方法文章

Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

5.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65382

⸱

2023年10月27日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

本文内容

摘要

本方案概述了以下方法的使用 根癌农杆菌介导的转化（AMT），用于将目的基因整合到绿色微藻的核基因组中 普通小球藻，从而产生稳定的转化子。

摘要

根癌农杆菌介导的转化（AMT）是操控植物基因组的一种常用工具。然而 A. tumefaciens 表现出向多种物种进行基因转移的能力。许多微藻物种缺乏将目的基因稳定整合到其核基因组的成熟方法。为了充分利用微藻生物技术的潜在优势，简单高效的基因组操作工具至关重要。本文提出了一种针对工业微藻物种优化的AMT操作流程 Chlorella vulgaris，利用报告基因绿色荧光蛋白（mGFP5）和潮霉素B抗性标记。通过在含有潮霉素B和头孢噻肟的Tris-乙酸-磷酸盐（TAP）培养基上平板培养筛选突变体。mGFP5的表达量进行定量分析 通过 经过十代以上的继代培养后仍保持荧光，表明T-DNA盒已稳定转化。该方案可可靠地获得多个转基因植株 C. vulgaris 两周内形成菌落，使用市售的pCAMBIA1302植物表达载体。

引言

Agrobacterium tumefaciens 是一种革兰氏阴性土壤细菌，具有独特的跨界基因转移能力，因此被誉为"天然的遗传工程师"1。该细菌可通过IV型分泌系统，将肿瘤诱导型质粒（Ti质粒）中的DNA（T-DNA）转移至宿主细胞，导致T-DNA整合到宿主基因组中并实现表达1,2,3,4。在自然条件下，该过程会导致植物产生肿瘤，即通常所说的冠瘿病。然而，在实验室条件下，Agrobacterium 还可将T-DNA转移至多种其他生物体中，包括酵母、真菌、藻类、海胆胚胎，甚至人类细胞5,6,7,8。

利用这一天然系统， Agrobacterium tumefaciens介导的转化（AMT）通过修饰Ti质粒上的T-DNA区域，实现目的基因在宿主细胞核基因组中的随机整合。为此，常用的AMT植物表达载体是pCAMBIA1302。9研究人员可以采用简单的克隆工作流程 E. coli 在将目标载体转入之前 A. tumefaciens 用于后续转移到目标宿主。

绿色微藻是真核生物，与陆地植物有许多相似之处，但其遗传改造极为困难。然而，遗传转化在微藻的基础研究和生物技术研究中均发挥着关键作用。在多种微藻物种中，尤其是 莱茵衣藻，遗传转化 通过 AMT 已成功导入了多种转基因，包括人白细胞介素-2（hIL-2）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2的受体结合域（SARS-CoV-2 RBD）以及两种抗菌肽（AMPs）10,11,12,13其中 普通小球藻一种对培养条件要求较低且生长迅速的绿藻物种，在碳水化合物、蛋白质、营养补充剂、色素及其他高价值化合物的可持续生产方面具有重要意义14然而，目前缺乏用于创制转基因品系的可靠工具 C. vulgaris 阻碍其商业化进程。由于利用AMT的已发表研究工作十分有限， C. vulgaris15，鉴于植物与微藻培养之间存在显著差异，优化AMT方案变得至关重要。

在本研究中，研究人员将绿色荧光蛋白（mGFP5）插入花椰菜花叶病毒（CamV）35S启动子的下游，并添加了组氨酸标签，用作蛋白表达的报告基因。通过潮霉素B筛选转化子，继代培养二十代以上后，转化仍保持稳定。本研究所使用的pCAMBIA1302质粒可轻松改造以容纳任何目的基因。此外，该方法和材料可根据其他具有活性CamV35S启动子的绿藻物种进行调整，因为该启动子可用于潮霉素筛选。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

除非另有说明，所有培养基和溶液在使用前必须进行高压灭菌。所有离心管、移液器吸头等物品在使用前应为无菌或经过高压灭菌。为便于参考，本方案中使用的培养基配方列于表1中。

