扩大细胞或组织样本，从而提高显微成像的空间分辨率。该方法使用现成的化学试剂和常规实验设备即可完成。

恰加斯病是一种由T. cruzi引起的广泛存在且亟待解决的公共卫生问题。该疾病在拉丁美洲流行，并由于人口迁移增加，已成为非流行地区的重要问题。T. cruzi通过属于猎蝽科（Reduviidae）和半翅目（Hemiptera）的吸血昆虫媒介传播。感染后，T. cruzi无鞭毛体在哺乳动物宿主细胞内增殖，并分化为上鞭毛体，即不具复制能力的血液形态。在昆虫媒介体内，上鞭毛体转化为前鞭毛体，并通过二分裂方式进行增殖。生活史各阶段之间的转化需要细胞骨架发生广泛重组，这一过程可通过多种细胞培养技术在实验室中完全重现。

本文详细描述了在Trypanosoma cruzi的三个体外生命周期阶段中应用U-ExM的技术方案，重点优化了细胞骨架蛋白的免疫定位。我们还优化了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）的使用，这是一种全蛋白质组标记物，使我们能够标记不同的寄生虫结构。

引言

膨胀显微技术（ExM）由 Boyden 等人于 2015 年首次提出1。该技术是一种成像方案，可使常规显微镜实现突破衍射极限的空间分辨率。这种更高分辨率的获得源于样本的物理性放大。为实现这一点，将荧光标记的分子交联至水凝胶中，随后通过水使水凝胶发生各向同性的膨胀。由于这种膨胀，信号在三个维度上几乎实现各向同性的分离。该方法使用低成本化学试剂，借助常规（共聚焦）显微镜即可实现约 65 nm 的空间分辨率，相比标准共聚焦显微镜的分辨率（约 250 nm）提高了约四倍1。

推动扩展显微镜技术在多个生物学领域广泛应用的下一个里程碑，是将传统抗体用于免疫荧光标记的改进方法2。对最初发表的ExM方案的另一项改进是蛋白质组放大分析技术（magnified analysis of the proteome, MAP）3。该方法在样品与水凝胶浸润前引入高浓度丙烯酰胺和多聚甲醛，以防止蛋白质内部及之间的交联，从而更好地保留样品中的蛋白质含量和亚细胞结构。另一种替代方案则通过降低固定剂（甲醛/多聚甲醛和丙烯酰胺）的浓度，优化了分离细胞器整体超微结构的保存效果，该方法被称为超微结构扩展显微镜技术（ultrastructure expansion microscopy, U-ExM）4。

为了获得更高的分辨率，已有研究报道将扩展显微镜技术（ExM）与超分辨率显微技术相结合，包括受激辐射耗尽显微镜（stimulated emission depletion microscopy）或单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy），以实现低于20 nm的分辨率5。

ExM 的应用已在神经科学和细胞骨架研究领域被广泛报道6，但针对寄生性原生生物的研究尚不多见。本实验室首次报道了U-ExM在 T. cruzi7该基础方案主要基于此前的U-ExM相关研究报告 弓形虫（Toxoplasma gondii），疟原虫（Plasmodium） ssp.，以及 布氏锥虫8,9,10,11.

扩展显微技术（ExM）最大的优势之一是其模块化特性，这使其能够灵活地适应不同的生物样本。该实验方案可分为多个步骤（如固定、防止交联或凝胶化），用户可根据实验需求轻松调整各个步骤。此外，该流程还可进行修改，以增强与特定模式生物的兼容性，或实现特定的分辨率。因此，ExM 在先进与非先进的光学系统中均具有巨大潜力，确保了其未来更广泛的应用前景。

