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方法文章

的 离体 脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

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DOI：

10.3791/65385

⸱

2023年9月8日

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用膜片钳技术以高时空分辨率研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）电反应的方法，该方法可帮助研究人员同时提高分离脊髓和维持细胞活性的技术水平。

摘要

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。由于运动神经元是执行感觉运动行为的最终功能单元，直接研究SCS下运动神经元的电反应有助于我们理解脊髓运动调控的内在机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是一种在单细胞水平研究电生理特性的有效方法。然而，实现这一目标仍存在一些复杂的技术难点，包括维持细胞活性、快速将脊髓从骨性结构中分离，以及利用SCS成功诱导动作电位。本文提供了一种详细的膜片钳实验方案，可用于高时空分辨率下研究运动神经元对脊髓电刺激的电反应特性，帮助研究人员在熟练掌握脊髓分离和细胞活性维持技术的同时，顺利开展SCS对运动神经元电学机制的研究，避免不必要的试错过程。

引言

脊髓电刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。Andreas Rowald 等人报道，SCS 能够在单日内恢复下肢运动功能和躯干功能1。探索 SCS 促进运动功能恢复的生物学机制，是当前开发更精确 SCS 策略的关键且热门的研究方向。例如，Grégoire Courtine 团队证明，脊髓中兴奋性 Vsx2 中间神经元和 Hoxa10 神经元是响应 SCS 的关键神经元，且细胞特异性的神经调控可在 SCI 后恢复大鼠的行走能力2。然而，目前很少有研究关注 SCS 在单细胞尺度上的电学机制。尽管已知超阈值直流刺激可在经典的枪乌贼实验中引发动作电位（AP）是公认的事实3,4,5，但脉冲式交流电刺激（如 SCS）如何影响运动信号的产生仍不清楚。

鉴于脊髓内神经回路的复杂性，为研究脊髓电刺激（SCS）的电学机制，选择合适的细胞群体至关重要。尽管SCS通过激活本体感觉通路来恢复运动功能6，但运动神经元才是整合本体感觉信息传入信号后执行运动指令的最终功能单位7。因此，直接研究SCS下运动神经元的电学特性有助于我们理解脊髓运动调控的内在机制。

众所周知，膜片钳技术是细胞电生理记录的金标准方法，具有极高的时空分辨率8因此，本研究描述了一种利用膜片钳技术研究运动神经元对脊髓电刺激（SCS）电生理反应的方法。与脑部膜片钳相比9脊髓的膜片钳实验较为困难，原因如下：（1）脊髓由容积狭小的椎管保护，需要极为精细的显微操作，并在冰浴条件下严格维持，以获得较好的细胞活性。（2）由于脊髓过于细长，难以固定于切片托盘上，因此应将其浸入低熔点琼脂糖中，待凝固后修整成块再进行切片。

