的 离体 脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

摘要

本方案描述了一种利用膜片钳技术以高时空分辨率研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）电反应的方法，该方法可帮助研究人员同时提高分离脊髓和维持细胞活性的技术水平。

摘要

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。由于运动神经元是执行感觉运动行为的最终功能单元，直接研究SCS下运动神经元的电反应有助于我们理解脊髓运动调控的内在机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是一种在单细胞水平研究电生理特性的有效方法。然而，实现这一目标仍存在一些复杂的技术难点，包括维持细胞活性、快速将脊髓从骨性结构中分离，以及利用SCS成功诱导动作电位。本文提供了一种详细的膜片钳实验方案，可用于高时空分辨率下研究运动神经元对脊髓电刺激的电反应特性，帮助研究人员在熟练掌握脊髓分离和细胞活性维持技术的同时，顺利开展SCS对运动神经元电学机制的研究，避免不必要的试错过程。

引言

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。Andreas Rowald 等人报道，SCS 能够在单日内恢复下肢运动功能和躯干功能¹。探索 SCS 促进运动功能恢复的生物学机制，是当前开发更精确 SCS 策略的关键且热门的研究方向。例如，Grégoire Courtine 团队证明，脊髓中兴奋性 Vsx2 中间神经元和 Hoxa10 神经元是响应 SCS 的关键神经元，且细胞特异性的神经调控可在 SCI 后恢复大鼠的行走能力²。然而，目前很少有研究关注 SCS 在单细胞尺度上的电学机制。尽管已知超阈值直流刺激可在经典的枪乌贼实验中引发动作电位（AP）是公认的事实^3,4,5，但脉冲式交流电刺激（如 SCS）如何影响运动信号的产生仍不清楚。

鉴于脊髓内神经回路的复杂性，为研究脊髓电刺激（SCS）的电学机制，选择合适的细胞群体至关重要。尽管SCS通过激活本体感觉通路来恢复运动功能⁶，但运动神经元才是整合本体感觉信息传入信号后执行运动指令的最终功能单位⁷。因此，直接研究SCS下运动神经元的电学....

方案

所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准 ，并且研究均依照相关的动物福利法规进行。

1. 动物准备

1. 动物
   1. 饲养信息：将雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）饲养于特定病原体阴性环境中。
      注意：实验环境温度保持在 20 °C ± 2 °C，湿度：50%–60%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。动物可自由获取食物和水。
   2. 逆行标记运动神经元：在处死前2天，将Fluoro-Gold（FG）注入双侧胫前肌和腓肠肌（2%溶于无菌生理盐水，每块肌肉50 µL），以逆行标记运动神经元。
2. 溶液
   1. 配制切割液：混合 120 mM 氯化胆碱、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO₃₃，1.25 mM NaH₂PO₄，0.5 mM CaCl₂，7 mM MgCl₂，1.3 mM 抗坏血酸，15 mM 葡萄糖。用 95% O₂₂ 和5% CO₂₂ （用KOH调节pH至7.4）在解剖和切片前孵育30分钟。用碎冰冷却溶液。
   2. 配制人工脑脊液（ACSF）：混合126 mM Na....

结果

得益于精细操作过程中严格的低温维持补充图1，补充图2，和 图1），细胞活力良好，足以进行后续的电生理记录。为了尽可能模拟临床场景，我们采用显微操作技术将脊髓刺激（SCS）的阴极和阳极分别置于背侧中线附近和背根进入区（DREZ）附近（图2)，可启动脊髓背角的神经信号，传递至运动柱背外侧区域的运动神经元。在本研究中，我们使用FG标记直径为20-50 µm如图所示 图2D，G，我们有把握地确认健康的 FG+ 神经元为运动神经元——脊髓环路的终端。该标记方法为研究脊髓电刺激（SCS）如何影响放电模式奠定了基础。延迟放电与即时放电运动神经元的电生理特性列于 补充表1 和 补充表 2. 计算主动和被动特性的方法见于 补充文件 1.

当脊髓切片接受SC.......

讨论

由脊髓刺激（SCS）调节的运动信息最终汇聚于运动神经元。因此，以运动神经元为研究对象可能简化实验设计，并更直接地揭示SCS的神经调节机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是研究单细胞水平电生理特性的有效方法。然而，该方法仍存在一些技术难点，包括如何维持细胞活性、如何快速将脊髓从骨性结构中分离，以及如何成功利用SCS诱导动作电位（APs）。因此，本研究旨在帮助研究人员迅速掌握关键操作技能，避免潜在的技术陷阱，并尽早将注意力集中于实验设计而非方法学本身。

为了获得良好的细胞活力，应始终注意以下细节：（1）保持脊髓处于冰冻温度至关重要，因为低温可以抑制细胞死亡并减缓代谢速率，从而在灌注、解剖和切片过程中保护神经元免受机械损伤¹³；（2）使用显微剪刀精细地去除硬脊膜可增强神经元从周围溶液中摄取营养物质的能力。切勿直接撕除硬脊膜，否则将严重损伤脊髓。此外，若忘记清除硬脊膜，后续切片过程可能会变得困难，因为刀片可能无法完全切断硬脊膜，导致剩余的脊髓从琼脂糖中被撕出，从而导致切片失败。（3）与传统的横切片相比，斜切片可增加灰质面积，使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5’-三磷酸镁盐	Sigma	A9187
抗坏血酸	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
氯化胆碱	Sigma	C7527
盖玻片镊子	VETUS	36A-SA	夹取组织切片
D-葡萄糖	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
精细剪刀	RWD Life Science	S12006-10	剪开膈肌
荧光光源	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	标记运动神经元
鸟苷-5′-三磷酸钠盐水合物	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
红外CCD相机	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-葡萄糖酸盐	Sigma	P1847
低熔点琼脂糖	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
显微操作器	Sutter Instrument	MP-200
微电极拉制仪	Sutter instrument	P1000
显微剪刀	Jinzhong	wa1020	椎板切除术
解剖显微镜	Olympus	SZX10
电生理显微镜	Olympus	BX51WI
带齿显微镊	RWD Life Science	F11008-09	抬起被切割的椎体
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
磷酸肌酸钠	Sigma	P7936
电生理用物镜	Olympus	LUMPLFLN60XW	工作距离 2 mm
渗透压测定仪	Advanced	FISKE 210
膜片钳放大器	Axon	Multiclamp 700B
膜片钳数据采集器	Axon	Digidata 1550B
pH计	Mettler Toledo	FE28
切片固定锚	Multichannel system	SHD-27H
脊髓刺激器	PINS	T901
带齿镊子	RWD Life Science	F13030-10	抬起剑突
振动切片机	Leica	VT1200S
宽波段紫外激发滤光片	Olympus	U-MF2