小鼠心肌缺血再灌注后冠状动脉血流储备的动态评估

摘要

本方案描述了一种改良的胸骨旁长轴切面，用于快速、精确地定位小鼠左前降支动脉。该方法设计更为简便、易于操作，有助于检测心肌缺血-再灌注后冠状动脉血流储备的动态变化。

摘要

心肌缺血后，即使上游动脉的血流已成功且完全恢复，心肌灌注仍常不充分。这种现象被称为“无复流现象”，归因于冠状动脉微血管功能障碍，并与不良临床预后相关。在临床实践中，冠状动脉血流储备（CFR）的降低常被用作冠状动脉疾病的指征。CFR 定义为药物或代谢因素诱导下的峰值血流速度与静息血流速度的比值。

本方案重点在于利用脉冲波多普勒测量，评估缺血-再灌注（IR）前后冠状动脉血流储备（CFR）的动态变化。本研究中，正常小鼠在异氟烷刺激下，其冠状动脉血流峰值流速可升高至静息状态下的两倍。然而，在缺血-再灌注后1小时，CFR较术前基线水平显著下降。随着时间推移，CFR呈现逐渐恢复趋势，但仍低于正常水平。尽管收缩功能得以保留，早期发现微血管功能障碍仍至关重要，建立实用的操作指南将有助于医生完成此项任务，同时推动对心血管疾病随时间进展的研究。

引言

冠心病是全球主要的死亡原因之一¹。即使在心肌缺血后通过直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）成功开通了罪犯冠状动脉，冠状动脉微血管的灌注往往仍然不足。此外，供应心肌的远端毛细血管也不一定能实现再灌注¹。这种现象被称为“无复流现象”，与疾病的临床进展和不良预后密切相关。因此，在成功再灌注治疗后实现充分的微血管血流恢复，对心肌挽救至关重要。因此，血管重建术后早期评估微血管功能对临床实践具有重要意义。

多种技术可用于评估微血管功能，例如有创的冠状动脉内温度/压力导丝测量微循环阻力指数（IMR）和充血性微血管阻力（HMR），以及无创的心血管磁共振成像（CMR）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）²。然而，这些方法要么具有侵入性或半侵入性，要么成本高昂，且通常难以广泛获取，限制了其在临床中的应用。相比之下，经胸多普勒超声心动图评估冠状动脉血流储备（CFR）则提供了一种无创、相对简便且经济有效的方法，且不会像其他方法那样使患者暴露于电离辐射³。

尽管以往的研究已采用经胸多普勒超声心动图来测量小鼠和大鼠的冠状动脉血流储备（CFR），但操作者在定位平台、动物与探头之间复杂角度时仍面临挑战。本方案通过改良的胸骨旁长轴（PLAX）切面，提供了一种更简便的方法来快速定位前降支冠状动脉（LAD）并测量CFR，从而克服了这一难题。

此外，梗死相关动脉（IRA）罪犯病变远端测得的冠状动脉血流储备（CFR）与心肌对比超声心动图（MCE）评估的灌注状态显示出强相关性⁴。CFR还被确定为急性心肌梗死（AMI）后心肌存活性及左心室（LV）功能恢复的预测指标⁵。此外，CFR已被确立为全因死亡率和不良心血管事件的可靠标志物^6,7。既往研究报道了利用超声心动图评估心肌梗死大鼠模型中CFR的应用⁸。然而，缺血-再灌注早期阶段的CFR尚未得到充分研究。因此，本研究通过在再灌注早期对缺血-再灌注（IR）小鼠进行动态检测，为诊断微血管功能障碍及评估缺血-再灌注治疗效果提供了参考值。

方案

所有实验均经北京大学动物护理与使用委员会批准。本研究使用8至12周龄的雄性C57小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 动物准备

