有效的喂养与 离体 一种孵育型石珊瑚的培养 Pocillopora acuta

摘要

气候变化正在全球范围内影响珊瑚礁生态系统。来自 离体 水产养殖系统有助于支持生态恢复与科研工作。本文介绍了可用于促进内育型石珊瑚长期养护的投喂与珊瑚培养技术 离体 已概述。

摘要

气候变化正在影响全球珊瑚的存活、生长和补充，预计在接下来的几十年中，珊瑚礁生态系统将出现大规模的丰度变化和群落组成转变。认识到珊瑚礁退化问题后，已催生了一系列基于研究和恢复的新型主动干预措施。ex situ（异地）养殖可通过建立稳健的珊瑚培养方案（例如，提高长期实验中的健康状况和繁殖能力）以及提供稳定的亲本种群供应（例如，用于恢复项目）发挥支持作用。本文以常见且研究充分的珊瑚Pocillopora acuta为例，概述了对内胚层孵化型石珊瑚进行投喂和ex situ养殖的简单技术。为展示该方法，将珊瑚群体暴露于不同温度（24 °C 与 28 °C）和投喂处理（投喂 vs. 不投喂）条件下，比较其繁殖产出与繁殖时间，以及在两种温度下投喂卤虫（Artemia）无节幼体的可行性。不同珊瑚群体间的繁殖产出表现出高度变异性，且在不同温度处理组中呈现不同的趋势：在24 °C条件下，投喂组产生的幼体多于未投喂组；但在28 °C培养的群体中则呈现相反结果。所有群体均在满月前完成繁殖，仅在28 °C未投喂组与24 °C投喂组之间观察到繁殖时间的显著差异（平均繁殖月相日数 ± 标准差：分别为6.5 ± 2.5 和 11.1 ± 2.6）。在两种处理温度下，珊瑚群体均能高效摄食Artemia无节幼体。这些提出的投喂与培养技术注重以低成本、可定制的方式减少珊瑚应激并促进其繁殖寿命延长，适用于流水式和循环式水产养殖系统，具有广泛的适用性。

引言

全球许多珊瑚礁生态系统正因气候变化引发的高温胁迫而不断丧失和退化^1,2珊瑚白化（即珊瑚与藻类共生关系的瓦解）³过去被认为相对罕见⁴ 但目前发生频率越来越高⁵，预计许多地区将每年发生白化现象 世纪中后期^6,7这种白化事件之间间隔期的缩短可能会限制珊瑚礁恢复力的提升⁸高温胁迫对珊瑚群体的直接影响（如组织损伤）⁹；能量耗竭¹⁰与珊瑚礁尺度上的间接影响密切相关，其中繁殖和补充能力的下降尤为令人关注¹¹。这推动了一系列应用研究，例如对活性成分的探索 原位 增强招募（例如，珊瑚礁播种）¹²），用于扩大珊瑚修复规模的新技术¹³，以及模拟生殖信号以诱导繁殖 离体 系统¹⁴与这些主动干预措施相辅相成的是，近年来人们逐渐认识到，在高温胁迫条件下，异养摄食对珊瑚具有优势¹⁵ 以及探索食物供给可能在繁殖中所起的作用¹⁶.

异养摄食已知会影响珊瑚的表现¹⁷，并被明确与珊瑚生长加快^18,19以及耐热性和恢复力增强^20,21相关联。然而，异养摄食的益处并非在所有珊瑚物种中普遍存在²²，其效果可能因所摄取食物的类型²³以及光照强度的不同而有所差异²⁴。在珊瑚繁殖方面，异养摄食的影响结果不一，已有研究报道异养摄食后繁殖能力升高²⁵和降低²⁶的现象。异养摄食在不同温度梯度下对珊瑚繁殖的影响极少被评估，但在温带珊瑚Cladocora caespitosa中发现，较低温度条件下异养摄食对繁殖更为重要²⁷。要判断特定珊瑚礁（例如与高食物可利用性相关的珊瑚礁²⁸）是否在气候变化下具有更强的补充能力，可能需要更深入地理解温度和摄食对繁殖产出的作用。

