当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。
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摘要
摘要
随着多光子显微镜和分子技术的进步，荧光成像正迅速发展成为研究活体脑组织结构、功能及可塑性的强大手段。与传统的电生理学方法相比，荧光显微镜不仅能捕捉神经元的活动，还能同时记录细胞形态，从而实现对特定神经元群体在单细胞或亚细胞分辨率下的长期记录。然而，高分辨率成像通常需要稳定的头部固定装置，这限制了动物的自由活动；此外，制备平坦的透明玻璃表面虽可实现一个或多个水平层面的神经元可视化，但在研究跨越不同深度的垂直结构时存在局限性。本文介绍一种结合头部固定板与微棱镜的技术，以实现多层、多模态成像。该手术方法不仅能够完整获取小鼠视觉皮层的全层结构，还可支持在头部固定状态下进行双光子成像，以及在自由活动范式下进行单光子成像。利用该方法，可对跨越不同皮层的特定细胞群体进行采样，记录其在头部固定与自由活动状态下的反应，并实现长达数月的长期追踪。因此，该技术为研究神经微环路提供了一种全面的检测手段，能够直接比较由精确控制的刺激所诱发的神经活动与自然行为范式下的神经活动。
引言
技术的出现 体内 双光子荧光成像1,2结合光学系统新技术与基因改造的荧光指示剂，已成为神经科学领域研究活体大脑复杂结构、功能及可塑性的强大技术3,4特别是，这种成像方式相较于传统电生理学具有无与伦比的优势，能够同时捕捉神经元的形态结构和动态活动，从而实现对已识别神经元的长期追踪5,6,7,8.
尽管高分辨率荧光成像具有显著优势，但其应用通常需要静态的、头部固定的实验装置，这限制了动物的活动能力9,10,11。此外，利用透明玻璃表面观察神经元时，仅能对一个或多个水平平面进行成像，从而限制了对跨越不同皮层深度的垂直方向动态过程的探究12。
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方案
所有实验均根据英国《1986年动物（科学程序）法》在个人许可和项目许可下进行，这些许可由英国内政部在经过适当的伦理审查后批准并签发。实验使用了成年转基因品系 CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 及其后代。为确保实验人员的安全并维持无菌条件，所有操作均在无菌条件下进行，并全程穿戴完整的个人防护装备。
1. 术前准备
- 为减轻水肿，术前12-24小时皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）。
- 手术前，将所有外科器械在高压灭菌器中灭菌，并用含蒸馏水的稳定化次氯酸及70%乙醇对外科操作区域进行消毒。确保所有外科设备均已开启。
- 使用异氟烷麻醉动物（24周龄，雄性，体重31 g），诱导剂量为5%，待小鼠固定于立体定位仪后，剂量降至1%–2%，同时供给氧气2 保持在1-2 L/min。皮下注射非甾体抗炎药（卡洛芬，2.5 mg/kg）。
- 通过检查足趾夹捏反射是否存在来评估麻醉深度（若出现反射，则以0.5%为增量增加异氟烷浓度）。
- 剃除动物头部毛发，使用修剪器从耳后至略高于眼睛的区域进行剃毛。用酒精棉片和聚维酮碘溶液清洁该区域，注意避免接触动物的眼睛。
- 将动物固定于恒温加热垫和配备耳杆与门齿夹的立体定位仪上，并固定头部。确保头部稳定，这对后续操作的成功至关....
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结果
已展示在数周时间内，利用单光子和双光子成像方式，在自由活动和头部固定条件下，对同一神经元群体进行慢性多层活体钙成像的方法。此处展示了在动物于黑暗环境中探索开放场地时，通过单光子成像识别匹配神经元群体的能力（图7A）。从已识别的神经元中提取钙信号轨迹，并进行z分数标准化以进行比较（图7B）。在相隔3周的实验记录中，神经元表现出相似水平的荧光强度和放电频率。
图 7：初级视皮层的钙.......
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讨论
在此，我们展示了在同一神经元群体中观察并直接比较固定头部和自由活动条件下神经元活动的能力。尽管我们在此以视觉皮层的应用为例进行演示，但该方案可适用于多种其他脑区，包括皮层区域和深部核团24,25,26,27,28，也可适配于其他数据采集和行为学实验装置29,30。
在本方案中，记录关键步骤非常重要，因为这些步骤有助于获得最佳的数据。首先，在进行z轴扫描时，必须始终保持亮度的一致性。如前所述，光线穿透的组织越深，散射越严重；因此，通过增加增益，激光将具有更强的功率，从而能够更深地穿透组织并激发我们的感兴趣区域（ROIs）。然而，不建议从足以激发深.......
