本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。
方法文章
体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了超结构扩展显微技术（U-ExM）在Trypanosoma cruzi中的应用，该技术可通过物理方式扩大细胞或组织样本，从而提高显微成像的空间分辨率。该方法使用现成的化学试剂和常规实验设备即可完成。
恰加斯病是一种由T. cruzi引起的广泛存在且亟待解决的公共卫生问题。该疾病在拉丁美洲流行，并由于人口迁移增加，已成为非流行地区的重要问题。T. cruzi通过属于猎蝽科（Reduviidae）和半翅目（Hemiptera）的吸血昆虫媒介传播。感染后，T. cruzi无鞭毛体在哺乳动物宿主细胞内增殖，并分化为上鞭毛体，即不具复制能力的血液形态。在昆虫媒介体内，上鞭毛体转化为前鞭毛体，并通过二分裂方式进行增殖。生活史各阶段之间的转化需要细胞骨架发生广泛重组，这一过程可通过多种细胞培养技术在实验室中完全重现。
本文详细描述了在Trypanosoma cruzi的三个体外生命周期阶段中应用U-ExM的技术方案，重点优化了细胞骨架蛋白的免疫定位。我们还优化了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）的使用，这是一种全蛋白质组标记物，使我们能够标记不同的寄生虫结构。
引言
膨胀显微技术（ExM）由 Boyden 等人于 2015 年首次提出1。该技术是一种成像方案，可使常规显微镜实现突破衍射极限的空间分辨率。这种更高分辨率的获得源于样本的物理性放大。为实现这一点，将荧光标记的分子交联至水凝胶中，随后通过水使水凝胶发生各向同性的膨胀。由于这种膨胀，信号在三个维度上几乎实现各向同性的分离。该方法使用低成本化学试剂，借助常规（共聚焦）显微镜即可实现约 65 nm 的空间分辨率，相比标准共聚焦显微镜的分辨率（约 250 nm）提高了约四倍1。
推动扩展显微镜技术在多个生物学领域广泛应用的下一个里程碑，是将传统抗体用于免疫荧光标记的改进方法2。对最初发表的ExM方案的另一项改进是蛋白质组放大分析技术（magnified analysis of the proteome, MAP）3。该方法在样品与水凝胶浸润前引入高浓度丙烯酰胺和多聚甲醛，以防止蛋白质内部及之间的交联，从而更好地保留样品中的蛋白质含量和亚细胞结构。另一种替代方案则通过降低固定剂（甲醛/多聚甲醛和丙烯酰胺）的浓度，优化了分离细胞器整体超微结构的保存效果，该方法被称为超微结构扩展显微镜技术（ultrastructure expansion microscopy, U-ExM）
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方案
注意：图1 展示了完整的实验设计。
图 1：克氏锥虫（T. cruzi）体外生命周期三个阶段的U-ExM工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
1. 多聚-D-赖氨酸包被盖玻片的制备
- 将一片10 cm × 10 cm的封口膜放入培养皿中。将盖玻片置于35 mm玻璃培养皿内的无水乙醇中浸泡，以清洗盖玻片。
- 用镊子将盖玻片从乙醇中取出....
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结果
如果实验方案正确执行（图1），样品将呈现为平坦且半透明的凝胶，可在水中膨胀至原始尺寸的4-4.5倍（图3A）。这种膨胀可实现约70 nm的有效分辨率，具体数值可能因最终膨胀倍数和所用成像系统而异。在完成第二次膨胀过程并使用共聚焦显微镜进行图像采集后，我们观察到膨胀倍数约为4.5。为量化该膨胀效果，我们在步骤7.1前后对凝胶进行了测量。此外，我们使用α-微管蛋白抗体对未膨胀和已膨胀的前鞭毛体进行了标记（图3B）。
使用细胞骨架标记物（如抗微管蛋白抗体）染色时，我们在上鞭毛体、前鞭毛体和无鞭毛体中均观察到该蛋白正确地定位于表膜下微管束及鞭毛轴丝结构中，凸显了该技术在这三种形态中的应用价值 体外 生活史阶段 T. cruzi (图3C）。此外，使用DAPI染色时，细胞核内染色质的凝聚状态可以被清晰地区分（插图中的 <.......
