当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。
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摘要
摘要
随着多光子显微镜和分子技术的进步，荧光成像正迅速发展成为研究活体脑组织结构、功能及可塑性的强大手段。与传统的电生理学方法相比，荧光显微镜不仅能捕捉神经元的活动，还能同时记录细胞形态，从而实现对特定神经元群体在单细胞或亚细胞分辨率下的长期记录。然而，高分辨率成像通常需要稳定的头部固定装置，这限制了动物的自由活动；此外，制备平坦的透明玻璃表面虽可实现一个或多个水平层面的神经元可视化，但在研究跨越不同深度的垂直结构时存在局限性。本文介绍一种结合头部固定板与微棱镜的技术，以实现多层、多模态成像。该手术方法不仅能够完整获取小鼠视觉皮层的全层结构，还可支持在头部固定状态下进行双光子成像，以及在自由活动范式下进行单光子成像。利用该方法，可对跨越不同皮层的特定细胞群体进行采样，记录其在头部固定与自由活动状态下的反应，并实现长达数月的长期追踪。因此，该技术为研究神经微环路提供了一种全面的检测手段，能够直接比较由精确控制的刺激所诱发的神经活动与自然行为范式下的神经活动。
引言
技术的出现 体内 双光子荧光成像1,2结合光学系统新技术与基因改造的荧光指示剂，已成为神经科学领域研究活体大脑复杂结构、功能及可塑性的强大技术3,4特别是，这种成像方式相较于传统电生理学具有无与伦比的优势，能够同时捕捉神经元的形态结构和动态活动，从而实现对已识别神经元的长期追踪5,6,7,8.
尽管高分辨率荧光成像具有显著优势，但其应用通常需要静态的、头部固定的实验装置，这限制了动物的活动能力9,10,11。此外，利用透明玻璃表面观察神经元时，仅能对一个或多个水平平面进行成像，从而限制了对跨越不同皮层深度的垂直方向动态过程的探究12。
针对这些局限性，本研究提出了一种创新的手术方法，结合头固定板、微棱镜和微型显微镜，构建出具有多层与多模态成像能力的成像技术。微棱镜可实现对皮层柱内垂直信息处理过程的观察13,14,15,16，这对于理解信息在皮层不同层次间传递时如何被加工与转换，以及在可塑性变化过程中垂直处理如何发生改变至关重要。此外，该方法能够在头固定范式和自由活动状态下对同一神经元群体进行成像，覆盖了多种实验条件17,18,19：例如，头固定通常适用于需要精确控制的实验范式，如感觉知觉评估以及双光子成像下的稳定记录；而自由活动状态则为行为学研究提供了更自然、更灵活的环境。因此，能够在两种模式下进行直接比较的能力，对于深入理解支持灵活且功能性神经反应的微环路机制至关重要。
本质上，将头部固定板、微棱镜与微型显微镜整合到荧光成像中，为研究大脑结构与功能的复杂性提供了一个极具前景的平台。研究人员能够跨多个深度采样涵盖所有皮层的特定细胞群，直接比较这些细胞群在严格控制条件和自然范式下的反应，并在数月时间内监测其长期变化20。该方法有助于深入理解这些神经细胞群在不同实验条件下如何随时间相互作用并发生改变，从而揭示神经环路的动态特性。
方案
所有实验均根据英国《1986年动物（科学程序）法》在个人许可和项目许可下进行，这些许可由英国内政部在经过适当的伦理审查后批准并签发。实验使用了成年转基因品系 CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 及其后代。为确保实验人员的安全并维持无菌条件，所有操作均在无菌条件下进行，并全程穿戴完整的个人防护装备。
1. 术前准备
- 为减轻水肿，术前12-24小时皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）。
- 手术前，将所有外科器械在高压灭菌器中灭菌，并用含蒸馏水的稳定化次氯酸及70%乙醇对外科操作区域进行消毒。确保所有外科设备均已开启。
- 使用异氟烷麻醉动物（24周龄，雄性，体重31 g），诱导剂量为5%，待小鼠固定于立体定位仪后，剂量降至1%–2%，同时供给氧气2 保持在1-2 L/min。皮下注射非甾体抗炎药（卡洛芬，2.5 mg/kg）。
- 通过检查足趾夹捏反射是否存在来评估麻醉深度（若出现反射，则以0.5%为增量增加异氟烷浓度）。
- 剃除动物头部毛发，使用修剪器从耳后至略高于眼睛的区域进行剃毛。用酒精棉片和聚维酮碘溶液清洁该区域，注意避免接触动物的眼睛。
- 将动物固定于恒温加热垫和配备耳杆与门齿夹的立体定位仪上，并固定头部。确保头部稳定，这对后续操作的成功至关重要（图1).