因此，该方法提供了在解剖脊髓的同时维持细胞活性的技术细节，从而顺利研究脊髓刺激（SCS）对运动神经元的电生理机制，并避免不必要的试验和错误。

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方案

所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准 ，并且研究均依照相关的动物福利法规进行。

1. 动物准备

  1. 动物
    1. 饲养信息：将雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）饲养于特定病原体阴性环境中。
      注意：实验环境温度保持在 20 °C ± 2 °C，湿度：50%–60%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。动物可自由获取食物和水。
    2. 逆行标记运动神经元：在处死前2天，将Fluoro-Gold（FG）注入双侧胫前肌和腓肠肌（2%溶于无菌生理盐水，每块肌肉50 µL），以逆行标记运动神经元。
  2. 溶液
    1. 配制切割液：混合 120 mM 氯化胆碱、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO₃3，1.25 mM NaH2PO4，0.5 mM CaCl2，7 mM MgCl2，1.3 mM 抗坏血酸，15 mM 葡萄糖。用 95% O₂2 和5% CO₂2 （用KOH调节pH至7.4）在解剖和切片前孵育30分钟。用碎冰冷却溶液。
    2. 配制人工脑脊液（ACSF）：混合126 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH2PO4；1.3 mM MgCl2，2.4 mM CaCl2，26 mM NaHCO₃3，以及 10 mM 葡萄糖。用 95% O₂2 和 5% CO2 孵育前孵育30分钟。
    3. 配制细胞内液：混合126 mM K-Gluconate、2 mM KCl、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA，用KOH调节pH至7.2，用去离子水配制。2，0.2 mM EGTA，10 mM HEPES，4 mM Na2ATP，0.4 mM Na2GTP、10 mM K-磷酸肌酸和0.5% Neurobiotin（pH 7.25，305 mOsm/Kg）。用碎冰冷却该溶液。
    4. 制备低熔点琼脂糖凝胶：将4 g琼脂糖溶解于100 mL切割液中，使用磁力搅拌子充分溶解。包埋前30 min，将低熔点琼脂糖在微波炉中高火加热1 min，随后转移至39 °C水浴中保温，保持液态。
  3. 仪器准备
    1. 将碎冰放在灌流托盘上（补充图 1A) 在灌注前10分钟。放置解剖托盘（补充图1B）和切割托盘（补充图1C在-80°C条件下预先将含水带样品过夜保存。
    2. 将带有尼龙网的孵育室提前置于45 °C烘箱中过夜。
    3. 使用低熔点琼脂糖预制一个35°斜面和一个2 mm厚的平台（补充图1D凝胶凝固后，将其置于35 mm培养皿中央，以在后续操作中支撑脊髓。
  4. 心脏内灌注
    1. 通过腹腔注射2.5%三溴乙醇（160 µL/10 g）对大鼠进行麻醉。通过检测其对外界刺激（如轻捏脚趾）无反应，确认大鼠已完全麻醉。
    2. 确认麻醉适当后，将大鼠仰卧放置，并固定于装有硅胶的培养皿中。
    3. 在剑突后方做一长约5 mm的纵向皮肤切口，随后充分扩张皮下间隙。沿腹侧正中线做一长约2 cm的纵向皮肤切口，从上述切口起始，至胸部顶端结束，以完全暴露胸壁外侧。
    4. 使用有齿镊子提起剑突 （补充图2A）），然后使用精细剪刀剪开膈肌。沿剑突两侧剪断胸骨以打开胸腔并暴露心脏（补充图 2B).
      注意：需小心保留双侧胸廓内血管，否则可能导致大出血。
    5. 使用无齿镊子提起左心室。沿左心室的长轴方向，将22 G针头插入左心室心尖部。补充图2C同时观察灌注管中是否有节律性的血液搏动，否则可能针头已刺入右心室，导致灌注效果不佳。
      注意：不应使用有齿镊子，否则可能导致镊子夹持部位额外出血。
    6. 使用精细剪刀剪开右心房（补充图2C），然后在1分钟内以约2 mL/s的速度手动注入100 mL冰冷灌注液。
      注意：当大鼠肝脏和足掌变苍白，且右心房无血液流出时，表明灌注效果良好。
  5. 脊髓解剖（图1)
    1. 将大鼠置于俯卧位，分别于髂前上棘处（约腰椎L4水平）和胸椎弯曲转折点处（约胸椎T6水平）切断脊柱，图1A然后立即将分离出的脊柱放入充氧的冰冻灌注液中，以冲洗残留的血液和脂肪组织；该步骤有助于在后续操作中保持手术视野的清洁。
      注意：应保留椎旁肌，以便后续使用昆虫针进行脊柱固定。
    2. 立即将分离的脊柱转移至解剖托盘中（图1B）腹面朝下，头端靠近操作者。向解剖托盘中加入50 mL持续充氧的冰冻切割液（图 1B).
    3. 使用四根昆虫针穿过脊柱旁肌肉来固定脊柱（图1B).
    4. 在解剖显微镜下，使用显微剪从头端开始切断两侧的椎弓根，此操作可称为 "椎板切除术" (图1C）。注意不要损伤脊髓。同时，使用显微有齿镊提起已切断的椎体。
    5. 椎板切除术后，不要立即分离脊髓与椎管。相反，应使用显微剪刀沿背侧中线剪开硬脊膜，以利于细胞间的营养摄取及含氧人工脑脊液（ACSF）的供应。图1D).
      注意：切勿撕裂硬脑膜，仅允许使用显微剪刀剪开硬脑膜，否则将严重损伤神经根和脊髓实质！
    6. 抬起脊髓的头端部分，然后小心地切断神经根，保留约1 mm长度（图1E）。将脊髓从椎管中分离后，使用2枚昆虫针将脊髓腹侧朝上固定图1F).
    7. 使用显微剪刀沿腹侧中线剪开硬脑膜（图1F）。剪除多余的神经根，保留约1 mm。
      注意：神经比脊髓坚韧得多。如果保留的神经根过长（>1 毫米），振动切片机无法完全切断神经根，可能导致脊髓实质发生严重撕裂。
    8. 使用显微剪将腰膨大部位分离成6-7 mm长度（图1G).
  6. 在低熔点琼脂糖中包埋
    1. 将腰膨大置于35°斜面上（图1H）背侧朝上，尾端朝下。用吸水滤纸除去组织表面多余的水分（图1H).
    2. 缓慢地将熔化的琼脂糖凝胶倒入含有腰膨大的培养皿中图1I).
      注意：倾倒速度不宜过快，否则凝胶中会产生气泡。
    3. 将上述培养皿置于冰水混合物中，尽快冷却凝胶，以利于维持细胞活性。
    4. 将凝胶修剪成 15 mm × 10 mm × 10 mm 的立方体，并用超级胶水将其固定在样品台盘上（图1J).
  7. 切片
    1. 将样品载片放入预冷冻的切片托盘中，然后倒入冰浴的切片液（图1K）。持续通入95% CO2 和5% O₂2 放入切割托盘中。
    2. 设定振动切片机参数：厚度：350 µm；速度：0.14–0.16 mm/s，振幅：1.0 毫米，振动频率：85 Hz。
    3. 每只动物收获2-3个合适的脑片。每片记录1-2个健康的FG+运动神经元，每只动物共记录5-6个细胞。
  8. 孵育
    1. 使用盖片镊子夹取一片切片（图1L）并将其放入充满持续充氧人工脑脊液（ACSF）的孵育室中。将孵育室置于32 °C水浴中孵育30分钟，随后在室温（RT）继续孵育30分钟，再进行记录。
      ​注意：从麻醉到获取第一片脑片的上述操作应在20–30分钟内完成，以最大程度保持细胞活性。每片脑片中的运动神经元可维持活性约6–7小时。

