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在受控条件下饲养菜粉蝶（Pieris rapae）：重金属耐受性案例研究

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DOI：

10.3791/65383

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2023年8月18日

 , 
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

本文内容

摘要

本文介绍了一种在人工饲料和受控实验室条件下饲养菜粉蝶的详细方案，该方案可精确调控幼体阶段的营养状况和毒素暴露。代表性实验结果展示了如何利用该方案检测重金属毒性。

摘要

菜粉蝶（Pieris rapae）是应用害虫防治研究以及行为生态学和营养生态学基础研究的重要模式系统。在人工饲料上，菜粉蝶可在受控条件下轻松饲养，使其成为蝴蝶研究中的模式生物。本文通过重金属暴露处理，示范了该物种饲养的基本方法。总体实验流程展示了如何在野外捕捉蝴蝶、诱导其在温室笼内产卵，并将幼虫转移至人工饲料上进行培养。本方法还说明了如何对蝴蝶进行标记、测量，并针对多种科研问题开展研究。代表性结果展示了成分不同的人工饲料如何用于评估蝴蝶在不同处理下的表现，相对于对照饲料的差异。更具体而言，蝴蝶对镍的耐受性最强，对铜的耐受性最弱，而对锌的耐受性介于两者之间。本文讨论了这些结果的可能解释，包括某些十字花科寄主植物对镍的超积累特性，以及近期昆虫研究中发现铜的毒性可能高于以往认知的证据。最后，讨论部分首先回顾了本实验方案的可调整之处及常见问题的解决方向，继而探讨未来研究如何进一步优化本研究所使用的人工饲料。总体而言，本方案通过提供菜粉蝶在人工饲料上饲养与测量的详细视频演示，为在广泛研究领域中应用该系统提供了重要资源。

引言

小菜蛾（Pieris rapae，下文简称"菜粉蝶"）是芸薹属作物（如卷心菜、西兰花和油菜）的一种世界性害虫1,2,3。同时，菜粉蝶也是生物学研究中的重要模式系统，因其可在受控的实验室条件下易于饲养和操作，被广泛用作蝴蝶研究的模型生物4,5。关于菜粉蝶的研究已在寄主搜寻6,7,8、花蜜资源利用9,10,11、交配选择与性选择12,13,14、翅型发育与进化15,16,17，以及对新环境和变化环境的响应18,19等方面提供了关键性见解。这些研究中的许多发现依赖于菜粉蝶可在人工饲料上成功饲养这一事实4,20,21，而人工饲料可被精确调控以模拟营养不良条件22,23、生态相关的污染物水平24,25,26,27，或向新寄主植物的转变28,29。本研究通过一项重金属暴露实验，展示在实验室中使用人工饲料饲养菜粉蝶的基本方法，以及幼虫和成虫的关键性能指标测定。这些方法的许多方面也适用于其他可在人工饲料上饲养的蝴蝶30,31和蛾类32,33,34。

本文通过一项关于金属耐受性的实验，来阐述饲养菜粉蝶的一般方法。重金属是一类常见的人为污染物，来源于人类产品的降解、工业过程，以及历史上在农药、油漆和其他产品中使用所遗留的污染35,36,37,38。许多重金属（包括铅、铜、锌和镍）可从土壤和水中进入植物组织39,40,41,42，而存在于粉尘中的金属也可沉积在植物叶片表面43,44,45，从而为植食性昆虫幼虫提供多种暴露途径。生命早期接触重金属可能对动物发育产生不利影响，尤其是对神经组织，高浓度时甚至可导致死亡35,36,46,47,48。已有大量研究表明，重金属暴露对发育中的昆虫（包括害虫和有益昆虫）具有负面影响49,50,51。由于重金属污染物种类繁多，且在人类环境中常共存52，因此需要精确的实验室方法，使研究人员能够将发育中的昆虫暴露于不同浓度和组合的多种金属中，以了解并减轻其对环境的影响。

本研究对比了常见金属对菜粉蝶存活和发育的影响，重点关注铜（Cu）、锌（Zn）和镍（Ni）这三种人类环境中常见的污染物。例如，来自美国明尼苏达州农村路边的草本植物中可含有高达71 ppm的锌、28 ppm的铜和5 ppm的镍53。本实验通过人工饲料调控菜粉蝶摄入这些金属的浓度，使其达到甚至超过环境中实际观测到的水平。采用人工饲料旨在比较这些金属的相对毒性，并预测菜粉蝶对非其生理必需的金属污染物（如镍）更为敏感，而对在酶和组织中虽含量较低但具有生理功能的金属（如铜和锌）耐受性更强（图1）。本文通篇提供详细的方法学描述及配套视频可视化内容，以展示这一重要蝴蝶模式系统的饲养与研究方法。