- 在动物眼部涂抹眼用软膏，防止手术过程中眼睛干涩，并用铝箔遮盖以避光。用无菌手术巾覆盖动物身体。
图1：术前准备。 将小鼠置于立体定位仪上，用鼻夹和耳棒固定。小鼠放置在温度可控的加热垫上。眼睛涂抹了眼膏，并用铝箔覆盖。头部已剃毛，颅骨暴露。动物体表覆盖无菌敷料。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 开颅术
- 使用手术剪刀沿头部剃毛区域的中线切开皮肤，暴露颅骨。
- 使用无菌棉签和稀释的过氧化氢（3% w/v，由35% H₂O₂配制）清洁颅骨2O2 在97% dH₂O中2O) 持续1-3秒，以去除任何结缔组织（图 2A）。用一滴70%乙醇和新的无菌棉签擦干头骨。
- 将颅骨在前后方向（AP）和内侧/外侧方向（ML）上对齐，以确保准确的植入位点。为此，测量前囟（bregma）和后囟（lambda）处颅骨的背腹向（DV）深度，并确保两者之间的差值 <0.03 mm。对于矢状向对齐，从正中线开始测量两侧顶骨上的等距点，并再次确保DV方向的差异为 <0.03 mm
- 以bregma为原点，定位并标记目标皮层区域；此处为目标为单眼初级视皮层（V1），前后方向（AP）：-3.5 mm，内侧-外侧方向（ML）：-2.5 mm。
- 使用直径为1.8 mm的环钻钻头和转速为10,000 rpm的牙科钻暴露皮层，确保目标皮层区域（单眼V1区）的标记位于钻头窗口的下三分之一范围内。
- 确保钻头角度与颅骨曲率垂直。这将保证开颅均匀，并防止损伤硬脑膜或皮层。
- 钻孔至阻力减小后停止（图2B）。使用23G针尖小心移除游离的骨碎片（图 2C).
- 用浸有冷人工脑脊液（ACSF）的手术海绵清洁暴露的皮层，以清除任何碎屑并止住可能发生的出血。
- 手术过程中始终使用冷的ACSF保持暴露的大脑皮层湿润。
图2：颅骨开窗术。（A）显示从bregma至lambda之间的皮肤切口。已将暴露表面的结缔组织清除。（B）使用环钻进行颅骨开窗，尚未移除骨片。（C）移除骨片后的颅骨开窗，显示完整的硬脑膜与皮层（比例尺代表0.5 mm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
3. 预切切口
注意：进行预切口时需考虑，切口及微棱镜植入的位置应位于成像感兴趣区域（ROI）的前方，以确保获得完整且准确的视野。在本方案中，切口将沿中线-侧线轴进行，微棱镜朝向后方放置（图 3B）。
- 为了便于插入微棱镜并减轻插入过程中对皮层的压力，需先进行切口。
- 将手术刀固定在立体定位仪臂架上，并调整刀片或立体定位臂的方向，使其沿冠状面（ML轴）方向切割。
- 将手术刀移至目标前后（AP）坐标（AP: -3.4 mm）；由于棱镜需位于成像感兴趣区域（ROI）前方，因此切口位置应比成像ROI的AP坐标（-3.5 mm）前移100 µm。
- 将手术刀移至颅骨开窗的内侧边缘，使其与颅骨相接处，缓慢下放手术刀直至接触骨面后停止。由于颅骨厚度为200 µm，需将此数值纳入总插入深度的计算中（见步骤5.1的计算方法）。
- 最佳成像位置位于棱镜中心，即500 µm处；因此，需确保该深度与皮层柱的深度（ROI DV: -0.35 mm）对齐。
- 在计算深度时需计入颅骨厚度，使用以下公式确定从颅骨表面开始预切切口所需的深度。本方案中，植入深度计算如下：
颅骨厚度（200 µm）+ 成像ROI深度（例如350 µm）+ 棱镜剩余插入深度（500 µm）= 1,050 µm
- 在计算深度时需计入颅骨厚度，使用以下公式确定从颅骨表面开始预切切口所需的深度。本方案中，植入深度计算如下：
- 确保切口长度超过1 mm但不过长；因此，1.2 mm的距离最为理想，单侧ML坐标应位于该距离的中点。
- 准备进行切口时，清除多余的ACSF，以免视野受阻（图3A）。
- 将手术刀从颅骨开窗的内侧边缘移至切口起始的内侧坐标位置，缓慢（10 µm/s）将刀片下放进入皮层。
- 一旦刀片刺破硬脑膜并进入皮层，立即在皮层表面滴加一滴冷ACSF，以保持组织在切口过程中的润滑与湿润。