2. 使用 SCS 进行膜片钳记录 (图 2)

  1. 准备工作
    1. 以约1-2 mL/min的流速，将持续通入氧气的ACSF灌注到记录室中。通过蠕动泵的控制面板单独调节流速。
    2. 将脑片放入记录室中。使用带有尼龙线的U形铂丝牢固地固定脑片位置。
    3. 使用红外微分干涉差显微镜（IR-DIC）观察脑片。在4倍物镜下，确认背根长度约为1 mm。找到背根进入实质的区域，然后将视野中心移至该区域。
    4. 将脉冲发生器与自制电极连接（图2A）。
  2. 脊髓电刺激（SCS）配置
    1. 通过显微操作系统将SCS的阳极置于背侧中线附近（图2B）。
    2. 通过显微操作系统将SCS的阴极置于背根进入区（DREZ）附近（图2B）。
  3. 细胞定位与成像
    1. 使用IR-DIC配合10倍物镜粗略定位位于腹外侧运动柱的区域，该区域集中了大多数运动神经元。然后将视野中心移至该区域。
    2. 切换至60倍物镜，寻找表面光滑、明亮且细胞核不可见的健康神经元（图2C、F）。
    3. 略微降低红外光强度并打开荧光光源。将滤光片切换至宽波段紫外激发滤光片（图2D、G），以选择合适的荧光金阳性（FG+）运动神经元（图2E、H）。
    4. 使用吸吮电极对背根施加1倍运动阈值的刺激。若在运动神经元中记录到诱发电位（补充图3），则表明背根功能完整；否则应弃用该脑片。
  4. 膜片钳记录
    1. 用细胞内液填充微电极，并将其插入电极夹持器中。使用显微操作系统将电极缓慢下降至ACSF浴液中。电极电阻范围为5-8 MΩ。
    2. 向电极施加少量正压，以吹走灰尘和细胞碎片。
      1. 降低电极以接近细胞。当电极尖端接触FG+神经元表面时，可在尖端水平观察到膜出现轻微凹陷。此时释放正压。
      2. 然后使用注射器对电极施加轻微负压，产生轻微吸力使细胞膜贴附于玻璃电极尖端。始终注意软件界面上的总电阻，直至电阻值上升至吉欧姆级别（>1 GΩ），此时形成吉欧姆封接（gigaseal）。
    3. 将膜电位钳制在-70 mV，然后按下放大器软件界面上的快速电容补偿按钮。轻柔施加瞬时负压以破裂细胞膜，随后按下放大器软件界面上的慢速电容补偿按钮。此时即获得良好的全细胞记录构型。
    4. 通过点击软件界面上的IC按钮切换至电流钳模式，记录静息膜电位（RMP）。
    5. 开启SCS，刺激持续1-2秒，刺激幅度为1-10 mA，脉宽和频率分别固定为210 µs和40 Hz。通过逐步增加刺激强度直至首次观察到动作电位（AP），确定运动阈值。
    6. 在电流钳模式下，使用接近阈下电流（rheobase）的5秒去极化电流注入，区分延迟放电型与即时放电型运动神经元10、11、12。即时放电型运动神经元：低阈下电流即可诱发立即且重复的放电，放电频率稳定；延迟放电型运动神经元：高阈下电流诱发重复放电的潜伏期较长，且放电频率逐渐加快（图3）。
    7. 关闭SCS后，继续记录膜电位，以捕捉自发动作电位（AP）的发放。
    8. 在SCS开启和关闭状态下，进行电压钳记录兴奋性突触后电流（EPSC）。刺激参数为1倍运动阈值、210 µs、2 Hz。