1. 使用脱毛膏去除胸前区的毛发（参见材料表）。然后，按照步骤2继续获取超声图像。

2. 介入放射学手术前的超声成像

1. 将小鼠放入异氟烷诱导室中进行麻醉（参见 材料表）并以1.5%浓度、1.5–2.0 L/min氧气流速开始异氟烷给药₂ 流
2. 将麻醉后的小鼠仰卧位放置于生理监测平台（超声系统成像平台，参见 材料表在生理监测台的铜片上涂抹少量导电凝胶，并使用低黏性胶带固定小鼠的足掌。 通过其获取心电图和呼吸的生理信息。使用内置加热平台将体温维持在37-38 °C。
   注意：将气体麻醉机的控制开关从麻醉舱切换至面罩，并在此期间保持麻醉剂量恒定在1.5%。此时小鼠的心率应约为350–450次/分钟。
3. 成像前在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。
4. 使用40 MHz线性探头进行经胸超声心动图检查⁹ （例如，用于小鼠的MS550探针）图1A).
   注意：超声设备配备有 MS550 探头。
5. 大量涂抹超声传导凝胶（参见 材料表以确保最佳的图像质量。
6. 调整探头和平台的位置，以形成改良的胸骨旁长轴（PLAX）切面⁹ (图1A）以B模式检查左前降支动脉（LAD）。简要而言，采用胸骨旁长轴切面成像，将平台侧向对齐，并使探头与平台之间呈小角度放置。
7. 在B模式下找到合适的心脏切面并激活 彩色多普勒 在触摸屏上（图1B）。左前降支（白色箭头）可在左心室壁内辨认图1B实时红色表示血流方向（即血流朝向探头）。
   注意：通过调整x轴，彩色多普勒可在该图像窗口内显示左前降支（LAD）的完整路径（从主动脉窦至远端分支部位）。
8. 轻微移动探头以找到合适位置，减少肺静脉血流的影响。
   注意：为了减少肺静脉血流的影响，需轻微调整探头，以区分左前降支（LAD）与肺静脉。左前降支走行于左心室壁内，而肺静脉则回流至左心房。使用彩色多普勒定位左前降支，并采用B型超声选择合适的切面。
9. 在彩色多普勒模式下观察到左前降支后，按下 脉搏波（PW） 按钮并切换至PW模式。将黄色指示线置于冠状动脉上，确保其与血流方向平行，然后按下 保存视频片段 记录基线数据的按钮。
10. 将异氟烷浓度增加至3%，并等待30秒。确保流速随时间逐渐增加。按下 保存视频片段 频繁按下按钮以捕捉最高血流速度。
    注意：异氟烷刺激会导致心脏负荷增加，可能引起心脏和前降支（LAD）的移动。一旦在脉冲多普勒（PW-mode）模式下获取图像或完成动态图像存储，点击 PW模式 确保黄色指示线位于LAD上。若发生移位，需将黄色指示线轻微调整至血流位置，并继续记录。此过程需要快速掌握和切换。
11. 采集冠状动脉血流图像后，关闭麻醉气体，将探头调整至标准左心室长轴切面（PLAX）。待小鼠心率逐渐回升至约500次/分钟时，将探头切换至胸骨旁短轴切面（PSAX），测量小鼠心脏功能。
12. 完成超声心动图成像后，将动物从平台上移除，并置于其饲养笼中使其恢复。 移除凝胶并让动物自然干燥，以防止低体温。
13. 使用 峰值速度 和 左心室功能 用于分别从图像中获取舒张期峰值速度和心脏收缩功能的工具。
14. 将 CFR 计算为最大血流时舒张期峰值冠状动脉血流速度（CFV）与基线时舒张期峰值 CFV 的比值。