恰加斯病（Chagas disease），又称美洲锥虫病，是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的一种原生动物寄生虫病，流行于拉丁美洲。该寄生虫的生活史复杂，在哺乳动物宿主中经历两个发育阶段，在昆虫宿主（锥蝽科Triatominidae家族成员）中也经历两个阶段，后者是该病的生物传播媒介。恰加斯病属于世界卫生组织列出的被忽视热带病之一，是拉丁美洲重大的经济和社会问题。流行病学研究估计，全球约有800万人感染恰加斯病，每年死亡人数超过10,000人。这些数据凸显了恰加斯病在全球范围内作为公共卫生问题的重要性。近年来，该病的地理分布发生了变化，由于人口迁移增加，许多感染者现已居住在全球各大城市地区，而不再局限于最初发现该病的拉丁美洲农村地区12。

T. cruzi 在其生命周期中表现出不同的发育阶段，这些阶段可完全在体外（in vitro）进行模拟。无鞭毛体（epimastigotes）是存在于昆虫媒介中的增殖形态，其细胞体中央区域有一个球形细胞核，动基体（一种动质体类特有的含线粒体DNA的结构）呈杆状，位于细胞核前方，并具有一条游离的鞭毛。锥鞭毛体（trypomastigotes）为感染性非增殖形态，具有细长的细胞核、位于后端的圆形动基体，以及一条沿寄生虫全长附着于质膜的鞭毛。细胞内增殖形态为前鞭毛体（amastigotes），其细胞核位于中央区域，动基体呈杆状，位于细胞体前部，鞭毛退化。该寄生虫对不同环境的适应能力正是这些形态变化的体现。此外，这一生命周期涉及对称分裂以及多种过渡性发育阶段13。在分化过程中，锥虫科原虫的细胞骨架发挥着关键作用。该结构由定位于质膜下方、有序排列的稳定微管组成的皮层下微管束构成，形似束带。此外，这些生物体内还存在副鞭毛棒（paraflagellar rod），这是一种晶格状结构，与鞭毛轴丝平行并与其相连14。在整个细胞周期的不同阶段，精确的细胞骨架组织和核结构变化依赖于锥虫科原虫特有的独特基因调控机制，使其成为细胞生物学研究中极具价值的模型系统。

鉴于其尺寸较小 T. cruzi 以及其他原生动物寄生虫，U-ExM 为分析这些重要病原体的结构特征提供了极佳的工具。如前所述，该技术在 T. cruzi 首次由Alonso博士验证7本报告详细阐述了一套完整的U-ExM实验流程，重点介绍在不同生活周期阶段对细胞骨架蛋白进行免疫定位的方法 T. cruzi此外，我们优化了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）的使用，这是一种全蛋白质组标记物，可使我们标记多种寄生虫结构。此外，一个 体外 描述了获取寄生虫三个阶段的方法。

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方案

注意：图1 展示了完整的实验设计。

锥虫病生命周期图解；显微镜制片；扩展显微技术；免疫荧光。
图 1：克氏锥虫（T. cruzi）体外生命周期三个阶段的U-ExM工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 多聚-D-赖氨酸包被盖玻片的制备

  1. 将一片10 cm × 10 cm的封口膜放入培养皿中。将盖玻片置于35 mm玻璃培养皿内的无水乙醇中浸泡，以清洗盖玻片。
  2. 用镊子将盖玻片从乙醇中取出，并用纸巾吸去多余液体。将盖玻片放置在封口膜上。
  3. 用显微镜级纸巾吸干残留的乙醇。在盖玻片中央加入0.1%（v/v）的多聚-D-赖氨酸溶液，并用移液枪头轻轻涂抹，使其覆盖约80%的表面。盖上培养皿，在37 °C孵育1小时。
    注意：对于22 mm2的盖玻片，使用200 µL多聚-D-赖氨酸溶液；对于12 mm圆形盖玻片，使用100 µL多聚-D-赖氨酸溶液。
  4. 用超纯水洗涤盖玻片三次。每次洗涤后使用真空抽吸法去除水分。可在4 °C保存最多1周。