方案

本研究在 USDA APHIS 许可证 P526P-13-02979 下进行。

1. 实验蝴蝶的采集

  1. 用空中昆虫网捕捉成年雌性蝴蝶。粉蝶通常出现在开阔且受干扰的生境中，这些生境具有蜜源植物和寄主植物（十字花科植物）。
    1. 在阳光充足、气温温暖时进行搜寻。为定位雌性个体，应寻找那些在靠近地面处缓慢飞行、在植物上停留的个体。 "鼓" 用前足跗节感知叶片的味道。
  2. 将雌性个体放入笼中以收集卵。
    注意：野外采集的雌性个体平均与一到两只雄性交配过12，捕获后不久应开始产下可育卵。野外捕获的雌性需要自然光照以进行产卵和交配，因此应将笼子置于温室或窗台处。
  3. 将雌虫与寄主植物共同饲养以收集卵。
    注意：雌性可接受多种寄主植物，包括卷心菜、萝卜、羽衣甘蓝、芥蓝和莙荙菜。 拟南芥，但需确保植物未经过任何农药处理。
    1. 将寄主植物置于花盆或盛有水的容器中，以维持叶片压力，例如将羽衣甘蓝的茎放入花用注水管中。
    2. 如果研究人员希望收集卵并直接将其转移至饲料中，首先用橡皮筋将一片寄主植物叶片固定在装有水的塑料杯口，然后在杯口边缘覆盖一层封口膜；雌虫接触叶片时会将卵产在封口膜上（参见5).
  4. 确保笼内有能保持较高相对湿度的措施，例如每天浇灌一盆植物或弄湿毛巾，尤其是在干燥条件下。若在笼内浇灌盆栽植物，需在花盆下方放置毛巾，以防蝴蝶陷入积水中。
  5. 用黄色海绵提供10%稀释的蜂蜜水溶液喂养蝴蝶，蝴蝶能迅速学会取食这种溶液，尤其是当与有经验的个体共同饲养时。
    1. 为促使蝴蝶从海绵中取食，可将蝴蝶直接放在喂食器上，尤其是用喷雾瓶轻微喷水后，这通常会使其伸出喙。
    2. 设置饲喂器时，首先将黄色或橙色海绵彻底冲洗，然后将其切成适合放入60 mm塑料培养皿的小方块。每天更换饲喂器，并用稀释的漂白剂溶液清洗海绵，随后彻底冲洗，以防止霉菌生长。

2. 制备人工饲料

  1. 首先，根据表1或其他相关资料中的配方，确定实验所需的相应配方，并针对目标物种或具体实验进行必要的调整。打印出配方，以便在称量原料时参照执行。
  2. 将除琼脂外的所有干燥成分称量后放入一个容器中。确保将各成分放回其相应的储存位置，注意部分成分需在4°C下保存。将预先称量好的干燥成分混合物倒入搅拌机中，并加入5 mL亚麻籽油。
  3. 每批饲料制备时，请按以下步骤操作：
    1. 在容量至少为1 L的烧杯中，将15 g细筛琼脂与400 mL蒸馏水混合。放入微波炉加热至接近沸腾，使混合物中遍布细小气泡，每隔30-60 s搅拌一次，防止沸腾溢出。
    2. 向上述热琼脂混合液中加入400 mL自来水温度的蒸馏水，使其降温至适宜与干燥成分混合的温度，因为维生素混合物对热敏感。
    3. 将琼脂混合液倒入搅拌机中，充分混合，必要时刮取搅拌机边缘残留物。
  4. 在琼脂加热的同时，将至少七十个四盎司的饲料杯并排置于操作台上，杯壁相互接触。饲料充分混合后，将搅拌机中的混合物倒入饲料杯中，确保饲料覆盖每个杯子的底部。
  5. 待饲料冷却后，为杯子加盖，用饲料类型进行标记，将杯子叠放在托盘上，并在4 °C下保存最多1个月，以备后续使用。