- 达到最终深度后，开始沿ML轴方向移动手术刀（速度为10 µm/s）。
- 在进行切口时持续观察周围组织。若发现组织随刀片拖拽，可上下移动刀片数次，确保组织被完全切开，然后继续向侧方推进，并注意将刀片重新下放至最终设定深度。
- 切口完成后，缓慢抬起手术刀。若切口过程中出现出血，可利用此时间用浸有ACSF的外科海绵清洁切口区域，以稀释血液并将切口内的血液挤出。切记在暴露的皮层上保留一块新鲜、饱和的外科海绵，直至准备插入微棱镜为止。
图3：微棱镜植入。（A）预先切割的切口。（B）集成微棱镜透镜的示意图，显示其在皮层中的位置。（C）集成微棱镜透镜与预先切割的切口对准，准备插入皮层（比例尺为 0.5 mm）。（D）在集成透镜周围使用牙科水泥加固以将其固定于颅骨的示例。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 微棱镜植入与头固定板植入
- 微棱镜镜头由一端连接棱镜的梯度折射率镜头组成，该棱镜位于镜头远端，并集成于基板中。将微棱镜连接至植入套件。
- 确保棱镜的成像面与基板螺丝相对。为便于微棱镜的插入与定位，将其固定于立体定位架上，并调整棱镜方向，使其与切口对齐（图3C）。
- 以缓慢速度（10 µm/s）将微棱镜降至切口位置。插入棱镜初期需移除人工脑脊液（ACSF），但一旦进入皮层，应使用冷ACSF冲洗，以润滑插入过程。
- 在将棱镜缓慢下放过程中，皮层应保持稳定；若出现不稳定，可添加额外ACSF，并通过上下移动棱镜轻微搅动皮层，以使皮层与棱镜分离。
- 到达最终深度后，使用无菌纱布轻轻干燥暴露的皮层表面，注意避免触碰棱镜。
- 使用硅胶粘合剂在棱镜周围暴露的皮层区域以及镜头表面覆盖一层保护层，尽量减少粘合剂在周围颅骨和假镜头上的残留。
- 待粘合剂固化（5–10分钟）后，将头板固定于颅骨上，以在固定头部成像过程中稳定动物头部。
- 确保头板位置足够靠后，以免干扰植入物的放置，并为水泥的充分涂抹留出空间，以牢固固定植入物。
- 确保头板中线略偏植入镜头右侧，以便在进行固定头部实验时，头板两侧均可牢固连接至头部固定装置。
- 在头板与颅骨上涂抹粘合水泥。
- 通过将1勺不透光水泥粉末与4滴混合液混合，并加入1滴催化剂，配制粘合牙科水泥。
- 将水泥涂抹于头板和颅骨上，并用手固定头板直至水泥固化，确保其与耳杆平行（通过目视检查，从动物头部上方及后方进行观察）。
- 继续使用粘合水泥覆盖其余暴露的颅骨与组织，将微棱镜（至基板底部）和头板一并包裹。
- 避免将水泥沾到基板、假显微镜或其任何组件上。持续涂抹粘合水泥，直至微棱镜与头板完全覆盖并稳固（图3D）。
- 水泥固化后，通过缓慢向上移动立体定位臂，同时用镊子稳定微棱镜，将假显微镜分离（二者通过磁体连接，因此分离时可能感受到一定阻力）。
- 将保护盖插入镜头并拧紧螺丝，以固定其位置。
- 将动物从立体定位架上取下，置于温暖的恢复箱中恢复，并皮下注射温热的无菌0.9%生理盐水（剂量为体重的3%）。
- 待动物清醒并可自主活动后，将其放回清洁的单养笼中。监测动物状态，并根据所在机构的镇痛政策给予术后额外镇痛处理。
- 术后等待4周，动物即可准备进行成像实验。
5. 自由活动小鼠皮层的单光子钙成像
注意：每次必须使用原始成像会话中采集的图像，以确保准确获取目标成像平面。这些已识别的解剖标志点与神经元共同在后续步骤9所述的配准过程中发挥关键作用。在采集单光子数据时，微型显微镜既是成像系统也是激光光源。激发光源采用LED，其在物镜前表面的功率范围为0–2 mW/mm2。激光激发波长为455 ± 8 nm（蓝光），适用于GCaMP信号检测。可通过镜头焦距滑块调节焦平面（Z轴），该参数在界面上以0–1000表示，其中0对应0 µm的工作距离，1000对应最大300 µm的工作距离。
- 在采集数据之前，让动物在记录会话前于房间和开放旷场中适应 1 小时。
- 成像前，使用适当的消毒剂（例如，用蒸馏水配制的稳定次氯酸和 70% 乙醇）对所有物品进行消毒和清洁。