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披露
作者声明无竞争性财务利益或利益冲突。
致谢
感谢Charu Reddy女士和Matteo Carandini教授（Cortex实验室）在手术方案方面的建议以及提供转基因小鼠品系。感谢Norbert Hogrefe博士（Inscopix公司）在手术开发过程中提供的指导和帮助。感谢Andreea Aldea女士（Sun实验室）在手术设备搭建和数据处理方面的协助。本工作由Moorfields眼科慈善基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠输注溶液（Vetivex 11）250 ml | 德克拉 | 20091607 | 用于水化和药物配制的生理盐水 |
| 18004-1 骨钻 1.8 mm 直径钻头 | FST | 18004-18 | 钻头 |
| 1毫升注射器 | Terumo | MDSS01SE | 1 ml 注射器 |
| 23G × 5/8 英寸 6% LUER 针头 | Terumo | NN-2316R | 23G针头 |
| 71000 自动化立体定位仪，内置软件 | 真实世界数据 | - | 真实世界数据 |
| 可吸收明胶止血海绵（10x10x10mm） | Surgispon | SSP-101010 | 凝胶-泡沫 |
| 70%异丙醇酒精棉片 | 布劳恩 | 9160612 | 酒精棉片 |
| 铝箔 | 任何零售商 | - | 手术期间用于覆盖眼睛的锡箔 |
| 人工脑脊液 | Tocris Bioscience，Bio-Techne 品牌 | 3525/25ML | ACSF |
| 自动显微注射泵 | WPI | 8091 | |
| 聚维酮碘溶液（10%碘化聚维酮）500 ml | Videne/Ecolab | 3030440 | 聚维酮碘 |
| 布鲁克 Ultima 2Pplus（定制版） | 布鲁克 | - | 双光子成像系统 |
| Cardiff Aldasorber | 兽医技术 | AN006 | 麻醉吸收器 |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | 尼康 | MRH48230 | 20倍物镜 |
| 紧凑型麻醉系统 - 单气体 - 异氟烷 K/F，配氧气浓缩器型号：ZY-5AC 及废气清除装置 | 兽医技术 | AN001 | 紧凑型麻醉系统 |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | 消毒剂（次氯酸） |
| 地塞米松磷酸钠注射液，USP，4 mg/ml，NDC：0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | 地塞米松 |
| 解剖刀，切割刃4mm，厚度0.5mm，不锈钢 | Fine Science Tools | 10055-12 | 用于切开皮层的刀具 |
| 双面无穿刺小鼠模型 &和新生大鼠耳杆 | 斯托尔廷 | 51649 | 耳杆 |
| 假显微镜 | Inscopix | 假显微镜 | 以协助植入 |
| 乙醇（100%） | VWR | 40-1712-25 | 用于配制70%乙醇 |
| Fisherbrand III类个人防护装备 丁腈蓝手套 | FischerScientific | 17182182 | 手套 |
| 恒温监测仪 50-7222-F | 哈佛仪器 | 50-7222-F | 恒温监测系统/加热垫 |
| 图像处理软件 | ImageJ | - | 图像处理软件 |
| Inscopix 数据处理软件（IDPS） | Inscopix | - | 单光子钙成像处理软件 |
| Insight Duals-232，序列号 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | 双光子成像激光器 |
| IsoFlo 250ml 100% w/w 吸入剂 | 硕腾 | WM 42058/4195 | 异氟烷 |
| Kwik-Sil 低毒性硅胶粘合剂 | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | 硅胶粘合剂 |
| MICROMOT 交流电源适配器 NG 2/S，配钻机单元 60/E | PROXXON | NO 28 515 | 手持电钻 |
| nVoke 集成成像与光遗传学系统套装 | Inscopix | - | 单光子成像系统及软件 |
| ProView 植入套件 | Inscopix | ProView 植入套件 | 假体显微镜、立体定位臂及附件 |
| ProView Prism 探针 | Inscopix | 1050-002203 | 微棱镜透镜 |
| Rimadyl（50 mg/ml） | 硕腾 | VM 42058/4123 | 卡洛芬 |
| 带桌夹的关节臂立体定位显微镜 | WPI | PZMTIII-AAC | 显微镜 |
| Super-Bond Universal 试剂盒，SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | 粘接水泥 |
| 双光子钙成像软件 | Suite2P | - | 双光子钙成像处理软件 |
| 蒸发器 | 兽医技术 | - | 异氟烷蒸发器 |
| Xailin 润滑眼膏 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | 眼用软膏 |
参考文献
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).....
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