2. 溶液配制

  1. 配制 38% (w/w) 丙烯酸钠 (SA) 的储备液。
    1. 在搅拌条件下，缓慢将 19 g SA 加入 31 mL 无核酸酶水中。
      注意：该溶液黏度很高；移液时需格外小心。
    2. 待 SA 完全溶解后，将其储存于无菌容器中，4 °C 保存，每 6 个月更换一次。
      注意：不同品牌的 SA 有时会因混有聚丙烯酸钠而出现污染迹象，在配制储备液时表现为溶液呈淡黄色且浑浊。若出现此情况，请谨慎使用。
  2. 配制 40% (w/v) 丙烯酰胺 (AA) 储备液和 2% (w/v) N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 (BIS) 储备液。将每种化合物分别溶于超纯水中，并用 0.22 µm 无菌注射器滤器过滤，储存于无菌容器中，4 °C 保存。
    注意：AA 和 BIS 为高毒性物质，操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的防护装备（手套、防护服、口罩和护目镜）。
  3. 通过将 38 µL 37% 甲醛 (FA) 溶液与 50 µL 40% 丙烯酰胺储备液（步骤 2.2）在 912 µL 磷酸盐缓冲液 (PBS；表 1) 中混合，配制蛋白交联抑制 (CP) 溶液，最终浓度为 1.4% 甲醛和 2% 丙烯酰胺。
    注意：CP 溶液必须现用现配，移液时务必精确。例如，使用 P1000 移液器吸取 900 µL PBS，使用 P20 移液器吸取剩余的 12 µL PBS。
  4. 配制单体溶液
    注意：新配制的溶液不可立即使用；需在 -20 °C 下至少储存 24 小时后再使用。
    1. 取 500 µL 38% SA 溶液（步骤 2.1）、250 µL 40% AA 溶液、50 µL BIS 溶液（步骤 2.2）以及 100 µL 10x PBS（表 1），混合均匀。
    2. 将上述 900 µL 总体积分装至 10 个 1.5 mL 无菌微量离心管中，每管 90 µL 单体溶液。-20 °C 下可保存至多 2 周。
      注意：由于 SA 溶液黏度高，移液时可能附着在吸头表面；请小心操作，确保完全排空。
  5. 配制变性溶液
    1. 在 250 mL 烧杯中，将 114.3 mL 用超纯水配制的 350 mM 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液与 10 mL 用超纯水配制的 4 M 氯化钠溶液混合，边搅拌边加入 12 g Tris。
      注意：SDS 具有高毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。
    2. 用浓盐酸调节 pH 至 9，用超纯水定容至 200 mL，储存于无菌瓶中，4 °C 保存。
  6. 配制 10% 过硫酸铵 (APS) 溶液和 10% 四甲基乙二胺 (TEMED) 溶液。
    1. 将 0.1 g APS 溶于 1 mL 超纯水中。
    2. 用 1 mL 超纯水配制 10% TEMED 溶液。
    3. 将两种溶液分别分装为 100 µL 等份，装入 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 下可保存至多 1 个月。
  7. 配制多聚甲醛溶液。
    1. 在 60 °C 条件下搅拌，将 2 g 多聚甲醛溶于 40 mL PBS 中，逐滴加入 1 M NaOH，直至溶液由白色变为无色。
      注意：甲醛具有高毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。
    2. 冷却至室温，用 NaOH 调节 pH 至 7.2，最终体积为 50 mL。用 0.22 µm 无菌注射器滤器过滤，储存于无菌容器中。
    3. 将溶液分装为 1 mL 等份，装入 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 保存。
  8. 配制多聚甲醛/戊二醛溶液。
    1. 将 0.2 g 多聚甲醛加入 3.5 mL 超纯水中，再加入 50 µL 16 M NaOH 溶液，加热至 60 °C 以溶解多聚甲醛。
    2. 冷却后加入 300 µL 70% 戊二醛，用超纯水定容至 5 mL，最后用 PBS 定容至 10 mL。
      注意：多聚甲醛和戊二醛均为高毒性物质，操作时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服、口罩和护目镜。
    3. 将溶液分装为 1 mL 等份，装入 1.5 mL 无菌微量离心管中，-20 °C 保存。