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讨论
超分辨率扩展显微技术是一种通过对生物样本进行物理性膨胀至原始尺寸数倍大小，从而获得高分辨率图像的技术。U-ExM 实验方案包含多个关键步骤，必须谨慎操作以获得最佳结果4。首先，样本需用 CP 试剂固定，并包埋于可膨胀的水凝胶基质中。CP 溶液中的甲醛会与丙烯酰胺的自由共价键发生反应，以防止其与样本形成非特异性结合。在本方案中，我们不建议在 CP 步骤前对细胞进行额外固定，因为这会降低膨胀倍数；但对于某些细胞器（如膜性细胞器）而言，预先固定仍是必要的15。值得一提的是，已有研究报道，为避免化学固定可能引起的某些人工假象，可在样本扩增前采用冷冻固定作为替代方法16。
接下来，通过施加一系列缓冲液使水凝胶膨胀并延展，从而实现样本的物理扩展。扩增后，使用荧光探针对样本进行染色，并利用共聚焦显微镜成像。需要注意的是，固定剂、水凝胶基质和缓冲液条件的选择会显著影响最终结果，因此必须仔细优化这些参数，以获得高质量的图像.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Dolores Campos在Vero细胞培养方面的协助，以及Romina Manarin在T. cruzi培养方面的协助。本工作得到阿根廷国家科学与技术促进局、阿根廷生产性科学与创新部（PICT2019-0526）、国家科学技术研究委员会（PIBAA 1242）以及英国研究理事会 [MR/P027989/1] 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 微米 PES 无菌注射器滤器 | 膜溶液 | SFPES030022S | |
| 1 L 烧杯 | 肖特杜伦 | 10005227 | |
| 1.5 mL SPINWIN 微型离心管 | 塔尔森 | T38-500010 | |
| 10 mL 一次性无菌注射器 | NP | 66-32 | |
| 10 mL 无菌血清移液管 | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 12毫米盖玻片 | Merienfeld GmbH | 01 115 20 | 圆形盖玻片 |
| 12孔板 | Jet Biofil | TCP011012 | |
| 22毫米盖玻片 | Corning | 2845-22 | 方形盖玻片 |
| 24孔板 | Jet Biofil | TCP-011-024 | |
| 250 mL 烧杯 | 肖特杜伦 | C108.1 | |
| 3 mL巴斯德吸管 | Deltalab | 200037 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | Matsunami 玻璃载片 | D11130H | |
| 4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐 | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| 5 ml 无菌血清移液管 | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 6孔板 | Sarstedt | 83.3920 | |
| 丙烯酰胺 | 伯乐（BioRad） | 1610101 | |
| 过硫酸铵 | Sigma Aldrich | A3678-25G | APS |
| ATTO 647 NHS 酯 | BOC Sciences | F10-0107 | 用于全蛋白质组标记 |
| 生物安全柜 | Telstar | 生物 II A/P | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906 | BSA |
| CO2 培养箱 | Sanyo | MCO-15A | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 880 | |
| 一次性培养皿 | 塔尔逊斯 | 460095 | 90 mm 直径 |
| DMEM，高糖 | 赛默飞世尔科技 | 12100046 | 粉末 |
| 电子数显卡尺 | 雷达 | 游标卡尺 | |
| 无水乙醇 | Supelco | 1,00,98,31,000 | |
| 胎牛血清 | Internegocios SA | FCS FRA 500 | 无菌且热灭活 |
| Fiji 图像处理软件包 | ImageJ | doi:10.1038/nmeth.2019 | |
| 甲醛 37% | Sigma Aldrich | F8775 | FA |
| 玻璃培养皿 | 马里恩费尔德优质 | PM-3400300 | 60 mm 直径 |
| D(+)葡萄糖 | Cicarelli | 716214 | |
| 70% 戊二醛 | Sigma Aldrich | G7776 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG二抗 | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-095-003 | |
| 量筒 | Nalgene | 3663-1000 | |
| 刻度玻璃烧瓶 | Glassco | GL-274.202.01 | 100 mL |
| 加热模块 | IBR | 自制 | |
| 血红素 | Frontier Scientific | H651-9 | |
| 盐酸 36.8-38.0% | Ciccarelli | 918110 | |
| 冰桶 | 康宁 | 1167U68 | |
| 培养箱 | Tecno Dalvo | TOC130 | |
| 肝浸液 | Difco | 226920 | |
| 磁力搅拌器和加热器 | 实验助手 | HP-3000 | |
| 金属刮勺 | SALTTECH | 200 mM | |
| 金属镊子 | 马里恩费尔德优质 | PM-6633002 | |
| 甲醇 absolut | Cicarelli | 897110 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | 塔尔森 | 500010-N | |
| 显微镜专用纸 KimWipes | Kimtech Science | B0013HT2QW | |
| Milli-Q 水系统 | 默克密理博 | IQ-7003 | |
| 小鼠抗α微管蛋白单克隆抗体 DM1A | Sigma Aldrich | T9026 | |
| 小鼠抗PFR单克隆抗体 | 纯化的抗体 | 由 Dr. Ariel Silber（USP）捐赠 | |
| N,N´-methylenebisacrylamide | ICN | 193997 | BIS |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| 血细胞计数板 | Boeco | BOE 01 | |
| p1000 移液器 | Gilson | PIPETMAN P1000 | |
| p1000 移液器吸头 | 塔尔森 | TAR-521020B | |
| p20 移液器 | Gilson | PIPETMAN P20 | |
| p20 移液器吸头 | 塔尔森 | TAR-527108 | |
| p200 移液器 | Gilson | PIPETMAN P200 | |
| p200 移液器吸头 | 塔尔森 | TAR-521010Y | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| pH / 氧化还原电位（ORP） / °C米尺 | HANNA Instruments | HI 2211 | |
| 聚-D-赖氨酸 0.1% | Sigma Aldrich | P8920 | |
| 氯化钾 | Cicarelli | 867212 | KCl |
| 剃刀刀片 | Printex | BS 2982:1992 | |
| 密封膜 "Parafilm M" | 贝米斯 | PM996 | |
| 丙烯酸钠 | Sigma Aldrich | 408220-25G | SA |
| 碳酸氢钠 | Cicarelli | 929211 | NaHCO₃3 |
| 氯化钠 | Cicarelli | 750214 | NaCl |
| 十二烷基硫酸钠 | BioRad | 1610302 | SDS |
| 氢氧化钠 | Merk | 1-06498 | NaOH |
| Sorvall ST 16 离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75004380 | |
| T-25 培养瓶 | 康宁 | 430639 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| 卫生纸 | 精英 | ||
| 雷公藤多苷 | 默克 | 1106760500 | |
| Tris | 伯乐（BioRad） | 1610719 | |
| Tween-20 | Biopack | 2003-07 | 聚山梨酯20 |
| 真空泵 | Silfab | N33-A | |
| Vero 细胞 | ATCC | CRL-1587 | |
| 涡旋混合器 | 龙实验室 | MX-S |
参考文献
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al.
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