1. 准备 A. tumefaciens 电转感受态细胞

  1. 接种 农杆菌 （AGL-1）转入含有利福平（20 mg/L）的25 mL无菌LB液体培养基摇瓶中-1从冻存的甘油菌种中接种，并在28-30 °C、150 rpm条件下过夜培养。
    ​注意： 农杆菌 菌株 AGL-1 是（参见 材料表对利福平、氨苄青霉素、氯霉素和链霉素具有抗性，可从多家供应商处获得。
  2. 次日，将过夜培养物0.5 µL加入50 mL经高压灭菌的超纯水中，稀释100,000倍，取10 µL稀释后的培养物涂布于LB平板，于28–30 °C培养1–3天。
  3. 挑取单菌落，于含利福平的LB培养基中，在28–30 °C条件下培养20 mL过夜培养物。
  4. 第二天，将9 mL过夜培养物接种至装有500 mL LB培养基（不含抗生素）的摇瓶中，在28–30 °C下振荡培养，直至OD600 达到 0.5。
  5. 将培养物均匀分装至十个50 mL离心管中，冰上预冷30分钟。将离心机预冷至4 °C。
  6. 在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心试管 g 15分钟。随后，用移液器尽可能吸除上清液，并将每管中的沉淀重悬于50 mL预冷的冰水中。
  7. 在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心细胞 g 孵育15分钟。移除上清液，将沉淀物重悬于每管25 mL冰预冷的水中。
  8. 在 4 °C 条件下以 4000 x g 离心细胞 g 孵育15分钟。弃去上清液，每管中用1 mL预冷的10%（w/v）甘油重悬沉淀。
  9. 将所有离心管中的样品合并至一个50 mL离心管中，在4 °C、4000 x g条件下离心细胞 g 15分钟。弃上清，将沉淀重悬于400 µL预冷的10% (w/v)甘油溶液中。细胞浓度应约为1-3 x 1010 cells/mL
  10. 将细胞分装至无菌预冷的微量离心管中，每管50 µL。用液氮速冻后，于-80 °C冰箱中保存。

2. 电穿孔 A. tumefaciens

  1. 将50 µL AGL-1 A. tumefaciens 感受态细胞加入预冷的0.1 mm电转杯中，再加入2 µL pCAMBIA1302或类似质粒（浓度15 ng/µL）（参见材料表）。
  2. 使用电穿孔仪在2400 V条件下进行电穿孔（200 Ω，电容延长器250 µFD，电容25 µFD，指数衰减，参见材料表）。采用指数衰减模式时，时间常数应>4.5 ms，以确保电穿孔成功。
  3. 立即向电转杯中加入1 mL LB培养基，轻轻吹打混匀。将重悬的1 mL细胞转移至1.5 mL离心管中，在28–30 °C条件下孵育至少1小时以恢复生长。
  4. 将细胞涂布于含有适当抗生素的LB琼脂平板上（例如，pCAMBIA1302使用50 mg/L卡那霉素进行原核筛选）。
  5. 在28–30 °C条件下孵育2–3天。
  6. 挑取单菌落，在含相应筛选抗生素的LB培养基（pCAMBIA1302使用50 mg/L卡那霉素）中过夜培养，并用50%甘油于-80 °C冷冻保存含质粒的菌株，以备后续使用。

3. AMT 的 C. vulgaris

注意：请平行准备C. vulgaris（UTEX 395，参见材料表）和A. tumefaciens的培养物以进行共培养。C. vulgaris的培养物应比A. tumefaciens的培养物提前3天开始。本实验方案根据Kumar等人发表的方法进行了修改7。

  1. 准备 C. vulgaris 培养物
    1. C. vulgaris通常保存在斜面培养基上，或在光照条件下维持对数生长期的液体培养。从OD600 = 1.0的对数生长期培养液中取0.5 mL，涂布于Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP，见表1）琼脂平板（含1.2% w/v 琼脂A）上，在25 °C、光照（50 µE/m2s）条件下培养5天，可获得约5 × 106个细胞。
  2. 准备 A. tumefaciens 培养物
    1. 将甘油保存的A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302菌株接种于含15 mM葡萄糖、20 mg/L 利福平和50 mg/L卡那霉素（见材料表）的10 mL LB培养基中，在摇瓶中于28–30 °C、250 rpm条件下过夜培养。
    2. 取1 mL过夜培养物接种至50 mL含15 mM葡萄糖、20 mg/L 利福平和50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，在28–30 °C、250 rpm条件下培养至OD600达到1.0。
  3. 共培养C. vulgaris与A. tumefaciens
    1. 为共培养准备A. tumefaciens培养物：将培养好的菌液转移至50 mL离心管中，在室温下以4000 × g离心30分钟。用移液器吸除上清液，并用诱导培养基洗涤细胞两次。
      注：所用诱导培养基为pH调至5.5的TAP培养基，添加F/2培养基的微量元素和维生素，并含200 µM乙酰丁香酮（AS，见材料表）。将细胞重悬于诱导培养基中，使OD600 = 0.5。
    2. 为共培养准备C. vulgaris培养物：向含有约5 × 106个细胞的C. vulgaris平板中加入25 mL诱导培养基，转移至50 mL离心管中。在室温下以4000 × g离心15分钟，弃去上清液。
    3. 将藻类细胞沉淀与200 µL细菌悬液（OD600：0.5）混合，在21–25 °C、150 rpm条件下于旋转摇床上共孵育1小时。
    4. 将混合培养物（200 µL）涂布于添加了15 mM葡萄糖的诱导培养基平板上，在21–25 °C避光条件下培养3天。
    5. 3天后，使用含400 mg/L头孢噻肟或20 mg/L四环素（见材料表）的10 mL TAP培养基收集微藻，并在21–25 °C避光条件下继续培养2天，以清除培养物中的A. tumefaciens。
    6. 取500 µL培养液涂布于选择性培养基平板上，例如含20–70 mg/L潮霉素B（使用pCAMBIA1302时）以及400 mg/L-1头孢噻肟或20 mg/L四环素的TAP培养基。先在21–25 °C避光培养2天，再转移至光照培养箱中。
      注：抗性菌落将在光照后5–7天出现。
    7. 从转化平板上挑取单菌落，在含400 mg/L头孢噻肟或20 mg/L四环素及20–70 mg/L潮霉素B的TAP琼脂平板上重新划线培养。