3. 寄生虫培养物的制备

  1. 培养 T. cruzi 无鞭毛体。
    1. 在T-25培养瓶（25 cm2 生长面积）中使用无菌培养体系，并通过每48–72小时在含10%胎牛血清（FCS；表1）的肝脏浸出蛋白胨培养基（LIT）中传代培养，使培养物保持在对数生长期。
    2. 确保瓶盖紧闭，将培养瓶垂直置于28 °C条件下培养。每次传代时使用血球计数板对寄生虫生长情况进行监测。
      注：本研究所用Dm28c菌株在对数生长期的无鞭毛体浓度为每毫升1–5 × 107 个寄生虫。
    3. 取对数生长期的无鞭毛体，用含10% FCS的LIT培养基制备成每毫升含2 × 106 个无鞭毛体的悬液。在室温（RT）下以5,000 × g 离心10分钟。用PBS洗涤一次或两次后，重悬于200 µL PBS中。
    4. 将上述悬液接种至预先用聚-D-赖氨酸包被的圆形12 mm盖玻片上（第1节）。在室温下孵育15–20分钟。随后进入防止交联步骤（第4节）。
      注：也可在寄生虫贴附于盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用多聚甲醛/戊二醛溶液在室温固定10分钟。固定后的寄生虫可在4 °C保存最多1周。
  2. 从感染的Vero细胞中获取无鞭毛体。
    1. 将无菌的圆形12 mm盖玻片放置于24孔组织培养板底部。用含2%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）制备每毫升含2 × 105 个Vero细胞的悬液。每孔接种500 µL。
      注：本研究使用含2% FCS的DMEM，以减缓细胞生长速度。
    2. 在37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜（ON；12–16小时），以确保细胞贴壁。
    3. 孵育结束后，用500 µL无菌PBS洗涤细胞两次。每孔加入含2% FCS的DMEM 100 µL，并以感染复数（MOI）为10的比例加入 T. cruzi 鞭毛体（即每孔约一百万个鞭毛体）。在37 °C、5% CO2 条件下孵育6小时。
    4. 孵育后，用PBS洗涤培养板两次，每孔加入500 µL含2% FCS的DMEM。此时继续进行防止交联步骤（第4节）。
      注：感染后第2天可通过倒置光学显微镜观察到胞质内的无鞭毛体（补充图1）。也可在寄生虫贴附于盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用多聚甲醛/戊二醛在室温固定10分钟。
  3. 从感染的Vero细胞中获取鞭毛体。
    1. 在感染鞭毛体（MOI 1:10，过夜孵育）4天后，收集Vero细胞单层（30%–40%融合度）的上清液。
      注：对于T-25培养瓶，初始接种Vero细胞数量为80万个；对于T-75培养瓶，则为200万个细胞。
    2. 使用血球计数板测定鞭毛体浓度。在室温下以7,000 × g 离心4 × 106 个鞭毛体10分钟。
    3. 用PBS洗涤两次后，重悬于200 µL PBS中。将悬液加至经聚-D-赖氨酸包被的圆形12 mm盖玻片上（第1节）。在室温下孵育10–15分钟。随后进行防止交联步骤（第4节）。
      注：也可在寄生虫贴附于盖玻片前，使用冷甲醇在-20 °C固定7分钟，或使用多聚甲醛/戊二醛在室温固定10分钟。

4. 进行交联抑制处理（第1天）

  1. 将贴附有寄生虫或感染细胞的12 mm盖玻片（细胞面朝上）浸入24孔板中，每孔加入0.5 mL CP溶液（步骤2.3）。
  2. 将未使用的孔中加入水以减少蒸发，用封板膜密封孔板，在37 °C孵育5小时。此步骤也可延长至在4 °C过夜孵育。
    ​注意：盖玻片必须始终完全浸没在溶液中；切勿使用移液器将固定液直接滴加在盖玻片上。