与繁殖产出类似，温度和摄食对珊瑚繁殖时间的影响仍相对缺乏研究，尽管在海洋变暖背景下，繁殖与非生物/生物条件的同步性对于补充成功率而言是一个重要的考量因素²⁹. 实验室中进行的珊瑚热适应研究表明，较高的温度会导致珊瑚更早地进行繁殖³⁰，这一现象也在从自然珊瑚礁在不同季节采集的珊瑚样本中被观察到³¹然而，有趣的是，最近在为期1年的饲养珊瑚培养实验中观察到了相反的趋势 离体 流通式系统（即在较冷的冬季温度下，繁殖发生在月相周期的较早阶段，而在较暖的夏季温度下，繁殖发生在月相周期的较晚阶段）³²这一对比结果表明，在能量资源丰富的条件下，生殖时机可能会偏离典型模式。

在不同温度情景下开展长期受控实验，有助于深入理解异养作用对石珊瑚繁殖的影响。维持珊瑚群体在繁殖期间的培养条件 离体 多次繁殖周期的条件可能具有挑战性（但参见先前研究）^32,33）。本文介绍了用于主动摄食（食物来源： 卤虫 无节幼体）以及一种孵育型珊瑚的长期培养Pocillopora acuta在流水式水产养殖系统中描述了这些技术；但应注意，所描述的所有技术也可用于循环水产养殖系统。为展示这些技术，对在24 °C和28 °C条件下养殖的珊瑚群体的繁殖产出和繁殖时间进行了初步比较 "喂养" 和 "未进食的" 处理在选定的温度下进行，这些温度分别用于近似中国台湾南部冬季和夏季的海水温度^30,34；未选择更高温度，因为会促进长期 离体 培养珊瑚而非测试其对热应激的反应是本实验的主要目标。此外，珊瑚密度的 卤虫 摄食前后无节幼体的数量被量化 比较两种温度处理下异养摄食的可行性。

具体而言，24个菌落 P. acuta （平均总线性延伸长度 ± 标准差：21.3 cm ± 2.8 cm）来自国家海洋生物博物馆研究设施的流水式水箱 & 中国台湾南部水族馆 Pocillopora acuta 是一种常见的珊瑚物种，具有广布性产卵特征，但 典型的育雏型繁殖策略^35,36这些珊瑚的亲本群体最初于约2年前从Outlet礁（21.931°E，120.745°N）采集，用于另一项实验。³²因此，本实验所用的珊瑚群体在其整个生命周期中均在以下条件下培育 离体 培养条件；具体而言，将菌落置于室温环境及光暗循环为12小时光照：12小时黑暗、光照强度为250 µmol quanta m⁻²s⁻¹的条件下培养⁻²·s⁻¹ 并被喂食 卤虫 每周两次投放无节幼体。我们认识到，这种长期 离体 培养条件可能影响了珊瑚群体对本实验中处理条件的响应。因此，我们希望强调，本研究的主要目的是展示所描述的技术如何被有效用于珊瑚的培养 离体 通过一个应用实例，评估了温度和摄食对珊瑚繁殖的影响。

珊瑚群体均匀分布于六个流水式培养系统水箱中（水箱内部尺寸：长 × 宽 × 高 = 175 cm × 62 cm × 72 cm；水箱光照条件：12小时光照:12小时黑暗循环，光照强度为250 µmol quanta m⁻²·s⁻¹）（图1A）。其中三个水箱的温度设定为28 °C，另外三个水箱的温度设定为24 °C；每个水箱均配备记录仪，每10分钟记录一次温度（见材料表）。各水箱的温度通过冷水机和加热器独立控制，并使用循环泵维持水体流动（见材料表）。每个水箱中一半的珊瑚群体（n = 2 个群体/水箱）每周喂食两次卤虫（Artemia）无节幼体，其余群体则不喂食。每次喂食持续4小时，在两个独立的、温度特定的喂食水箱中进行。喂食期间，所有珊瑚群体（包括未喂食组）均被转移至喂食水箱，以标准化因转移操作可能带来的应激影响。在温度特定的喂食水箱内，通过带网隔框将喂食组与未喂食组的珊瑚群体分隔开，确保仅喂食组群体获得食物。每天上午09:00通过统计前一晚释放到幼体收集容器中的幼虫数量，评估每个珊瑚群体的繁殖产出量及繁殖时间。