3. 转移至人工饲料并进行饲养

  1. 将带有蝴蝶卵的寄主植物叶片放入30盎司的熟食杯中，并用带网盖的杯子置于24 °C的气候培养箱内。一周后检查杯子，确保幼虫已孵化并处于一龄末期或二龄初期，此阶段适合转移至人工饲料。
  2. 使用画笔将幼虫转移至人工饲料中，每次在不同幼虫容器之间操作时，需用漂白剂喷雾消毒画笔，并用水冲洗。每个4盎司的杯子中放入三只幼虫。尽管人工饲料能量密度高，能够支持较高密度的幼虫生长，但仍应避免将幼虫过度密集地放入杯中，因为高密度会导致疾病和霉菌在杯内传播。
  3. 将杯子侧放于塑料箱中，使虫粪掉落至杯子底部并远离饲料，从而降低霉菌和疾病风险。
    1. 将饲料杯置于温度受控、光照强度低至中等的环境中。通过透明杯盖定期每1–2天检查一次杯子，观察是否有霉菌或疾病发生。
    2. 若发现杯子中出现霉菌或疾病，可将其隔离或冷冻处理，以防止感染扩散至其他杯子。

4. 成虫羽化与处理

  1. 让幼虫在饲料杯中化蛹并羽化。成虫羽化后，需等待数小时使其翅膀硬化，然后再取出进行标记。用干净的手轻轻抓住成虫的翅膀将其从杯中取出，注意同时抓住靠近身体的全部四片翅膀会更稳定。
  2. 标记蝴蝶时，用一只手捏住干燥个体的头部和胸部，用细头记号笔在其后翅上轻轻标记数字。
    1. 通过翅斑特征和外生殖器结构综合判断性别：雌性通常在前翅背面具有两个黑色斑点，后翅颜色较深且偏黄；而雄性通常在较明亮的白色背景的前翅背面上仅有一个较小的黑斑54。
    2. 由于该体色特征存在个体和季节性变异，需通过腹部形态进一步确认性别——雄性腹部末端具有两个抱握器，且整体较细窄；雌性则具有单一的生殖孔。
  3. 转移成虫时，用一只手打开蜡纸玻璃纸信封，捏住蝴蝶的头部和胸部，将其滑入信封内，再用另一只手透过信封捏住其翅膀。
    1. 确保四片翅膀在信封内自然闭合。
    2. 实验前可将蝴蝶保存于低温环境（5–6 °C）中，最长可保存1周，但取出后需至少静置1天以适应室温。

5. 性能指标

  1. 测量死亡个体的翅部特征时，用一只手固定蝴蝶的胸部，用镊子从基部取下每一片翅膀。将翅膀平放在灯箱中，拍摄照片以供后续测量。
  2. 为估算繁殖力，将成虫饲养在交配笼中，至少给予雄性1天时间完成生殖成熟，并预留1天时间进行交配。在设定的时间点处死雌虫，通过解剖计数卵子数量，或每天在寄主植物上收集所产卵粒。
  3. 为估算卵负荷量，取下雌虫腹部，置于1×PBS缓冲液中，并沿腹侧剪开一条切口。
    1. 用镊子将内脏组织与体壁分离，然后将卵巢从肠道、气管及其他腹部内容物中拉出。
    2. 展开每侧卵巢内的四条卷曲的卵管，观察成熟、具卵黄且已形成卵壳的卵粒向未成熟卵泡转变的位置。使用计数器辅助统计成熟卵总数，通常范围为0–200枚卵。
  4. 为确定解剖后雌虫的交配状态，打开交配囊并分离其中的精包。随着精包被消化，通常会形成"尾状结构"，并相互嵌套。