5. 样品的凝胶化操作

  1. 在培养皿中组装一个加湿室，上方覆盖封口膜，并在滤纸上加水（图2A）。将水加入滤纸后，于-20 °C预冷20分钟。同时将TEMED和APS分装液置于冰上解冻20分钟（步骤2.6）。
    注意：APS冻融次数不得超过三次。
  2. 将预冷的加湿室放置在冰上（图2A）。从培养箱中取出第4节中准备好的24孔板。用3 mL巴斯德吸管吸除CP溶液，保留少量液体，否则盖玻片将难以取出。
  3. 用镊子从固定液中取出12 mm盖玻片，并将其放置在滤纸上，使寄生虫面朝上。
    注意：可使用无菌针头辅助抬起盖玻片，再用镊子夹持，操作更为方便。
  4. 向90 µL单体溶液（步骤2.4）中加入5 µL已解冻的TEMED和5 µL已解冻的APS。使用涡旋混合器混合，时间不超过2-3秒；无需盖紧管盖。
    注意：务必先加入TEMED，最后加入APS。若先加APS后加TEMED，会导致凝胶过程过快，无法进行后续操作。
  5. 迅速在加湿室的封口膜上每张盖玻片对应位置滴加一滴35 µL溶液。立即用镊子夹取盖玻片，使其寄生虫面朝下覆盖于液滴上（图2B）。
    注意：每次最多处理两张盖玻片；此步骤必须迅速完成，因溶液聚合速度极快。
  6. 将加湿室先置于冰上孵育5分钟，随后在37 °C孵育1小时。同时开启加热金属块并预热至95 °C，以确保下一步操作的温度条件。

细胞在凝胶中的包封；A-B：冰上的培养皿；C：凝胶下细胞及盖玻片装置示意图
图2：凝胶化步骤细节。（A）湿室装置的组装。（B）将盖玻片滴加到含有TEMED和APS的单体溶液中以进行凝胶化。（C）用于成像的凝胶组装示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 变性凝胶化样品并进行各向同性扩增

  1. 从 4 °C 取出变性溶液（步骤 2.5）。如果出现沉淀，将其放入热水浴中加热至完全溶解。
  2. 向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 变性溶液。将步骤 5.3 中的盖玻片转移至含有变性溶液的孔板中，在室温下轻轻振荡孵育 15 分钟，使凝胶从盖玻片上脱落。
  3. 用金属刮刀小心地将凝胶（从 12 mm 盖玻片上取下）转移至含有 1 mL 变性溶液的 1.5 mL 无菌微量离心管中。使用管盖锁固定管子，在加热金属浴中 95 °C 孵育 1 小时 30 分钟。
    注意：在此步骤中，凝胶开始膨胀；将凝胶转移至 1.5 mL 微量离心管时应轻柔操作。
    警告：孵育后，含有凝胶的离心管温度高达 95 °C，可能造成危险。操作时请佩戴防护手套，并等待管子冷却，以防烫伤或液体喷溅。
  4. 进行第一轮扩增
    1. 使用 P1000 移液器吸除含有凝胶的 1.5 mL 微量离心管中的变性溶液。用小刮刀将凝胶从 1.5 mL 微量离心管转移至含有 10 mL 超纯水的培养皿中，孵育 30 分钟。
    2. 使用一次性 3 mL 巴斯德移液器更换超纯水，在室温下过夜孵育。
      注意：对凝胶操作时应轻柔，因为在孵育 30 分钟后，凝胶会变得脆弱。
    3. 再次使用一次性 3 mL 巴斯德移液器更换超纯水。
      注意：每次 30 分钟的三次水孵育已足够，但为操作方便，建议将第二次孵育设为过夜。