方案

1. 悬挂的珊瑚菌落在 离体 水产养殖池

1. 放置一个带缺口的条形物（长 × 宽 × 高：75 cm × 1 cm × 3 cm），下文简称 "横杆"，横跨培养槽，为悬挂珊瑚群体做准备。
   注意：本实验中使用的悬挂杆为定制，但只要能够稳定地架设在培养箱顶部，并能牢固支撑珊瑚，使用带有外露螺丝的普通PVC管（即起到凹槽作用）即可满足要求。
2. 测量一段鱼线（参见 材料表）至约1.5米长，然后对折两次。
   注意：鱼线的初始长度应根据珊瑚群体在培养箱中期望的最终位置来选择。
3. 在鱼线折叠端（即鱼线初始末端的一侧）打一个小的单结。
   注意：打结后，底部应有两个大环，顶部有一个小环。
4. 将珊瑚群体置于两个大环的中央，使环体位于群体周围，当悬挂于水中时能够牢固地固定住珊瑚。
5. 将鱼线的小上端环扣钩入悬挂杆上的凹槽中（图 1B).

2. 珊瑚喂养

1. 制作喂食容器
   1. 使用亚克力管构建一个矩形框架（长 × 宽 × 高：25 cm × 60 cm × 25 cm）。在框架内设置两个独立的隔间，分别用于放置已投喂和未投喂的珊瑚。图1C).
      注意：选用丙烯酸管是因为其质量轻（相对于较重的PVC管），因此更便于将喂食容器移入或移出培养罐。
   2. 使用热熔胶枪将100 µm的浮游生物网附着在框架的底部和侧面。
   3. 在管道上（尤其是沿框架的侧面和底部）总共钻约10个直径为0.5 cm的小孔，以防止饲喂容器放入培养罐时上浮。
   4. 在喂食容器的每个角落，通过浮游生物网钻孔（直径约0.5 cm）。
   5. 将一段长8 cm、直径0.5 cm的软管穿过角落的孔，并使用热熔胶枪将其固定到位。
      注意：这些管段将在喂食期间连接至气泵和曝气石（详见步骤 2.3.2）。
2. 卤虫 培养
   1. 从一个独立的喂养水箱中采集 2 L 海水，并将海水倒入一个 卤虫 孵化容器（图1D).
      注意：在本实验中，为演示该实验方案，使用了两个独立的处理专用饲喂罐，因此需要准备两个孵化容器。 卤虫 培养
   2. 将气泵连接到与孵化容器底部相连的管路，在加入之前预先通气约10分钟 卤虫 囊肿。
   3. 等待期间，使用天平称量 8 g 的 卤虫 囊肿（参见 材料表).
      注意：为了获得平均每单位面积35个个体的密度 卤虫 如Huang等人所建议的，每毫升无节幼体数（nauplii/mL）¹⁹，使用4 g的 卤虫 将囊肿加入1升海水中。
   4. 10分钟后，倒入8 g的 卤虫 将囊肿放入孵化容器中。
   5. 孵育 卤虫 囊肿培养48小时。
3. 准备饲喂容器
   1. 将喂食容器放入喂食槽中，使容器顶部高于水面。