6. 案例研究

注意：实验种群的成年雌性菜粉蝶于2014年从野外采集获得。成年雌蝶来源于美国加利福尼亚州戴维斯附近地区（N = 8只 founding females）。

  1. 饲养蝴蝶
    1. 将雌性动物饲养在 "BugDorm" 网格式笼子（61 cm × 61 cm × 61 cm）中，在温室自然光照条件下饲养。提供寄主植物卷心菜的有机叶片Brassica oleracea用于产卵。
    2. 为保持笼内湿度，可放入一株小型盆栽植物（宇宙），每天浇水，置于每个笼子内的毛巾上方。
    3. 每天收集卵，将带有新卵的叶片转移至带孔盖的473 mL塑料杯中，并放入气候室。
    4. 为蝴蝶提供 随意摄取 通过小培养皿中的黄色海绵提供10%的蜂蜜水溶液（用蒸馏水稀释有机蜂蜜制成），每日更换。
  2. 配制人工饲料
    1. 制备菜粉蝶幼虫的人工饲料，采用对先前开发的鳞翅目昆虫饲料进行改良的方法4一批饲料包含50 g小麦胚芽、27 g酪蛋白、10 g纤维素、24 g蔗糖、15 g卷心菜粉、9 g Wesson盐混合物、12 g圆酵母（Torula yeast）、3.6 g胆固醇、10.5 g Vanderzant维生素混合物、1.1 g对羟基苯甲酸甲酯、1.5 g山梨酸、3 g抗坏血酸和0.175 g链霉素（参见 材料表).
    2. 预先称量多批饲料所需的干燥成分表1）并充分混匀，以提高不同饲料类型间的均一性，随后分装成若干批次，用于与金属溶液混合。
    3. 将干燥成分与亚麻籽油及相应的金属混合物一同放入搅拌机中。
      注意：本实验中使用了亚麻籽油，因为此前由昆虫饲料供应商提供。目前 exclusively 使用有机亚麻籽油，其原料与亚麻籽油相同，但相较于市售亚麻籽油，更不易含有任何添加剂。
    4. 将配制好的饲料倒入 118 mL（4 oz）的塑料熟食杯中。使用可溶性金属盐将目标金属添加至人工饲料中。金属浓度应根据先前对植物中金属含量（如镍积累）的观测结果确定55,56,57 或植物的道路边污染58,59,60) 以及其他鳞翅目昆虫对金属的耐受性49,50,51.
    5. 将金属盐溶解于500–1,000 mL蒸馏水中，再取相应体积加入人工饲料中。例如，配制100 ppm镍饲料时，加入317.6 mL的1 M NiCl₂溶液。2 在混合前将溶液加入人工饲料中，使饲料中镍的最终浓度达到100 mg/g 干重（约53 mg/g 湿重）。该添加量相当于实测平均浓度109.6 ppm表2基于电感耦合等离子体原子发射光谱法。
      注意：金属含量水平由明尼苏达大学研究分析实验室采用六个样品进行测定。
  3. 维护
    1. 在23 °C、14:10光周期条件下，将采自寄主植物的卵置于人工气候箱中培养7天。此后，将低龄二龄幼虫转移至人工饲料中。
    2. 转移时，将来自同一植株的幼虫均匀分配到四种饲料类型中，以避免幼虫批次与饲料类型混淆。将幼虫（总计 N = 346）以每118 mL饲料杯放入两只的方式进行转移，以减少因过度拥挤导致的疾病发生，并为成虫羽化提供充足空间。
    3. 在饲养杯的杯盖上打孔（每盖三个）。将杯子放入鞋盒大小的塑料箱中进行饲养，不同饲料的杯子应交错放置，以避免饲养环境中的位置带来系统性影响。
    4. 将幼虫培养杯置于气候培养箱中，23 °C条件下保持14:10光照周期（在培养箱底部放置盛水容器以维持湿度在50%–60%，并使用家用湿度传感器监测）。若培养杯出现霉变（本案例研究中共计约八个培养杯），则将其从培养箱中移除，并将其中个体从实验中剔除。
    5. 让幼虫 在饲养杯中化蛹并羽化（N = 162）。
      注意：本研究中的饲养条件下，从卵收集到成虫羽化的发育时间平均约为25–30天（范围为20–40天，例如25,28).
    6. 当蛹即将羽化为成虫时，每天检查容器，及时取出已羽化的个体，并确保翅膀已干燥。使用细头黑色记号笔在成虫的后翅上标记其对应的个体编号（该编号在幼虫转移时已分配）。鉴定每个个体的性别，并将其编号、性别及羽化日期记录在玻璃纸信封上。将成虫放入玻璃纸信封中，置于 -20°C 保存，待后续处理。
      注意：少量新羽化成虫会出现翅发育畸形，影响飞行能力和成虫存活（5%–8%）；这些个体在本实验的存活率分析中被排除。
  4. 测量与数据分析
    1. 以二龄幼虫期（将幼虫放置于饲料上时）至成虫羽化期间的存活率作为生存率进行测量。
      注意：本研究以存活率和发育时间作为衡量不同饮食条件下表现的指标。
    2. 在气候室中，将转移至不同饮食到成虫羽化之间的天数作为发育时间进行测量。
    3. 进行数据分析时，运行两组包含金属与浓度之间交互作用的模型。
      注意：由于两个交互作用均显著（F2,194 = 4.56, p = 0.01 用于发育时间及 X2 = 12.1, p = 0.002，用于生存分析），该研究随后对每种金属分别进行了分析。
    4. 为分析存活率，对每种金属进行卡方检验，以评估金属剂量（分为四个类别）对成虫期存活且翅膀完整的影响。
    5. 当检测到剂量效应显著时，进行后续的卡方检验，将每个剂量水平与对照饮食组进行比较。为分析发育时间（从转移时间到成虫羽化的时间），检验性别对发育时间的影响。
      注意：由于性别对发育时间没有影响，（p > 0.10）时，我们将其从模型中剔除。
    6. 对每种金属分别进行独立的方差分析（ANOVA），以检验四种浓度对发育时间的影响。此外，针对每个浓度与对照组进行t检验，以确定出现性能效应的最低浓度。
      注意：本研究中所有分析均使用 JMP v16 完成。所有原始数据均可在 Mendeley 上获取。61.