7. 对目标蛋白进行荧光标记（第2天）

  1. 使用一次性 3 mL 巴斯德吸管从含有凝胶的培养皿中移除水分。用卡尺测量凝胶的直径，以计算膨胀倍数（介于四到五倍之间）。
  2. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每次 15 分钟。用剃须刀片将圆形凝胶中心部分切割成约 10 mm × 10 mm 的正方形。每种待测条件使用一个凝胶块。
    注意：PBS 孵育后凝胶会收缩。凝胶可在 4 °C 的 PBS 中保存最多 1 周。
  3. 将每个凝胶块转移至 12 孔板中，加入 500 µL 用 2% PBS-牛血清白蛋白（BSA）稀释的一抗溶液，在 37 °C 振荡孵育 2 小时 30 分钟。
    注意：也可选择在 4 °C 过夜（ON）孵育一抗。在 24 孔板中，最小抗体用量为 300 µL。一般原则是使用常规免疫标记所需抗体浓度的两倍。
  4. 在 6 孔板中，用含 0.1% 吐温-20（polysorbate 20）的 2 mL PBS 振荡洗涤三次，每次 10 分钟。
  5. 将凝胶转移至 12 孔板中，加入 500 µL 用 PBS 配制的二抗溶液，其中包含 DAPI 和 10 µg/mL 与目标荧光染料偶联的 NHS 酯，在 37 °C 轻柔振荡孵育 2 小时 30 分钟。
    注意：一般原则是使用常规免疫标记所需抗体浓度的两倍。也可选择在 4 °C 过夜（ON）孵育。
  6. 在 6 孔板中，用含 0.1% 吐温-20（polysorbate 20）的 2 mL PBS 振荡洗涤三次，每次 10 分钟。
  7. 将凝胶转移至含有超纯水的培养皿中，孵育 30 分钟。使用一次性 3 mL 巴斯德吸管更换水两次，操作同步骤 6.4。

8. 成像与图像处理（第3天）

  1. 使用一次性 3 mL 巴斯德移液管从培养皿中移除水，并用卡尺测量凝胶直径，以计算膨胀因子。
  2. 用剃刀切下一小块约 10 mm × 10 mm 的凝胶，置于 35 mm 玻璃底培养皿上。
    注意：作为替代方法，可将凝胶置于载玻片和盖玻片之间（无需聚-D-赖氨酸）。载玻片两侧应粘附用金刚刀切割的小片载玻片，以形成一个厚度与凝胶相近的腔室。
  3. 在 10 倍或 20 倍放大倍数下检查凝胶方向。为正确对焦，需确保寄生虫朝向盖玻片；否则需将凝胶翻转并重新检查（图 2C）。
  4. 确定合适方向后，用显微镜纸吸干凝胶表面残留水分，再覆盖一层涂有聚-D-赖氨酸的盖玻片。
  5. 向凝胶上添加少量超纯水，以便使用共聚焦显微镜观察。
    注意：为确保成像质量，整个过程中必须保持凝胶方向不变，最终使含有细胞且靠近表面的一侧朝向玻璃底培养皿。当使用 35 mm 培养皿时，在底部盖玻片上添加聚-D-赖氨酸可减少图像采集过程中的凝胶位移。
  6. 图像采集参数
    1. 使用共聚焦显微镜（材料表）配合 63 倍油镜、数值孔径（NA）为 1.4 的物镜对样品进行成像。
    2. 采集 Z 轴层扫图像，Z 轴步长和每个像素的曝光时间需根据样品、信号强度及采集时间优化情况经验性确定。如需，可使用扫描缩放功能调节有效放大倍数。
    3. 使用图像处理软件（材料表）打开 Z 轴层扫图像。对每个通道，使用Group Z-project选项对图像进行合并，选择最大强度投影。
    4. 使用Merge Channels工具合并图像，并为各通道选择对应颜色。使用处理软件中的Scale Bar工具添加比例尺。
      注意：也可根据需要自定义各通道颜色（参见代表性结果中的示例）。

