本方案概述了以下方法的使用 根癌农杆菌介导的转化（AMT），用于将目的基因整合到绿色微藻的核基因组中 普通小球藻，从而产生稳定的转化子。
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本文内容
摘要
摘要
根癌农杆菌介导的转化（AMT）是操控植物基因组的一种常用工具。然而 A. tumefaciens 表现出向多种物种进行基因转移的能力。许多微藻物种缺乏将目的基因稳定整合到其核基因组的成熟方法。为了充分利用微藻生物技术的潜在优势，简单高效的基因组操作工具至关重要。本文提出了一种针对工业微藻物种优化的AMT操作流程 Chlorella vulgaris，利用报告基因绿色荧光蛋白（mGFP5）和潮霉素B抗性标记。通过在含有潮霉素B和头孢噻肟的Tris-乙酸-磷酸盐（TAP）培养基上平板培养筛选突变体。mGFP5的表达量进行定量分析 通过 经过十代以上的继代培养后仍保持荧光，表明T-DNA盒已稳定转化。该方案可可靠地获得多个转基因植株 C. vulgaris 两周内形成菌落，使用市售的pCAMBIA1302植物表达载体。
引言
Agrobacterium tumefaciens 是一种革兰氏阴性土壤细菌，具有独特的跨界基因转移能力，因此被誉为"天然的遗传工程师"1。该细菌可通过IV型分泌系统，将肿瘤诱导型质粒（Ti质粒）中的DNA（T-DNA）转移至宿主细胞，导致T-DNA整合到宿主基因组中并实现表达1,2,3,4。在自然条件下，该过程会导致植物产生肿瘤，即通常所说的冠瘿病。然而，在实验室条件下，Agrobacterium 还可将T-DNA转移至多种其他生物体中，包括酵母、真菌、藻类、海胆胚胎，甚至人类细胞5,6,7,8。
利用这一天然系统， Agrobacterium tumefaciens介导的转化（AMT）通过修饰Ti质粒上的T-DNA区域，实现目的基因在宿主细胞核基因组....
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方案
除非另有说明，所有培养基和溶液在使用前必须进行高压灭菌。所有离心管、移液器吸头等物品在使用前应为无菌或经过高压灭菌。为便于参考，本方案中使用的培养基配方列于表1中。
1. 准备 A. tumefaciens 电转感受态细胞
- 接种 农杆菌 （AGL-1）转入含有利福平（20 mg/L）的25 mL无菌LB液体培养基摇瓶中-1从冻存的甘油菌种中接种，并在28-30 °C、150 rpm条件下过夜培养。
注意： 农杆菌 菌株 AGL-1 是（参见 材料表对利福平、氨苄青霉素、氯霉素和链霉素具有抗性，可从多家供应商处获得。 - 次日，将过夜培养物0.5 µL加入50 mL经高压灭菌的超纯水中，稀释100,000倍，取10 µL稀释后的培养物涂布于LB平板，于28–30 °C培养1–3天。
- 挑取单菌落，于含利福平的LB培养基中，在28–30 °C条件下培养20 mL过夜培养物。
- 第二天，将9 mL过夜培养物接种至装有500 mL LB培养基（不含抗生素）的摇瓶中，在28–30 °C下振荡培养，直至OD600 达到 0.5。
- 将培养物均匀分装至十个50 mL离心管....
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结果
为了展示使用上述方法实现成功的转化，C. vulgaris 分别与含有 pCAMBIA1302 质粒的 AGL-1 共培养，或不含有质粒的 AGL-1（野生型），并接种于添加了潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1A）。最左侧的平板显示能够在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长的转化菌落，中间的平板显示野生型 AGL-1 无法在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长。最右侧的平板显示在未使用选择压力（仅含头孢噻肟）的情况下，C. vulgaris 转化子和野生型均能生长。将单菌落划线接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1B）。从最右侧平板中挑取逃逸菌落（图1B）接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 液体培养基中（图1C）。由于 T-DNA 随机整合后表达水平存在差异，最初在潮霉素B浓度梯度为 25–70 mg/L 的平板上筛选转化子。从每个平板中选取一个菌落，.......
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讨论
转化效率与多个不同参数相关。A. tumefaciens 菌株的选择对农杆菌介导的转化（AMT）至关重要。AGL-1 是已发现的侵染能力最强的菌株之一，因此在植物 AMT 中被常规使用。在诱导培养基中添加葡萄糖（15–20 mM）对提高 AMT 效率也非常重要。考虑到C. vulgaris可在光能自养和异养条件下生长，微藻培养基中通常省略葡萄糖或其他碳源以防止污染。例如，Bold's Basal Medium（BBM）是C. vulgaris光能自养培养最常用的培养基19。然而，由于缺乏A. tumefaciens偏好的有机碳源和铵态氮源（BBM 使用硝态氮），BBM 无法支持该菌的生长20。因此，本研究采用 TAP 培养基，因其含有乙酸作为C. vulgaris的碳源、葡萄糖作为A. tumefaciens的碳源，以及两种物种均可利用的铵态氮源。TAP 琼脂平板还能显著加快C. vulgaris的生长速度，从而缩短 .......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢荷兰莱顿大学莱顿生物研究所的 Paul Hooykaas 教授慷慨提供了 pCAMBIA1302 载体和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1 菌株。作者还感谢 Eva Colic 在培养荧光转化子过程中提供的帮助。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会以及 Mitacs Accelerate 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 Kb Plus DNA 标准品 | FroggaBio | DM015 | |
| 乙酰丁香酮 | 菲舍尔科技 | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | 菌株：AGL-1；Paul Hooykaas 教授惠赠 | 基因型：C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| 生物素 | Enzo 生命科学 | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| 头孢噻肟 | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | 德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养中心 | 菌株：UTEX 395 | 野生型菌株 |
| CoCl2·6H2O | 西格玛奥德里奇 | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell 电穿孔仪 | Bio-Rad | 1652662 | 配备 PC 模块的主机单元。 |
| GeneJET 植物基因组纯化试剂盒 | Thermo Scientific | K0791 | |
| 冰乙酸 | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| 甘油 | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES 缓冲液 | 西格玛奥德里奇 | H-3375 | |
| 潮霉素 B | 菲舍尔科技 | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| 卡那霉素 | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | 默克生命科学 | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni 树脂 | New England BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | 莱顿大学 | Paul Hooykaas 教授惠赠 | pBR322，KanR，pVS1，T-DNA（CaMV 35S/HygR/CaMV polyA，CaMV 35S 启动子/mgpf5-6xhis/NOS 终止子） |
| 聚丙烯柱（5 mL） | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein 未染色蛋白标准品，Strep 标签重组蛋白，1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| 利福平 | 默克生命科学 | R3501-1G | |
| SunBlaster LED 条形灯 48 英寸 | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 微孔板紫外/可见光分光光度计 | BioTEK | S4MLFPTA | |
| 四环素 | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| 硫胺素 | TCI America | T0181-100G | |
| Tris 碱 | 菲舍尔科技 | BP152-500 | |
| 胰蛋白胨 | BioBasic | TG217(G211) | |
| 维生素 B12（氰钴胺） | Enzo 生命科学 | 89151-436 | |
| 酵母提取物 | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
参考文献
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
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重印与许可