结果

概述
人工饲料可用于在标准条件下饲养菜粉蝶，以测试特定饲料成分对蝴蝶生长表现的影响。在本研究中，采用人工饲料来探究生长于污染地区寄主植物中不同金属的毒性作用（图1）。幼虫被饲养在含有三种不同金属且浓度递增的饲料上（图2；具体方法学细节见方案第6节）。蝴蝶的存活和发育受铜和锌的影响较大，而受镍的影响最小（图3 和 图4），其敏感性与其他使用人工饲料饲养蝴蝶和蛾类的研究结果相当（图5）。

存活率
将蝴蝶幼虫转移至含有铜、镍、锌或对照的人工饲料中，每种金属的浓度分为三个水平（表3）。图2展示了毒素剂量递增时幼虫的代表性图像。镍的浓度变化对幼虫存活率无显著影响，但铜和锌的浓度对存活率均有显著影响（表3 和 图3）。事后卡方检验表明，仅在最高浓度锌（1,000 ppm）下，锌处理组的存活率相对于对照饲料显著下降（事后比较 X12 = 8.41，p = 0.004；图1）。铜处理组也仅在最高浓度（500 ppm）下表现出存活率的显著下降（X12 = 7.00，p = 0.008），尽管在两个最低浓度（50 ppm 和 100 ppm）下存活率有非显著性的提高（图3）。

发育时间
铜和锌浓度对发育时间有显著影响（表4 和 图4）。随着铜浓度的增加，发育时间延长，在50 ppm时与对照组相比出现显著差异（p = 0.027；图3）。随着锌浓度的增加，发育时间也延长，在100 ppm时与对照组相比出现显著差异（p = 0.03；图4）。镍浓度升高有导致发育时间延长的趋势（p = 0.08；表4），各处理组与对照组的比较显示，在100 ppm时已出现显著效应（p = 0.022；图4）。

金属浓度分析，柱状图；铜、镍、锌；环境影响研究结果。
图 1：蝴蝶组织及寄主植物中目标金属的观测水平。（数据来源62。）图中显示了在实验室以小白菜饲喂的粉蝶（Pieris）组织以及野外采集的芥菜（Bertorea sp.）中的铜、镍和锌含量。汽车图标表示沿高流量交通道路植物叶片中所检测到的金属水平53。本研究中使用的人工饲料金属含量见表 1；图中各点代表均值，误差线代表标准误。请点击此处查看该图的高清版本。

不同浓度饮食上毛虫的生长情况；实验结果；营养影响分析。
图 2：同一天转移到含有毒素浓度递增的人工饲料上的菜粉蝶幼虫图像。 本图展示了来自剂量-反应研究的幼虫（该研究在28中使用有毒植物马兜铃的干植物材料进行）。照片由 ESR 提供。请点击此处查看此图的放大版本。

不同铜、镍、锌浓度下的存活率；柱状图；毒性分析；生物学影响。
图3：随饲料中金属浓度升高，存活率的变化情况。 星号表示相对于对照组饲料，存活率存在显著差异。饲料中具体的金属浓度列于表2中。请点击此处查看本图的放大版本。

发育时间与浓度关系图；铜、镍、锌；误差线；ppm；实验结果。
图 4：金属浓度对发育时间的影响。 星号表示相对于对照组存在显著差异的最低金属浓度（采用 t 检验）。饲料中确切的金属浓度列于表 2中。数据点表示均值，误差线表示标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

重金属存活率图；Cd、Cu、Ni、Pb、Zn浓度与存活效应的关系，以ppm为单位的柱状图。
图 5：其他鳞翅目昆虫金属耐受性的汇总。 图中显示了来自11项已有研究49,50,51,56,63,64,65,66,67,68的综合存活数据。响应变量为首次观察到对存活产生负面影响时的金属浓度（单位：ppm）。蝴蝶符号表示本研究的结果，需注意其中镍的耐受值高于本研究测得的数值。数据点表示均值，误差线表示标准误。请点击此处查看该图的高清版本。

成分称量方式gmL
小麦胚芽干性成分50
纤维素干性成分10
卷心菜粉干性成分15
酪蛋白干性成分27
蔗糖干性成分24
Wesson 盐混合物干性成分9
酵母粉（Torula Yeast）干性成分12
胆固醇干性成分3.6
维生素混合物干性成分10.5
对羟基苯甲酸甲酯干性成分0.75
山梨酸干性成分1.5
抗坏血酸干性成分3
链霉素干性成分0.175
亚麻籽油湿性成分5
琼脂琼脂15