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结果

如果实验方案正确执行（图1），样品将呈现为平坦且半透明的凝胶，可在水中膨胀至原始尺寸的4-4.5倍（图3A）。这种膨胀可实现约70 nm的有效分辨率，具体数值可能因最终膨胀倍数和所用成像系统而异。在完成第二次膨胀过程并使用共聚焦显微镜进行图像采集后，我们观察到膨胀倍数约为4.5。为量化该膨胀效果，我们在步骤7.1前后对凝胶进行了测量。此外，我们使用α-微管蛋白抗体对未膨胀和已膨胀的前鞭毛体进行了标记（图3B）。

使用细胞骨架标记物（如抗微管蛋白抗体）染色时，我们在上鞭毛体、前鞭毛体和无鞭毛体中均观察到该蛋白正确地定位于表膜下微管束及鞭毛轴丝结构中，凸显了该技术在这三种形态中的应用价值 体外 生活史阶段 T. cruzi (图3C）。此外，使用DAPI染色时，细胞核内染色质的凝聚状态可以被清晰地区分（插图中的 <...

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讨论

超分辨率扩展显微技术是一种通过对生物样本进行物理性膨胀至原始尺寸数倍大小，从而获得高分辨率图像的技术。U-ExM 实验方案包含多个关键步骤，必须谨慎操作以获得最佳结果4。首先，样本需用 CP 试剂固定，并包埋于可膨胀的水凝胶基质中。CP 溶液中的甲醛会与丙烯酰胺的自由共价键发生反应，以防止其与样本形成非特异性结合。在本方案中，我们不建议在 CP 步骤前对细胞进行额外固定，因为这会降低膨胀倍数；但对于某些细胞器（如膜性细胞器）而言，预先固定仍是必要的15。值得一提的是，已有研究报道，为避免化学固定可能引起的某些人工假象，可在样本扩增前采用冷冻固定作为替代方法16。