   2. 将喂食容器角落管的外端连接至气泵，气泵将为气石供气，以在喂食期间促进水体循环。
   3. 在开始喂食前约5分钟打开气泵。
4. 卤虫 无节幼体的富集与收集
   1. 加入1.5 mL增菌培养基（参见该 材料表在预定投喂时间前2小时将）加入孵化容器中。
      注意：Huang 等人建议，富集饲料与海水的添加比例为 0.75 mL∶1 L。¹⁹.
   2. 2小时后，关闭向孵化容器供气的阀门。
   3. 用纸箱盖住孵化容器以隔绝环境光，并在孵化容器底部放置光源（手机闪光灯即可）照射5分钟，以吸引 卤虫 无节幼体沉降至容器底部，从而便于分离活体 卤虫 从空壳中分离的无节幼体
   4. 5分钟后，移除盒子和光源。
   5. 在孵化容器下方放置一个3 L的量筒。
   6. 将管路从孵化容器上拆下，以使 卤虫 将无节幼体和海水溶液引入量杯中；收集1升该溶液 卤虫 无节幼体和海水溶液
      注意：仅收集孵化容器中一半体积的样品，以去除不需要的空壳。
   7. 靠近饲喂箱站立时，倒入 卤虫 通过100 µm筛网过滤无节幼体和海水溶液，以分离 卤虫 无节幼体（将留在过滤筛中）与海水分离。
   8. 冲洗 卤虫 用饲喂罐中的水将筛网中的无节幼体冲洗两次。
   9. 的 卤虫 无节幼体现已可使用。
5. 喂养珊瑚群体
   1. 卸载 卤虫 将2.4.8步骤中的滤网放入饲喂罐中，以投放无节幼体。
   2. 用手搅拌水箱中的水，以均匀分布 卤虫 无节幼体
      注意：收集样本用于后续分析 "预饲喂" 定量分析 卤虫 此步骤后的无节幼体密度（详见步骤 3.1）。
   3. 将每个悬挂杆（珊瑚群体仍悬挂在杆上）从培养箱移至喂养箱，并将杆放置在喂养箱顶部，确保其稳固。珊瑚暴露在空气中的时间应尽可能缩短。
      注意：确保菌落之间不相互接触，并留有足够空间以获取食物（例如，间距约 5 cm）。
   4. 关闭饲喂罐的灯光，或使用非密封盖子覆盖饲喂罐，以避免饲喂过程中光照干扰。
   5. 让菌落不受干扰地培养 4 h。
   6. 4小时后，收集样品用于后续分析 "餐后" 定量分析 卤虫 无节幼体密度（详见步骤 3.1）。
6. 喂食后清理
   1. 喂食结束后，移除珊瑚群体。将悬挂杆逐一从喂食槽中取出，并用各自培养槽中的海水彻底冲洗每株珊瑚，以去除残留物 卤虫 无节幼体
      注意：应在稳定的表面上冲洗珊瑚群落，而不是悬空冲洗，以减少因群落在冲洗过程中来回摆动而可能造成的损伤。与初次转移时相同，应尽可能缩短珊瑚暴露在空气中的时间。
   2. 将悬挂杆（带有珊瑚）放回培养缸中。
   3. 断开连接饲喂容器与空气泵的管路，并将饲喂容器从饲喂罐中取出。
   4. 用清水彻底冲洗饲喂容器，以去除所有残留物 卤虫 无节幼体