表1：人工饲料配方。 显示的是每批卷心菜粉蝶饲料中各成分的重量（和体积）。干燥成分（以及亚麻籽油）需与琼脂混合物（先溶于400 mL沸水中，再加入400 mL室温水降温）分开配制。

饮食类型铜 (ppm)镍 (ppm)锌 (ppm)
铜-“100 ppm”96.11.7569.9
镍-“100 ppm”7.29109.668.9
锌-“100 ppm”7.961.06186.2
锌-“500 ppm”6.511.16708
对照5.890.5959.3

表2：饲料中金属含量的测定。 显示的是研究中所用部分人工饲料中铜、镍和锌的平均含量。饲料名称（分析中的“类型”）列在左侧，引号中的数值为计算所得含量，目标浓度以引号标示。研究中使用的一部分饲料经过了分析，以确保计算值与实际值相符；需要注意的是，饲料组分的组成通常存在一定程度的微小变异，所报告的每一行数据仅代表一个重复样本。

金属皮尔逊 X32P
铜 (N = 118)17.820.0005
镍 (N = 152)3.450.33
锌 (N = 152)12.520.006

表3：金属浓度对存活率的影响。 显示的是每种金属的卡方检验结果，比较了三种金属浓度相对于对照组饮食的效果。

金属FP
铜 (N = 61)F3,57 = 9.84<0.0001
镍 (N = 75)F3,71 = 2.350.079
锌 (N = 64)F3,60 = 3.790.015

表4：金属浓度对发育时间的影响。 显示的是每种金属的单个ANOVA分析结果。

数据可用性：

所有数据均可在 Mendeley 上获取61。

讨论

本研究中，将菜粉蝶（Pieris rapae）饲养于人工饲料上，以考察重金属毒性的差异。通过该方法，本研究为这一易于操作的蝴蝶系统提供了通用的饲养及实验室研究方法。本讨论首先探讨与上述方法相关的更普遍的问题，随后回顾我们的科学发现，最后对人工饲料各组分的作用进行反思。

本文综述的实验方案提供了菜粉蝶的一般饲养方法步骤，但该方案中有许多环节可根据需要进行调整。例如，虽然本案例研究中使用海绵进行喂养，但其他研究人员已成功使用牙科棉条和填充蜂蜜水的丝制花朵5。尽管本研究使用蜂蜜水作为食物，但其他研究者曾使用糖溶液甚至佳得乐（Gatorade）。若需要称量蛹，或将蛹转移至其他条件以诱导羽化（例如诱导滞育并需要冷藏一个月），研究人员可向蛹喷洒少量水以润湿其丝质附着物，然后用羽毛镊轻轻取下，并使用双面胶重新悬挂。若研究人员在成虫行为实验的时间安排上需要更大的灵活性，可将成虫暂时存放于冰箱中数周，但需定期喂食。每隔数天，应将蝴蝶取出，喂以稀释的蜂蜜水溶液。在室内光照条件下，可通过使用细针将蝴蝶的喙器展开并接触食物以完成喂食。在成虫表现型研究方面，可对菜粉蝶进行多种适合度指标的测定。个体体型可通过特定发育阶段幼虫、蛹或成虫（处死后的标本或保存在玻璃纸信封中的活体）的湿重或干重来衡量，也可通过ImageJ软件测量翅长来评估（参见12,24,25,28）。雌虫终生繁殖力可通过每天在寄主植物上收集卵的数量进行测定25,69,70，特定性状的大小也可作为表现型指标进行测量；例如脑或特定脑区的质量或体积62,71,72，或胸部及飞行肌的质量或蛋白质含量62,70。最后，成虫还可用于行为学研究，以探讨食物调控对觅食或产卵选择行为的影响27,73。