4. 通过菌落PCR（cPCR）验证C. vulgaris转化子中的基因整合

  1. 使用植物基因组DNA提取试剂盒（参见材料表），从经过至少两次单克隆继代培养的C. vulgaris转化子中提取基因组DNA。以此DNA为模板进行PCR，设计针对T-DNA中mgfp5区域的引物（mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3'，M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'）。
    1. 使用Q5高保真DNA聚合酶预混试剂盒（参见材料表），进行聚合酶链式反应（PCR），以验证外源基因的整合。
      注：本研究采用以下反应条件：98 °C 预变性3 min；35个循环（98 °C 变性10 s，57 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；72 °C 最终延伸5 min。以pCAMBIA1302质粒为阳性对照，野生型C. vulgaris基因组DNA为阴性对照。
  2. 为确认样品中无因A. tumefaciens残留污染而存在的pCAMBIA1302质粒，进行菌落PCR。取少量转化子细胞加入10 µL无菌水中，98 °C 煮沸15 min，以此作为PCR模板。
    1. 设计针对pCAMBIA1302质粒T-DNA区域外一段序列的引物（B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3'，B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'）。
      注：本研究采用以下反应条件：94 °C 预变性3 min；30个循环（94 °C 变性30 s，48 °C 退火30 s，68 °C 延伸5 min）；68 °C 最终延伸7 min。以煮沸处理的A. tumefaciens AGL-1（pCAMBIA1302）菌落为阳性对照，煮沸处理的野生型C. vulgaris菌落为阴性对照。
  3. 为确认样品中无A. tumefaciens污染，进行菌落PCR。取少量转化子细胞加入10 µL无菌水中，98 °C 煮沸15 min，以此作为PCR模板。
    1. 设计针对AGL-1毒力质粒上virE2基因的引物（virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3'，virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'）。
      注：本研究采用以下反应条件：94 °C 预变性3 min；30个循环（94 °C 变性30 s，53 °C 退火30 s，68 °C 延伸3 min）；68 °C 最终延伸7 min。以煮沸处理的A. tumefaciens AGL-1（pCAMBIA1302）菌落为阳性对照，煮沸处理的野生型C. vulgaris菌落为阴性对照。
  4. 将PCR产物与DNA分子量标记物（1 Kbp DNA ladder，参见材料表）一同进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段的大小16。

5. 测定转化子的荧光

  1. 将每个转化子从对数期维持培养物或TAP琼脂斜面接种至50 mL TAP培养基中，培养基中添加200 mg/L-1头孢噻肟和25 mg/L-1潮霉素B，使起始OD600 = 0.1。另设一培养组，接种野生型C. vulgaris，仅添加200 mg/L-1头孢噻肟作为阴性对照。于25 °C、150 rpm条件下培养，并提供150 µmol/m2s的光合有效辐射光照（见材料表）。
  2. 每隔24小时，取300 µL样品，使用96孔板读数仪或紫外/可见分光光度计与荧光计（见材料表）测定吸光度和荧光（激发波长488 nm，发射波长526 nm）。采用黑色板配透明底板以实现同步测量。