- 通过将数据采集盒（DAQ 盒）连接至计算机并启动数据采集软件来设置系统。建议使用以太网线建立直接连接，以尽量减少丢帧；然而，若无线信号较强，无线连接模式也可能足够使用。
- 在轻柔提起动物颈背部皮肤的情况下，将微型显微镜安装到动物的基板上。
- 首先，松开固定螺钉，取下基板上的保护盖。使用镊子夹住保护盖的孔洞部位。然后，将微型显微镜安装到原本保护盖所在位置的基板上。
- 安装前需检查微型显微镜相对于基板的方向，确保带有螺钉标记的一侧朝向螺钉。
- 微型显微镜安装到位后，拧紧固定螺钉以固定设备。仅需将螺钉拧至感到轻微阻力即可。过度拧紧可能损坏微型显微镜，应避免。
- 将微型显微镜连接至 DAQ 盒，并准备软件进行记录。
- 在数据采集软件中，开启微型显微镜的数据流，并调整记录参数（成像帧率、增益、LED 功率、efocus 值），以获得清晰的视野（图 4A）。
- 打开直方图窗口，调节增益和 LED 功率，使记录的信号强度保持在 35% 至 70% 之间。
- 若进行纵向研究，请参考之前会话中的记录或快照，调整 efocus 值，以确保清晰地观察到相同的成像平面。
- 开始实验并启动数据采集。
- 实验结束后，将动物从行为装置中取出。
- 在轻柔提起动物颈背部皮肤的情况下，松开固定螺钉，并将微型显微镜从动物的基板上取下。
- 将保护盖重新安装回基板，并用固定螺钉固定。
- 将动物放回其饲养笼中（如需处理单光子数据，请继续执行步骤 7）。
图4数据采集与软件处理 (A显示微型显微镜实时图像流的界面。建议调节镜头焦距值，使实时成像窗口中呈现清晰的视野，同时调整增益和成像激光功率B) 示意图展示了在不同时间点记录的实验会话推荐的配准流程。建议根据数据处理软件的说明，从第一次会话中生成一幅平均图像，并在后续会话的运动校正过程中将该图像用作参考图像。C) 同一最大投影的 ΔF/F 图像中四个细胞的示例。在每个细胞上绘制一条橙色线，以测量其细胞直径（单位：像素），取平均值作为细胞识别算法的输入参数（左上：13，右上：11，左下：12，右下：13）。D) 经人工校正后的细胞识别算法输出结果（图像已裁剪）。白色轮廓代表识别出的细胞（比例尺代表 100 µm). 请点击此处以查看此图的放大版本。
6. 头部固定小鼠皮层的双光子钙成像
注意：双光子激光扫描显微镜所用光源为可调谐超快激光器，激发波长为 920 nm。激发功率在物镜处测量，通常介于 100–150 mW 之间，并在每次实验中进行调整，以获得相似的荧光强度水平。发射光通过发射滤光片（525/70 nm）过滤后，由独立的光电倍增管（PMT）检测，该通道称为绿色通道。图像使用 20 倍空气浸没物镜（数值孔径 NA = 0.45，工作距离为 6.9–8.2 mm）采集。
- 在采集数据之前，应在实验前数天让动物适应装置（使动物对行为学实验装置感到适应）。每天让动物在装置中探索 15–30 分钟，持续 2–3 天，直至其表现出自然行为，再开始数据采集。
- 打开双光子成像系统，启动采集软件，并打开激光器。继续操作前，确保激光器已关闭快门，且光电倍增管（PMT）已关闭。
- 使用蒸馏水和 70% 乙醇，以稳定化的次氯酸清洁双光子成像装置。
- 确保根据动物体型调整装置。轻柔地将小鼠及其头板固定在头部固定装置上，并拧紧螺丝以稳定小鼠头部。
- 固定后，取下物镜盖（参见步骤 5.4.1），并调整物镜位置，使其对准基板。
- 使用落射荧光和 XYZ 载物台控制功能，将皮层组织调至焦点。
- 一旦皮层各层可见，切换显微镜以启用双光子成像（更换为二向色镜，关闭荧光快门，并关闭落射荧光激光器和显示器）。成像时务必关闭主光源，以保护光电倍增管（PMT）。
- 设置参数以优化所采集的图像文件。
- 进行钙成像时使用共振扫描模式，因其可捕捉 GCaMP 信号的快速发放。
- 调节激光功率、PMT 增益、缩放倍数和查找表（LUTs），以获得最佳图像，并参考单光子图像确保成像的焦平面正确。
- 使用双光子系统开始对皮层各层进行成像，同步进行行为监测和刺激输入（如适用）。
- 若需在不同时间点重复获取相同图像，请务必保存这些采集参数及 XYZ 距离。