3. 定量分析 卤虫 摄食前后无节幼体密度

1. 收集样品
   1. 在两个时间点采集样本：第一次，在 的 卤虫 无节幼体已在投喂容器中卸下并均匀分布（步骤2.5.2），并在投喂结束后再次进行检查（步骤2.5.6）。
   2. 每个时间点分别使用三支注射器从饲喂容器的表层、中层和底层各吸取20 mL水样。
2. 样品稀释
   1. 每个注射器中的20 mL水样转移至独立的500 mL烧杯中。
   2. 向烧杯中加入180 mL热水（约60 °C）（1:10稀释）。
      注意：热水用于固定 卤虫 无节幼体以提高计数的准确性。
   3. 将烧杯中的水样各取 2 mL 加入 9 孔板的每个孔中。
      注意：在烧杯中混合样品以使其均匀分布 卤虫 在吸取2 mL样品前，将无节幼体均匀分散于水体中。
   4. 计数数量 卤虫 在体视显微镜下以6.5倍放大倍数观察每个孔中的无节幼体（参见 材料表).
3. 计算密度 卤虫 无节幼体
   1. 将数量除以 卤虫 每孔卤虫幼体数量乘以2以获得总数 卤虫 每毫升无节幼体数。然后将该数值乘以10（以校正稀释倍数）来计算 卤虫 无节幼体密度
   2. 计算平均密度 卤虫 无节幼体（即饲喂前后27个孔重复的平均密度）以进行比较 卤虫 前后喂食期间无节幼体密度

4. 珊瑚幼虫采集

1. 制作幼虫收集容器（图1E）
   1. 选择一个6 L的塑料水瓶，将瓶底完全切除。
      注意：此开口将用于将珊瑚群体移入和移出幼虫收集容器。
   2. 在瓶子的两侧各切出一个约15 cm × 20 cm的矩形窗口。
      注意：6 L塑料水瓶适用于直径约15 cm的珊瑚；可根据所研究珊瑚的大小调整瓶子尺寸。
   3. 先使用热熔胶枪，再用环氧树脂将100 µm的浮游生物网固定在每个窗口上。
   4. 在瓶底两侧各钻两个小孔（直径约0.5 cm）。
   5. 将一根绳子穿过两个小孔，并将两端打结，形成一个把手，用于将幼虫收集容器挂在悬挂杆上。
   6. 首次使用前，将瓶子放入流水槽（不放珊瑚）中至少24小时，以去除任何胶水残留物。
2. 准备收集珊瑚
   1. 将幼虫收集容器完全浸入培养缸中。
   2. 在保持珊瑚群体和收集容器均处于水下的情况下，将群体放入幼虫收集容器中。
   3. 将幼虫收集容器的把手挂在悬挂杆上。
      注意：悬挂后，确保收集容器顶部高出水面约3 cm。
   4. 重复步骤4.2.1–4.2.3，直到所有珊瑚群体均放入各自的幼虫收集容器中。
3. 收集并计数珊瑚幼虫
   1. 准备一个3 L量杯、一个碗、一支3 mL移液器和若干50 mL离心管。
   2. 将鱼线从悬挂杆上取下，从幼虫收集容器中取出一个珊瑚群体，并立即将该群体放回培养缸中。
      注意：确保暴露在空气中的时间尽可能短。
   3. 一只手扶住幼虫收集容器的瓶盖端。
      注意：当幼虫收集容器充满水时可能较重。若缺乏适当支撑，在将其从水中取出时容器可能破裂。
   4. 将幼虫收集容器"把手"从悬挂杆上取下。
   5. 缓慢地将幼虫收集容器从水中提起。
   6. 将收集容器倾斜约45°角，置于培养缸上方数秒钟，使多余的水通过容器侧面的窗口流回缸内via。
      注意：倾斜角度不得超过45°，以减少幼虫从容器顶部倾倒出的风险。
   7. 将幼虫收集容器移出水槽，并放置在量杯上方。
   8. 在拧开瓶盖前，先用一根手指对瓶盖施加适度压力，然后缓慢拧开瓶盖。
      注意：若未先用手指支撑，移除瓶盖时容器内的水可能迅速喷出（可能导致幼虫损失）。
   9. 将量杯中部分水倒入碗中。
   10. 使用3 mL移液器将碗中的幼虫转移至50 mL离心管中，手动计数幼虫数量。
       注意：请注意部分幼虫可能卡在移液器内部。若发生此情况，吸入少量海水，用手指封住移液器口并轻轻摇晃，使幼虫松脱。
   11. 重复步骤4.3.9和步骤4.3.10，直至所有幼虫均完成计数。此时，幼虫可用于后续实验。
   12. 对所有其他珊瑚群体重复步骤4.3.2–4.3.10。
       注意：每次更换珊瑚群体之间，应清洗量杯和碗。
   13. 计数完成后，用清水彻底冲洗每个收集容器，尤其是窗口部分。