3. 心肌缺血-再灌注操作

注意：初次 测量为基线值，随后在同一动物上进行手术。

1. 用戊巴比妥钠（60 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并皮下注射镇痛剂卡洛芬（5 mg/kg）。手术过程中使用预热的加热垫（37 °C）维持体温。通过脚趾夹捏无回缩反射及无眨眼反射来确认麻醉深度。将小鼠仰卧于加热垫上并固定 使用眼膏涂抹眼睛，以防止其干燥。进行气管插管以实施机械通气：在去除颈部毛发前后，使用聚维酮碘或氯己定与70%酒精交替擦拭三次，对操作区域进行消毒。 找到气管并轻轻插入导管。然后将小鼠连接至呼吸机（吸气潮气量为 250 µL，呼吸频率为 120 次/分钟）（参见 材料表).
2. 用聚维酮碘或氯己定与70%酒精交替擦拭三次，对心前区皮肤进行消毒。通过行左胸廓切开术暴露心脏。¹⁰ 在第四肋间隙。
3. 用5-0丝线通过滑结结扎前降支左冠状动脉（LAD）（参见 材料表），在左心耳根部下方插入1-2 mm处进针，确保缝合方向与左心耳下缘平行。在所有小鼠中目视确认缺血情况 通过 缺血心肌局部颜色变暗。
4. 结扎LAD动脉30分钟¹¹30分钟后，松开结扎线，观察心肌先前变色区域在1-2分钟内是否出现变红，以确认再灌注成功。
5. 冠状动脉结扎/再灌注后，逐层缝合胸腔，让小鼠恢复约半小时¹¹.

4. 红外手术后的超声成像

1. 分别在再灌注后1 h、3 h、5 h、8 h、24 h和48 h，按照第2节所述步骤再次测量冠状动脉血流储备（CFR），并将这些测量值与缺血-再灌注（IR）操作前获得的CFR值进行比较。

5. 统计分析

1. 使用适当的统计分析软件进行统计分析（参见材料表）。
   注意：对于配对样本间连续变量的比较，若数据呈正态分布，请采用配对t检验；若数据非正态分布或不满足正态性假设，则使用Friedman's ANOVA。将p < 0.05视为具有统计学意义。

结果

本研究采用雄性C57小鼠（体重约18–20 g）来表征冠状动脉血流储备（CFR）的动态变化。通过改良的胸骨旁长轴（PLAX）切面图像评估左前降支冠状动脉（LAD）的血流特征（图1A、B）。CFR定义为吸入3%异氟烷诱导最大血管扩张时的最大血流速度与基础状态下1.5%异氟烷浓度时的最大血流速度之比^12,13。所有测量和计算均在连续三个心动周期内重复进行并取平均值，代表性结果见图2。

在IR手术前，测量了基础CFR，小鼠的CFR值正常，约为2.14 ± 0.43。然而，IR手术后，在再灌注1小时时CFR较手术前显著降低（1.18 ± 0.14） 与. 2.14 ± 0.43) (图3A）。这一降低表明，即使在开通罪犯血管后，微循环也未立即恢复。随着再灌注时间的延长，冠状动脉血流储备（CFR）值持续处于较低水平，再灌注后3小时为1.21 ± 0.20，5小时为1.39 ± 0.33，8小时为1.44 ± 0.38，24小时为1.34 ± 0.36，48小时为1.48 ± 0.47，提示低灌注状态可能持续至少两天。图3A此外，在1 h、3 h、5 h、8 h、24 h和48 h时点的CFR值之间均无统计学差异。