- 为获取皮层各层的 z 轴堆栈图像（z-stack），请按以下步骤操作。
- 确定 z 轴堆栈的起始平面，调整采集参数以优化图像，并在软件中标记为起始点。
- 接着，使用 Z 轴控制逐层向下移动，仅调节激光功率以保持堆栈图像亮度一致，并在软件中标记堆栈终点。
- 关键步骤：在Laser Power Gradient选项卡下的Relative Exponential Gradient选项中，允许软件计算在 z 轴堆栈移动过程中激光功率的递增。务必记录软件提供的表格中终点处的激光功率值，以便软件计算梯度。
- 设置好 z 轴堆栈参数后，调整步长（µm）。
注意：步长将决定采集时间、切片数量及堆栈图像的细节质量。较小的步长将导致更长的采集时间、更多的切片数量以及更优的细节，相较于较大的步长。z 轴堆栈用于辅助单光子与双光子图像的配准，因其可突出显示解剖标志或特征。
- 为获取神经元钙信号变化的时间序列（T-series），使用 XYZ 载物台控制找到最佳焦平面，并调节激光功率、PMT 增益、缩放倍数和查找表（LUTs）。
- 在采集软件的T-series选项卡下，设定采集频率参数，使其与单光子成像系统所采集的数据频率一致。
注意：频率匹配将使 1P 与 2P 数据具有可比性，更适用于数据处理步骤中使用的细胞识别算法。可在 T-series 采集过程中整合多个触发信号及其他采集模式。
- 在采集软件的T-series选项卡下，设定采集频率参数，使其与单光子成像系统所采集的数据频率一致。
- 开始 T-series 采集。
7. 单光子钙成像数据处理
- 对于单光子记录的视频，使用与微型显微镜系统配套的数据处理软件。
- 首先对视频进行空间和时间上的降采样预处理。通常将视频的空间分辨率降低为原来的二分之一，可在不显著影响细胞识别准确性的前提下大幅缩短处理时间。
- 设置时间降采样因子，使视频的帧率降至约 10 Hz，以更好地适配后续步骤中使用的细胞识别算法。
- 如果在同一天获取了多个视频，应在预处理前将这些视频合并为一个连续的时间序列，以便统一处理。
- 可选：对视频应用空间带通滤波器，去除低频和高频空间成分，从而获得对比度更高、更平滑的视频。
- 使用软件中的运动校正功能对视频进行配准。该步骤可对视频进行配准，并校正由于微型显微镜相对于成像表面移动所引起的运动伪影。
- 关键步骤：若进行纵向研究，应将各次视频配准至同一视野，例如以首次成像日所获取视频的平均图像作为参考（图 4B）。
- 使用相应的功能模块计算视频的 ΔF/F，并生成 ΔF/F 视频的最大投影图像。该图像将显示荧光水平发生变化的区域，可能为单个神经元，也可用于测量神经元的平均直径（图 4C）。
- 或者，在已完成运动校正的视频上测量细胞直径，此时神经元呈现清晰的荧光信号。
- 使用软件中的算法识别细胞。
- 尽管此步骤提供两种选项（PCA-ICA 和 CNMF-E），本研究中应使用 CNMF-E。输入以像素为单位的平均细胞直径，并运行算法，生成包含具有细胞样活动特征的兴趣区域（ROIs）的细胞集合。
- 人工筛选出符合细胞特征的 ROI（具有类似细胞的形态、活动性22,23，且位于视场范围内），并验证经过筛选的细胞集合（图 4D）。
- 导出每个 ROI 的钙信号轨迹，用于进一步分析。
8. 双光子钙成像数据处理
- 对于双光子记录视频，使用专为处理双光子钙成像分析数据设计的 Python 软件包。
- 首先，按照以下说明将 T 系列中采集的图像合并为一个 .tiff 图像栈。
- 在运行选项界面下，调整参数（包括 tau 值和帧率），使其与所使用的 GCaMP 类型及记录的帧率相匹配。
- 可选：将 do_registration 参数设置为 1，以对视频进行配准。这相当于上述的运动校正步骤。
- 可选：将 anatomical_only 参数设置为 1，以便在荧光动态信息的基础上，结合解剖学特征检测感兴趣区域（ROI）。此操作需要输入细胞直径，请使用图像处理软件进行测量。通常建议启用此选项，因为它生成的 ROI 形状更接近自然形态（图 5A-C）。