结果

所述方案实现了：（1）在不同喂养和温度处理条件下，对单个珊瑚群体的繁殖产出和繁殖时间进行比较；（2）评估在不同温度下投喂卤虫（Artemia）无节幼体的可行性。本文简要概述了研究结果，但由于本实验为短期性质（即仅一个繁殖周期），且所用珊瑚群体已适应异地（ex situ）环境，因此在广泛解释温度和喂养对珊瑚繁殖影响时应谨慎对待。

在监测期间（2022年农历9月），每个菌落均进行了繁殖，各菌落的月总繁殖输出量表现出较大差异。菌落释放的幼体总数范围为6至319，其中一个菌落（未喂食、24 °C处理组）产生了528个幼体；所有菌落的数据均显示在图2中，但在数据分析中未包含该高产出的异常值菌落。繁殖输出量受温度（广义线性混合效应模型；z = 5.35，p < 0.001）和喂食条件（z = 3.01，p < 0.003）的影响，且温度与喂食处理之间存在显著交互作用（z = 12.22，p < 0.001）。在28 °C培养的菌...

讨论

温度和投喂对珊瑚繁殖影响的初步评估揭示了在不同处理条件下培养的珊瑚群体间繁殖产出和繁殖时间存在差异。此外，研究发现投喂 卤虫 无节幼体对珊瑚群体的投喂在相对较低（24°C）和较高温度（28°C）下均表现出有效性。这些综合结果凸显了这些简单技术在饲养和培育繁殖性石珊瑚（使用 P. acuta 例如）在 原位以外 水产养殖系统。

在繁殖产出方面，摄食的影响因珊瑚群体培养时的温度处理条件不同而有所差异，其中仅在24 °C处理组中，摄食似乎对繁殖产出具有积极影响。这一结果在一定程度上令人意外，因为在其他海洋生物中，高温条件下食物供给受限已被证明会对繁殖产生负面影响（例如，雀鲷的产卵量减少⁴²），并常伴随早期生活阶段发育不良（例如，变态期间蟹类死亡率升高和生长减缓⁴³）。在珊瑚研究中，关于摄食与温度交互效应的具体评估主要集中于珊瑚共生藻类的光化学性能^44,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卤虫卵囊	Supreme plus	NA	食物来源
冷水机	Resun	CL650	必要时用于降低水温
便携式电导率仪	WTW	Cond 3110	用于测量盐度
营养强化饲料	Omega	NA	用于卤虫培养
钓鱼线	Super	尼龙单丝	用于悬挂珊瑚群体
造流泵	Maxspect	GP03	用于产生水流
350 W 加热棒	ISTA	NA	水族箱中使用的加热器
HOBO 便携式温度记录仪	Onset Computer	UA-002-08	用于记录水温
LED 灯	Mean Well	FTS: HLG-185H-36B	NA
便携式光照强度计	LI-COR	LI-250A	与光传感器配合使用，测量光合有效辐射（PAR）强度
光传感器	LI-COR	LI-193SA	NA
100 µm 网孔的浮游生物网	Omega	NA	用于收集幼虫和卤虫
主水泵 6000 L/H	Mr. Aqua	BP6000	将水从水族箱抽入冷水机
叶轮式流速仪	KENEK	GR20	与叶轮式探测器配合使用，测量流速
叶轮式探测器	KENEK	GR3T-2-20N	NA
体视显微镜	Zeiss	Stemi 2000-C	用于计数卤虫数量
1000 W 温度控制器	Rep Park	O-RP-SDP-1	用于设定并维持水温