接下来，通过施加一系列缓冲液使水凝胶膨胀并延展，从而实现样本的物理扩展。扩增后，使用荧光探针对样本进行染色，并利用共聚焦显微镜成像。需要注意的是，固定剂、水凝胶基质和缓冲液条件的选择会显著影响最终结果，因此必须仔细优化这些参数，以获得高质量的图像...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Dolores Campos在Vero细胞培养方面的协助，以及Romina Manarin在T. cruzi培养方面的协助。本工作得到阿根廷国家科学与技术促进局、阿根廷生产性科学与创新部（PICT2019-0526）、国家科学技术研究委员会（PIBAA 1242）以及英国研究理事会 [MR/P027989/1] 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 微米 PES 无菌注射器滤器膜溶液SFPES030022S
1 L 烧杯肖特杜伦10005227
1.5 mL SPINWIN 微型离心管塔尔森T38-500010
10 mL 一次性无菌注射器NP66-32
10 mL 无菌血清移液管Jet BiofilGSP211010
12毫米盖玻片Merienfeld GmbH01 115 20圆形盖玻片
12孔板Jet BiofilTCP011012
22毫米盖玻片Corning2845-22方形盖玻片
24孔板Jet BiofilTCP-011-024
250 mL 烧杯肖特杜伦C108.1
3 mL巴斯德吸管Deltalab200037
35 mm 玻璃底培养皿Matsunami 玻璃载片D11130H
4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐Sigma AldrichD9542DAPI
5 ml 无菌血清移液管Jet BiofilGSP010005
6孔板Sarstedt83.3920
丙烯酰胺伯乐（BioRad）1610101
过硫酸铵Sigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS 酯BOC SciencesF10-0107用于全蛋白质组标记
生物安全柜Telstar生物 II A/P
牛血清白蛋白Sigma AldrichA7906BSA
CO2 培养箱SanyoMCO-15A
共聚焦显微镜ZeissLSM 880
一次性培养皿塔尔逊斯46009590 mm 直径
DMEM，高糖赛默飞世尔科技12100046粉末
电子数显卡尺雷达游标卡尺
无水乙醇Supelco1,00,98,31,000
胎牛血清Internegocios SAFCS FRA 500无菌且热灭活
Fiji 图像处理软件包ImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
甲醛 37%Sigma AldrichF8775FA
玻璃培养皿马里恩费尔德优质PM-340030060 mm 直径
D(+)葡萄糖Cicarelli716214
70% 戊二醛Sigma AldrichG7776
山羊抗小鼠IgG二抗 Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
FITC标记的山羊抗兔IgG二抗杰克逊免疫研究实验室115-095-003
量筒Nalgene3663-1000
刻度玻璃烧瓶GlasscoGL-274.202.01100 mL
加热模块IBR自制
血红素Frontier ScientificH651-9
盐酸 36.8-38.0%Ciccarelli918110
冰桶康宁1167U68
培养箱Tecno DalvoTOC130
肝浸液Difco226920
磁力搅拌器和加热器实验助手HP-3000
金属刮勺SALTTECH200 mM
金属镊子马里恩费尔德优质PM-6633002
甲醇 absolutCicarelli897110
1.5 mL 微量离心管塔尔森500010-N
显微镜专用纸 KimWipesKimtech ScienceB0013HT2QW
Milli-Q 水系统默克密理博IQ-7003
小鼠抗α微管蛋白单克隆抗体 DM1ASigma AldrichT9026
小鼠抗PFR单克隆抗体纯化的抗体由 Dr. Ariel Silber（USP）捐赠
N,N´-methylenebisacrylamideICN193997BIS
Na2HPO4Cicarelli834214
血细胞计数板BoecoBOE 01
p1000 移液器GilsonPIPETMAN P1000
p1000 移液器吸头塔尔森TAR-521020B
p20 移液器GilsonPIPETMAN P20
p20 移液器吸头塔尔森TAR-527108
p200 移液器GilsonPIPETMAN P200
p200 移液器吸头塔尔森TAR-521010Y
多聚甲醛Sigma AldrichP6148PFA
pH / 氧化还原电位（ORP） / °C米尺HANNA InstrumentsHI 2211
聚-D-赖氨酸 0.1%Sigma AldrichP8920
氯化钾Cicarelli867212KCl
剃刀刀片PrintexBS 2982:1992
密封膜 "Parafilm M"贝米斯PM996
丙烯酸钠Sigma Aldrich408220-25GSA
碳酸氢钠Cicarelli929211NaHCO₃3
氯化钠Cicarelli750214NaCl
十二烷基硫酸钠BioRad1610302SDS
氢氧化钠Merk1-06498NaOH
Sorvall ST 16 离心机赛默飞世尔科技75004380
T-25 培养瓶康宁430639
TEMEDInvitrogen15524-010
卫生纸精英
雷公藤多苷默克1106760500
Tris伯乐（BioRad）1610719
Tween-20Biopack2003-07聚山梨酯20
真空泵SilfabN33-A
Vero 细胞ATCCCRL-1587
涡旋混合器龙实验室MX-S

参考文献

  1. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  2. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  4. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).
  5. Tillberg, P. W., Chen, F. Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).
  6. Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy. Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).
  7. Alonso, V. L. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes. Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).
  8. Kalichava, A., Ochsenreiter, T. Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei. Open Biology. 11 (10), 210132(2021).
  9. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).
  10. Liffner, B., Absalon, S. Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein. Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).
  11. Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii. Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).
  12. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).
  13. Carrea, A., Diambra, L. Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi. PloS One. 11 (1), e0146947(2016).
  14. Vidal, J. C., De Souza, W. Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease. , InTech. (2017).
  15. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  16. Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  17. Sahabandu, N., et al. Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia. Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).
  18. Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications. Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).
  19. Trinks, N., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy. Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).
  20. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  21. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).
  22. Shaib, A. H., et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv. , (2023).
  23. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).

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