- 设置完所有参数后，运行算法以一次性完成全部计算。可参考图形用户界面（GUI）查看处理进度。
- 处理完成后，返回细胞选择界面，对手动校正细胞识别结果进行人工筛选。
- 将经过人工校正的细胞集合图像叠加在视频的最大投影图像上并保存。该图像后续将用作单光子记录数据配准的参考图像。
- 算法随后会自动以 .npy 格式保存结果，之后可通过 Python 调用。或者，也可将结果保存为其他格式的文件，以便在其他软件中进行进一步分析。
图5：使用双光子处理软件进行细胞识别。（A）来自双光子处理软件的细胞识别代表性图像。将Anatomical_only参数设为0，同时保持所有其他参数不变时，在虚线区域之间存在多个非细胞结构，干扰了对真实细胞的手动校正。（B）从（A）中获取的细胞直径测量示例，使用图像处理软件进行测量（左上：7.5像素，右上：9，左下：6.5，右下：7.5）。（C）细胞识别的代表性图像。当将Anatomical_only参数设为1，并将（B）中获得的平均细胞直径输入至细胞直径算法后，虚线区域之间不再出现细胞（比例尺代表200 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
9. 跨成像模式识别细胞集的配准
- 通过单光子成像软件的 Python 接口获取多模态图像配准与分析算法（MIRA），对从单光子和双光子记录中识别的细胞进行配准。
- 该算法通过非刚性配准对单光子和双光子数据进行对齐。参见网站上为此研究提供的在线示例笔记本集合。
注意：这些笔记本的编写旨在使所有处理均在单光子软件中完成，因此与双光子处理软件不兼容。因此，仅需按照笔记本中的部分步骤进行本研究。
- 该算法通过非刚性配准对单光子和双光子数据进行对齐。参见网站上为此研究提供的在线示例笔记本集合。
- 按照示例笔记本中描述的步骤操作，包括为每种成像模态生成结构图像。默认情况下，这包括生成双光子 z 轴堆栈的最大投影图像和单光子记录的平均图像。或者，也可使用双光子记录的平均图像。
- 在提示处，对图像进行空间带通滤波以更清晰地显示标志点，并重新调整方向使其匹配。
- 在两幅图像上选择对应的标志点（图 6A）。
- 利用这些标志点计算对齐两幅图像所需的形变（warp）。通常，3 至 5 个标志点已足够。
- 该算法基于标志点与图像相似性的组合来计算形变。优化两个因素之间的相对权重，直至获得满意的结果。
- 将单光子会话中获取的细胞图谱进行形变处理，生成与双光子数据对齐的新细胞图谱。
- 然后将此形变后的细胞图谱导入单光子处理软件，生成一幅以双光子视频最大投影图像为背景的图像。
- 导出该图像用于配准。
- 在编程软件中，对迄今为止生成的两幅图像（双光子细胞图谱叠加在双光子最大投影图像上）进行对齐，并将单光子细胞图谱形变后叠加到双光子最大投影图像上（图 6B、C）。
- 为此研究，使用一种配准估计应用程序，该程序允许用户比较不同配准技术的结果。由于两幅图像具有相同的背景，采用刚性配准的相位相关技术已足够。
- 配准完成后，扫描已配准的图像以查找重叠的感兴趣区域（ROI）。这些是在两次记录会话中均活跃的 ROI，可用于进一步分析。
图6：使用MIRA工作流程进行多模态细胞配准。（A）细胞对齐工作流程中的代表性图像。左侧显示单光子数据的平均图像，右侧显示双光子数据的平均图像。软件中通过随机颜色方案（红色圆圈）选择并标记了两幅图像中的匹配解剖标志点。（B）对齐后的图像示例，显示了两组已识别的细胞：单光子（紫色）和双光子（绿色），叠加在双光子数据的平均图像上。（C）对应（B）中白色方框区域的放大图像，对齐的细胞以重叠的绿色和紫色轮廓表示。所有图中比例尺均为 200 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
结果