还对小鼠的心脏功能进行了监测，观察到当小鼠的冠状动脉血流储备（CFR）显著降低时，左心室心脏功能未出现显著变化（图3B）。

图1：改良胸骨旁长轴切面。 （A）示获取前降支冠状动脉（LAD）血流速度时探头与平台的放置位置。（B）示脉冲波速度传感器在LAD冠状动脉上的放置位置。蓝色表示血流方向远离超声探头，橙色表示血流方向朝向超声探头。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：左前降支脉搏波速度成像的可视化与记录。 （A）左前降支冠状动脉在静息状态下的脉搏波图像。（B）左前降支冠状动脉在最大充血状态下的脉搏波图像。蓝色表示远离超声探头的运动，橙色表示朝向超声探头的运动。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：冠状动脉血流储备与射血分数的测定。（A）动物在缺血前以及再灌注后1 h、3 h、5 h、8 h、24 h和48 h时冠状动脉血流储备（CFR）的统计分析（n = 9）。（B）各组在各时间点射血分数的评估（n = 9）。*p < 0.05；数据以均值 ± 标准差表示，采用配对t检验和Friedman方差分析进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究提出了一种利用改良胸骨旁长轴切面动态评估缺血-再灌注后冠状动脉血流储备（CFR）的方案。主要研究结果表明，IR小鼠的CFR显著降低，其中以再灌注后1小时的下降最为明显。然而，在48小时内，心脏功能未受到影响。

冠状动脉血流储备（CFR）是心肌血液供应的指标，提供了一种无创评估冠状动脉狭窄和冠状动脉微血管循环的方法。临床研究表明，CFR值越低，预后越差^14,15,16，且已确定1.75为用于风险分层的最佳CFR截断值¹⁴。最近的一项荟萃分析进一步显示，CFR每降低0.1个单位，死亡风险增加16%，表明CFR代表了一个连续的风险谱，较低的CFR水平使患者更易出现不良临床结局¹⁷。本研究中，CFR随再灌注时间延长呈上升趋势，但仍低于术前水平，强调了不仅在经皮冠状动脉介入治疗（PCI）开通罪犯血管后即刻，而且在术后48小时持续监测患者的重要性。此外，CFR可作为冠状动脉微血管功能障碍的评估指标，综合反映局灶性、弥漫性及小血管病变对心肌组织灌注的血流动力学影响¹⁸。因此，CFR是诊断冠状动脉微血管疾病的重要无创技术。由于左前降支（LAD）的CFR是死亡率的强效且独立的预测指标^6,7，本研究旨在为临床决策提供参考值。此外，在医疗成本控制环境下，使用超声设备有望减少对冠状动脉造影的需求。通过适当的培训和技术升级，可实现针对个体患者需求的精准风险分层。

改良的胸骨旁长轴切面（PLAX）为科研人员提供了更大的便利性并节省了时间。该技术的持续改进将有助于其在其他冠状动脉微血管疾病中的更广泛应用。本方案的关键步骤包括显示冠状动脉以及获取高质量的脉冲多普勒（PW）血流速度图像。血流速度随麻醉浓度的增加而逐渐升高，因此建议持续采集数据，以避免遗漏最大血流速度。由于麻醉浓度的增加可能改变心率，建议在测量过程中短暂返回彩色多普勒模式，以确保测量前后定位的一致性。

必须认识到本研究存在局限性，包括冠状动脉血流储备（CFR）超声测量本身固有的局限性。由于冠状动脉存在弯曲，无法完全显示整条动脉，因此只能对其中一段进行测量。操作者应尽量测量冠状动脉起始段，以尽可能准确地确定冠状动脉血流速度的最大值点。此外，理想情况下CFR应基于冠状动脉血流量的变化来确定，但本研究使用的是血流速度而非血流量，因而忽略了血管直径的影响。然而，既往研究已证实CFR与冠状动脉血流速度储备（CFVR）之间存在高度相关性¹⁹。未来对冠状动脉微血管功能的进一步研究，可能有助于阐明缺血过程中复杂的改变，并加深我们对冠状动脉微血管功能障碍的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 丝线缝合线	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	210322
C57 小鼠	北京大学医学部实验动物科学系
脱毛剂	Nair	NAR-255-1
电极凝胶	Cofoe
高频超声仪	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo3100
异氟烷	REWARD	R510-22-10
线阵高频换能器	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550
啮齿类动物呼吸机	上海奥尔科特生物科技有限公司	ALC-V9
小动物麻醉机	REWARD	R530
SPSS	IBM Corp, Armonk, NY, USA	version 23.0	统计分析软件
超声耦合凝胶	Cofoe
Vevo Lab 软件	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		版本 5.7.0