6. 粗蛋白提取、蛋白纯化及SDS-PAGE电泳

  1. 将转化子（#50）从对数生长期的维持培养物接种至300 mL TAP培养基中，该培养基添加200 mg/L-1 头孢噻肟和25 mg/L-1 潮霉素B，使初始OD680 = 0.1。另设一培养物，接种野生型C. vulgaris，仅添加200 mg/L-1 头孢噻肟作为阴性对照。于25 °C、150 rpm转速下培养，光照强度为150 µmol/m2s的光合有效辐射光。
  2. 使用5 mL裂解缓冲液（见表1）提取转化子（#50）和野生型菌株的粗蛋白样品，随后进行4分钟超声处理。
  3. 通过5 mL聚丙烯柱（见材料表）利用Ni-NTA树脂纯化粗蛋白样品。
  4. 将15 mL纯化后的蛋白样品冻干，并重悬于1 mL裂解缓冲液中，用于SDS-PAGE分析17。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了展示使用上述方法实现成功的转化，C. vulgaris 分别与含有 pCAMBIA1302 质粒的 AGL-1 共培养，或不含有质粒的 AGL-1（野生型），并接种于添加了潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1A）。最左侧的平板显示能够在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长的转化菌落，中间的平板显示野生型 AGL-1 无法在潮霉素B/头孢噻肟平板上生长。最右侧的平板显示在未使用选择压力（仅含头孢噻肟）的情况下，C. vulgaris 转化子和野生型均能生长。将单菌落划线接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 琼脂平板上（图1B）。从最右侧平板中挑取逃逸菌落（图1B）接种至含潮霉素B和头孢噻肟的 TAP 液体培养基中（图1C）。由于 T-DNA 随机整合后表达水平存在差异，最初在潮霉素B浓度梯度为 25–70 mg/L 的平板上筛选转化子。从每个平板中选取一个菌落，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

转化效率与多个不同参数相关。A. tumefaciens 菌株的选择对农杆菌介导的转化（AMT）至关重要。AGL-1 是已发现的侵染能力最强的菌株之一，因此在植物 AMT 中被常规使用。在诱导培养基中添加葡萄糖（15–20 mM）对提高 AMT 效率也非常重要。考虑到C. vulgaris可在光能自养和异养条件下生长，微藻培养基中通常省略葡萄糖或其他碳源以防止污染。例如，Bold's Basal Medium（BBM）是C. vulgaris光能自养培养最常用的培养基19。然而，由于缺乏A. tumefaciens偏好的有机碳源和铵态氮源（BBM 使用硝态氮），BBM 无法支持该菌的生长20。因此，本研究采用 TAP 培养基，因其含有乙酸作为C. vulgaris的碳源、葡萄糖作为A. tumefaciens的碳源，以及两种物种均可利用的铵态氮源。TAP 琼脂平板还能显著加快C. vulgaris的生长速度，从而缩短 ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢荷兰莱顿大学莱顿生物研究所的 Paul Hooykaas 教授慷慨提供了 pCAMBIA1302 载体和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1 菌株。作者还感谢 Eva Colic 在培养荧光转化子过程中提供的帮助。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会以及 Mitacs Accelerate 项目资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 Kb Plus DNA 标准品FroggaBioDM015
乙酰丁香酮菲舍尔科技D26665G
Agrobacterium tumefaciensGold Biotechnologies菌株：AGL-1；Paul Hooykaas 教授惠赠基因型：C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
生物素Enzo 生命科学89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
头孢噻肟AK ScientificJ90010
Chlorella vulgaris德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养中心菌株：UTEX 395野生型菌株
CoCl2·6H2O西格玛奥德里奇C8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell 电穿孔仪Bio-Rad1652662配备 PC 模块的主机单元。
GeneJET 植物基因组纯化试剂盒Thermo ScientificK0791
冰乙酸VWRCABDH3093-2.2P
甘油BioBasicGB0232
HEPES 缓冲液西格玛奥德里奇H-3375
潮霉素 B菲舍尔科技AAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
卡那霉素Gold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2O默克生命科学CA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni 树脂New England BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302莱顿大学Paul Hooykaas 教授惠赠pBR322，KanR，pVS1，T-DNA（CaMV 35S/HygR/CaMV polyA，CaMV 35S 启动子/mgpf5-6xhis/NOS 终止子）
聚丙烯柱（5 mL）QIAGEN34964
Precision Plus Protein 未染色蛋白标准品，Strep 标签重组蛋白，1 mLBio-Rad1610363
利福平默克生命科学R3501-1G
SunBlaster LED 条形灯 48 英寸 SunBlaster210000000906
Synergy 4 微孔板紫外/可见光分光光度计 BioTEKS4MLFPTA
四环素Thermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%Bio-Rad1610185
硫胺素TCI AmericaT0181-100G
Tris 碱菲舍尔科技BP152-500
胰蛋白胨BioBasicTG217(G211)
维生素 B12（氰钴胺）Enzo 生命科学89151-436
酵母提取物BioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

参考文献

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, e0257089(2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  17. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262(2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

AMT B

相关文章