已展示在数周时间内，利用单光子和双光子成像方式，在自由活动和头部固定条件下，对同一神经元群体进行慢性多层活体钙成像的方法。此处展示了在动物于黑暗环境中探索开放场地时，通过单光子成像识别匹配神经元群体的能力（图7A）。从已识别的神经元中提取钙信号轨迹，并进行z分数标准化以进行比较（图7B）。在相隔3周的实验记录中，神经元表现出相似水平的荧光强度和放电频率。
图 7：初级视皮层的钙信号动态可在长达3周的多次记录中稳定匹配。 （A）在单光子自由活动钙成像条件下，对同一视野进行三次独立记录所获得的最大投影图像上叠加的已识别神经元的空间滤波结果，记录时间跨度为3周。感兴趣区域（ROIs）的标注顺序与（B）中的呈现顺序一致。第二次（中间）和第三次（右侧）记录中的深色区域是基于第一次（左侧）记录作为参考进行图像配准的结果（比例尺代表0.5 mm）。（B）在（A）中所示的第一（左）、第二（中）和第三（右）次记录中，已配准的感兴趣区域的Z分数化钙信号活动。水平比例尺为10 s，垂直比例尺为10 sd。请点击此处查看该图的放大版本。
接下来，展示了在不同成像模式下对神经元群体进行配准的方法。在同一天内分别进行单光子和双光子成像实验。从单光子数据中识别出感兴趣区域（ROI），并通过人工筛选生成细胞图谱（图8A）。同样地，对双光子数据进行处理以生成细胞图谱，其中细胞被自动识别并经人工选择用于演示。随后，利用MIRA平台将单光子会话的平均投影图像与双光子z轴堆栈的最大投影图像进行对齐（图8B）。该变形后的细胞图谱随后被导出，叠加至双光子最大投影图像上，并与双光子细胞图谱对齐（图8C）。由此实现了在两种成像模式下对同一细胞的活动进行识别（图8D），可用于神经元响应的定量分析。
图 8：不同成像模式下记录的初级视皮层钙动力学。（A）在单光子自由活动记录会话的最大投影图像上叠加的已识别神经元的空间滤波结果。标注的神经元是指成功与（C）中展示的双光子记录数据配准的神经元。（B）（A）中所示的相同轮廓经形变后与（C）中展示的双光子会话数据匹配。（C）将（A）中所示感兴趣区域（ROI）在配准后的空间滤波结果（白色），以及使用双光子处理软件从同日双光子固定头部记录会话中识别出的ROI（绿色），叠加于该双光子会话的最大投影图像上。重叠的ROI被视为已成功配准，并被选作进一步分析（比例尺代表0.5 mm）。（D）已配准ROI在单光子（左）和双光子（右）记录会话中的Z分数化钙信号活动（水平比例尺为10 s，垂直比例尺为10 sd）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在此，我们展示了在同一神经元群体中观察并直接比较固定头部和自由活动条件下神经元活动的能力。尽管我们在此以视觉皮层的应用为例进行演示，但该方案可适用于多种其他脑区，包括皮层区域和深部核团24,25,26,27,28，也可适配于其他数据采集和行为学实验装置29,30。
在本方案中，记录关键步骤非常重要，因为这些步骤有助于获得最佳的数据。首先，在进行z轴扫描时，必须始终保持亮度的一致性。如前所述，光线穿透的组织越深，散射越严重；因此，通过增加增益，激光将具有更强的功率，从而能够更深地穿透组织并激发我们的感兴趣区域（ROIs）。然而，不建议从足以激发深层组织中ROIs的增益开始z轴扫描，因为这会导致皮层表面荧光结构的过度曝光和光毒性，并可能使表面组织发生漂白。因此，选择相对指数梯度选项，可使软件计算出在z轴扫描每一步所需的稳定功率梯度，以实现最佳成像效果。其次，另一个关键步骤是确保在第一次单光子成像会话中保存所采集视频的平均图像，这有助于长期稳定地匹配细胞群。通过该平均图像，操作者可在后续成像会话中与原始图像进行比对，以确保细胞群和数据采集的连续性。
值得注意的是，轻量型微型双光子显微镜已由各方独立设计完成31,32，可在自由活动的动物中实现高分辨率成像。尽管这代表了高分辨率成像领域的一项令人振奋的进展 在体 成像时，受限的视野（FOV）以及高度专业化的设计使得普通终端用户难以应用。我们所描述的方法整合了多个可从商业供应商处 readily 获得的成熟平台，因而具有较高的可及性。理论上，该方法也可替换为与开源微型显微镜和通用双光子显微镜兼容的定制化自组装微棱镜33,34.