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结果

得益于精细操作过程中严格的低温维持补充图1，补充图2，和 图1），细胞活力良好，足以进行后续的电生理记录。为了尽可能模拟临床场景，我们采用显微操作技术将脊髓刺激（SCS）的阴极和阳极分别置于背侧中线附近和背根进入区（DREZ）附近（图2)，可启动脊髓背角的神经信号，传递至运动柱背外侧区域的运动神经元。在本研究中，我们使用FG标记直径为20-50 µm如图所示 图2D，G，我们有把握地确认健康的 FG+ 神经元为运动神经元——脊髓环路的终端。该标记方法为研究脊髓电刺激（SCS）如何影响放电模式奠定了基础。延迟放电与即时放电运动神经元的电生理特性列于 补充表1 和 补充表 2. 计算主动和被动特性的方法见于 补充文件 1.

当脊髓切片接受SC...

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讨论

由脊髓刺激（SCS）调节的运动信息最终汇聚于运动神经元。因此，以运动神经元为研究对象可能简化实验设计，并更直接地揭示SCS的神经调节机制。为了同时记录多种刺激特征和细胞反应，膜片钳技术是研究单细胞水平电生理特性的有效方法。然而，该方法仍存在一些技术难点，包括如何维持细胞活性、如何快速将脊髓从骨性结构中分离，以及如何成功利用SCS诱导动作电位（APs）。因此，本研究旨在帮助研究人员迅速掌握关键操作技能，避免潜在的技术陷阱，并尽早将注意力集中于实验设计而非方法学本身。

为了获得良好的细胞活力，应始终注意以下细节：（1）保持脊髓处于冰冻温度至关重要，因为低温可以抑制细胞死亡并减缓代谢速率，从而在灌注、解剖和切片过程中保护神经元免受机械损伤13；（2）使用显微剪刀精细地去除硬脊膜可增强神经元从周围溶液中摄取营养物质的能力。切勿直接撕除硬脊膜，否则将严重损伤脊髓。此外，若忘记清除硬脊膜，后续切片过程可能会变得困难，因为刀片可能无法完全切断硬脊膜，导致剩余的脊髓从琼脂糖中被撕出，从而导致切片失败。（3）与传统的横切片相比，斜切片可增加灰质面积，使...

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致谢

本研究由 中国国家自然科学基金青年项目（52207254 和 82301657）以及 中国博士后科学基金（2022M711833）资助。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺苷-5’-三磷酸镁盐SigmaA9187
抗坏血酸SigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
氯化胆碱SigmaC7527
盖玻片镊子VETUS36A-SA夹取组织切片
D-葡萄糖SigmaG8270
EGTASigmaE4378
精细剪刀RWD Life ScienceS12006-10剪开膈肌
荧光光源Olympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochrome标记运动神经元
鸟苷-5′-三磷酸钠盐水合物SigmaG8877
HEPESSigmaH3375
红外CCD相机Dage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-葡萄糖酸盐SigmaP1847
低熔点琼脂糖SigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
显微操作器 Sutter Instrument MP-200
微电极拉制仪Sutter instrumentP1000
显微剪刀 Jinzhongwa1020椎板切除术
解剖显微镜Olympus SZX10
电生理显微镜Olympus BX51WI
带齿显微镊RWD Life ScienceF11008-09抬起被切割的椎体
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
磷酸肌酸钠SigmaP7936
电生理用物镜Olympus LUMPLFLN60XW工作距离 2 mm 
渗透压测定仪 Advanced FISKE 210
膜片钳放大器 Axon Multiclamp 700B
膜片钳数据采集器Axon Digidata 1550B
pH计 Mettler Toledo FE28
切片固定锚Multichannel systemSHD-27H
脊髓刺激器PINST901
带齿镊子RWD Life ScienceF13030-10抬起剑突
振动切片机LeicaVT1200S
宽波段紫外激发滤光片Olympus U-MF2

参考文献

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