如果饲养方案未达到预期效果，可从以下几个方面进行排查。首先，需确认光照强度是否足以引发正常的成虫行为。对于实验室驯化的品系而言， 菜粉蝶 将在荧光灯下产卵，但对于野生型品系，唯一有效的光源是强功率的全光谱温室灯。温室、窗台或户外的自然光最有利于诱导交配和产卵行为。其次，如果卵未孵化或幼虫在早期发育阶段死亡，需考虑以下几个因素：寄主植物材料必须为有机来源，需注意 "有机的" 从商店购买的植物有时经过化学处理，可能杀死幼虫，因此自行培育寄主植物通常是最佳选择。若寄主接受率较低，可尝试使用氮含量较高的嫩叶，提供盆栽植物而非单片叶子，并确保雌虫已完成交配。雌虫会接受正在结籽的 芸薹属即使是两周大的微小萌芽也适用。石蜡法可用于将卵转移到不同条件下，但需注意，其接受率通常低于整株植物。第三，饲料中的所有成分都必须是高质量且未过期的。亚麻籽油应每年更换，并冷藏保存。24,25小麦胚芽、维生素混合物和抗生素也应保持低温。第四，可以考虑调整饲养杯的设置。可使用多种一次性塑料杯进行饲养，容量从1盎司到15盎司不等。我们发现4盎司的杯子大小适宜，便于成虫羽化，并能紧凑地放入气候培养箱中。在杯盖上戳孔可促进空气流通，但在低湿度条件下，孔过多会导致饲料干燥，因此可能需要调整孔的数量。第五，气候培养箱内的条件可能需要与饲养杯的条件配合调整。若环境过于干燥，带有卵的寄主植物可能在幼虫转移前就干枯，饲养杯中的饲料也可能在蝴蝶羽化前变干；反之，若环境过于潮湿，饲养杯内容易滋生霉菌和病原体。研究人员可通过使用网状杯盖，或增减杯盖上的孔数，来调节杯内气流。另一个常见问题是培养箱内的灯光过亮，导致饲养杯内温度波动并产生冷凝水积聚；使用较暗的灯光是幼虫饲养的一个简便解决方案。

关于本文的研究问题，本研究发现菜粉蝶对铜的敏感性相对高于镍或锌。铜在低至50 ppm的浓度下即对发育时间产生显著的负面影响（图3 和 Table 3），在500 ppm浓度下对存活率产生负面影响（图4，Table 4）。相比之下，镍在浓度高达500 ppm时对存活率无负面影响（图3），在100 ppm时对发育时间亦无负面影响（图4）。菜粉蝶对锌表现出较强的耐受性，仅在1,000 ppm时观察到对存活率的影响（图3），而对发育时间的负面影响则从100 ppm开始出现（图4）。根据蝴蝶组织和芥菜类植物（其寄主植物；图1）中锌的相对较高含量，预期菜粉蝶对锌具有相对更强的耐受性。然而，考虑到蝴蝶组织中镍的含量极低（图1）以及铜作为必需微量元素的生理作用，菜粉蝶对铜的敏感性和对镍的耐受性在一定程度上出乎意料。这些出乎意料的发现将在下文结合其他蝴蝶和蛾类对这些金属的耐受性进行讨论。

为了将本研究的数据与在其他鳞翅目昆虫中测得的金属敏感性进行比较，我们汇总了现有研究中关于重金属对生存产生负面影响的最低浓度的数据49,50,51,56,63,64,65,66,67,68；这些研究主要集中在蛾类，尤其是害虫种类（Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.）。本研究中测得的所有敏感性值均接近于这些其他物种所报告的范围（图5）。然而，本研究中镍耐受性的测量值似乎高于预期——尽管在500 ppm时未观察到对生存的显著影响，但先前对Pieris rapae的研究也发现其对镍具有极高的耐受性（显著效应始于1,000 ppm56），尽管其组织中天然镍含量较低（图1）。本研究中铜敏感性的测量值也处于鳞翅目昆虫研究中的较低水平。虽然使用人工饲料便于对相对金属敏感性进行方便且受控的比较，但需要注意的是，饲料成分可能会影响绝对金属敏感性测量结果。例如，饲料中的维生素C可能缓解金属诱导的氧化应激74，或饲料中的抗生素可能改变微生物在金属代谢过程中的作用75。未来一个值得探索的研究方向是系统性地调控这些饲料成分，以检验其对金属毒性的效应，特别是考虑到目前关于鳞翅目昆虫肠道微生物功能作用的未解问题76,77 以及可能具有抗氧化特性的花蜜成分78。此外，不同物种间营养需求的差异使得种间比较具有挑战性，因此基于人工饲料的方法应与寄主植物的操控实验相结合。