尽管如此，该方案仍面临一些挑战，例如微棱镜植入的准确性问题，因为操作误差可能导致无效的视野（FOV），进而影响数据质量。由于不同成像模式采用不同的物镜，因此在多种成像方式之间保持一致的视野也具有挑战性。然而，由于微棱镜的XY轴位置固定，视野的变化主要发生在Z轴方向；因此，可通过两种成像模式中均存在的特定解剖标志（如血管、皮层组织中的伪影以及相同的神经元）来同步视野。此外，至关重要的是需进行图像配准，以对齐并识别不同成像模式下的相同神经元。另一个需要注意的挑战是在两种成像模式的数据采集过程中尽量减少GCaMP组织的光漂白。因此，应尽量缩短记录时间，优化信噪比（通过提高增益而非增加LED/激光功率），并在两次成像会话之间间隔24-48小时。
尽管存在这些固有的复杂性，但只要以手术般的精确性执行本方案，并结合适当的图像处理技术，即可为比较神经活动提供一个可靠的平台。该方案能够比较在严格控制的任务中头部固定状态下的神经活动与更接近自然行为的自由活动状态下的神经活动，从而拓展了其在神经科学领域的潜在应用。
披露
作者声明无竞争性财务利益或利益冲突。
致谢
感谢Charu Reddy女士和Matteo Carandini教授（Cortex实验室）在手术方案方面的建议以及提供转基因小鼠品系。感谢Norbert Hogrefe博士（Inscopix公司）在手术开发过程中提供的指导和帮助。感谢Andreea Aldea女士（Sun实验室）在手术设备搭建和数据处理方面的协助。本工作由Moorfields眼科慈善基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠输注溶液（Vetivex 11）250 ml | 德克拉 | 20091607 | 用于水化和药物配制的生理盐水 |
| 18004-1 骨钻 1.8 mm 直径钻头 | FST | 18004-18 | 钻头 |
| 1毫升注射器 | Terumo | MDSS01SE | 1 ml 注射器 |
| 23G × 5/8 英寸 6% LUER 针头 | Terumo | NN-2316R | 23G针头 |
| 71000 自动化立体定位仪，内置软件 | 真实世界数据 | - | 真实世界数据 |
| 可吸收明胶止血海绵（10x10x10mm） | Surgispon | SSP-101010 | 凝胶-泡沫 |
| 70%异丙醇酒精棉片 | 布劳恩 | 9160612 | 酒精棉片 |
| 铝箔 | 任何零售商 | - | 手术期间用于覆盖眼睛的锡箔 |
| 人工脑脊液 | Tocris Bioscience，Bio-Techne 品牌 | 3525/25ML | ACSF |
| 自动显微注射泵 | WPI | 8091 | |
| 聚维酮碘溶液（10%碘化聚维酮）500 ml | Videne/Ecolab | 3030440 | 聚维酮碘 |
| 布鲁克 Ultima 2Pplus（定制版） | 布鲁克 | - | 双光子成像系统 |
| Cardiff Aldasorber | 兽医技术 | AN006 | 麻醉吸收器 |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | 尼康 | MRH48230 | 20倍物镜 |
| 紧凑型麻醉系统 - 单气体 - 异氟烷 K/F，配氧气浓缩器型号：ZY-5AC 及废气清除装置 | 兽医技术 | AN001 | 紧凑型麻醉系统 |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | 消毒剂（次氯酸） |
| 地塞米松磷酸钠注射液，USP，4 mg/ml，NDC：0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | 地塞米松 |
| 解剖刀，切割刃4mm，厚度0.5mm，不锈钢 | Fine Science Tools | 10055-12 | 用于切开皮层的刀具 |
| 双面无穿刺小鼠模型 &和新生大鼠耳杆 | 斯托尔廷 | 51649 | 耳杆 |
| 假显微镜 | Inscopix | 假显微镜 | 以协助植入 |
| 乙醇（100%） | VWR | 40-1712-25 | 用于配制70%乙醇 |
| Fisherbrand III类个人防护装备 丁腈蓝手套 | FischerScientific | 17182182 | 手套 |
| 恒温监测仪 50-7222-F | 哈佛仪器 | 50-7222-F | 恒温监测系统/加热垫 |
| 图像处理软件 | ImageJ | - | 图像处理软件 |
| Inscopix 数据处理软件（IDPS） | Inscopix | - | 单光子钙成像处理软件 |
| Insight Duals-232，序列号 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | 双光子成像激光器 |
| IsoFlo 250ml 100% w/w 吸入剂 | 硕腾 | WM 42058/4195 | 异氟烷 |
| Kwik-Sil 低毒性硅胶粘合剂 | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | 硅胶粘合剂 |
| MICROMOT 交流电源适配器 NG 2/S，配钻机单元 60/E | PROXXON | NO 28 515 | 手持电钻 |
| nVoke 集成成像与光遗传学系统套装 | Inscopix | - | 单光子成像系统及软件 |
| ProView 植入套件 | Inscopix | ProView 植入套件 | 假体显微镜、立体定位臂及附件 |
| ProView Prism 探针 | Inscopix | 1050-002203 | 微棱镜透镜 |
| Rimadyl（50 mg/ml） | 硕腾 | VM 42058/4123 | 卡洛芬 |
| 带桌夹的关节臂立体定位显微镜 | WPI | PZMTIII-AAC | 显微镜 |
| Super-Bond Universal 试剂盒，SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | 粘接水泥 |
| 双光子钙成像软件 | Suite2P | - | 双光子钙成像处理软件 |
| 蒸发器 | 兽医技术 | - | 异氟烷蒸发器 |
| Xailin 润滑眼膏 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | 眼用软膏 |
参考文献
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