这些蝴蝶对镍具有较强的耐受性，但对铜较为敏感。先前的研究指出，十字花科植物（包括粉蝶科蝴蝶偏爱的植物）中的许多种类会超量积累镍，以此作为抵御植食性动物的防御机制55,56,63,79,80,81。这种超量积累表现为植物组织中镍含量超过1,000 ppm，远高于大多数植物中的水平（图1）。正如先前推测的那样26，Pieris可能由于长期受到富镍植物的选择压力，因而对镍具有特别高的耐受性。尽管铜在昆虫饮食中作为微量元素的研究相对较少，但已有证据表明其在繁殖和免疫中起一定作用，尤其是在吸血昆虫中（例如82,83）。铜在蝴蝶体内的生理作用可能不如在其他动物中重要84,85,86，这与近期研究结果一致，即铜对昆虫而言可能与铅、镉和汞一样，是一种值得关注的污染物（例如87,88,89）。尽管已发现Pieris在低浓度下会回避铜污染90，但铜在植物体内具有较高的迁移性（例如可转移至叶片和花朵），因此也被列为值得关注的金属污染物91。

尽管这些结果为这些金属对菜粉蝶的相对毒性提供了有趣的数据，但本文还旨在作为详细可视化展示这一强大实验系统培育方法的通用指南。菜粉蝶在受控的实验室实验中易于饲养和操作。4,5 促进寄主搜寻行为的研究6,7,8觅食9,10,11，以及性选择12,13,14在人工饲料上成功饲养这些蝴蝶，是实现共同园艺条件以进行比较研究，并操控营养物质、毒素甚至新型寄主植物的关键。然而需要指出的是，该人工饲料未必是该物种的最佳人工饲料，未来通过进一步调整可能得以优化。例如，本饲料（及其他鳞翅目昆虫饲料）中的盐混合物最初是为脊椎动物设计的，其钙含量高于大多数昆虫的实际需求。92,93因此，我们的一些养殖工作已使用钙含量较低的定制盐混合物（例如，62），以及其他一些方法利用 "贝克氏盐混合物"，这可能更适合许多昆虫物种94在我们自己的操作中，我们也发现，与原始浓度相比，蝴蝶在小麦胚芽相对较少而纤维素相对较多的条件下表现更佳。4需要进一步关注的一个方面是饮食中的脂质来源及其浓度。例如，以往的研究表明，将本研究中使用的亚麻籽油替换为磷脂，可提高交配率和生长率 菜粉蝶 人工饲料上95特定脂肪酸在人工饲料中的补充可能具有额外的积极作用96,97优化人工饲料配方 菜粉蝶98,99 为研究营养生态学中的有趣问题创造了机会100,101,102、进化生态学和生态毒理学。这些人工饲料方法使研究人员能够探究特定脂质在认知进化中的作用103，对毒素的预适应28可降低污染物毒性的膳食成分104，或营养素之间的化学计量相互作用105.

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢本科助理在本研究饲养过程中提供的支持，特别是Regina Kurandina和Rhea Smykalski。Carolyn Kalinowski协助整理了其他鳞翅目昆虫中金属毒性的相关文献。本研究得益于明尼苏达大学生态学、进化与行为系的暑期研究资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 升 Pyrex 烧杯Fisher Scientific07-250-059
500 mL 量筒Fisher Scientific03-007-43
60 毫米塑料培养皿盖Fisher Scientific08-757-100B
抗坏血酸Frontier6015
搅拌机Amazon - Ninja StoreBL610 Professional
卷心菜粉Frontier1086
酪蛋白Frontier1100
纤维素Frontier3425
胆固醇SigmaC3045
饲养杯（4 盎司）Wasserstrom6094583需购买配套盖子
细网状琼脂Sigma
亚麻籽油amazonB004R63VI6
花卉供水管（2.8 × 0.8 英寸）Amazon - Yimaa DirectB08BZ969DK
玻璃纸信封（1 3/4 × 2 7/8 英寸）Amazon - Wizard Coin SupplyB0045FG90G
网笼（15.7 × 15.7 × 23.6"）AmazonB07SK6P94S
对羟基苯甲酸甲酯Frontier7685
Ohaus 便携式天平Fisher Scientific02-112-228
有机蜂蜜AmazonB07DHQQFGM
便携式摄影棚灯箱AmazonB07T6TNYJ1
塑料收纳箱（鞋盒尺寸）AmazonB09L3B3V1R
一次性塑料移液管Fisher Scientific13-680-50
山梨酸SigmaS1626
刮刀Fisher Scientific14-357Q
链霉素SigmaS9137
蔗糖Target
圆酵母Frontier1720
Vanderzant 维生素混合物FrontierF8045
称量舟Fisher Scientific01-549-750
Wesson 盐混合物FrontierF8680
小麦胚芽FrontierG1659
木柄蝴蝶网（12" 圆环）Amazon - Educational ScienceB00O5JDLVC
黄色海绵Amazon-CeloxB0B8HTHY5B

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在受控条件下饲养菜粉蝶（Pieris rapae）：重金属耐受性案例研究
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