育雏硬质珊瑚（Pocillopora acuta）的饲养和迁地培养的有效技术

由于气候变化导致的高温压力，全球许多珊瑚礁生态系统正在丧失和退化^1,2。珊瑚白化（即珊瑚-藻类共生的破坏³）在过去⁴ 中被认为是相对罕见的，但现在发生得更频繁⁵，预计到本世纪中后期，许多地区将发生年度白化 ^6,7。白化事件之间过渡期的缩短会限制珊瑚礁的复原力⁸.高温胁迫对珊瑚群落的直接影响（例如，组织损伤⁹;能量消耗¹⁰）与珊瑚礁规模的间接影响有着内在的联系，其中繁殖/招募能力的降低尤其令人关注¹¹。这刺激了一系列应用研究，例如，积极原位增强招募（例如，珊瑚礁播种¹²）、扩大珊瑚恢复的新技术 13，以及模拟繁殖线索以诱导迁地系统中的繁殖¹⁴。与这些积极干预措施相辅相成的是最近认识到在高温胁迫下珊瑚异养摄食的优势¹⁵，以及探索食物供应在繁殖中可能发挥的作用¹⁶。

众所周知，异养喂养会影响珊瑚的性能¹⁷，并且与珊瑚生长增加^18,19 以及热阻和弹性 ^20,21 特别相关。然而，异养的好处在珊瑚物种中并不普遍²²，并且可能因食用的食物类型 23 以及光照水平而有所不同²⁴。在珊瑚繁殖的背景下，异养喂养显示出不同的结果，据报道，异养喂养后繁殖能力较高²⁵ 和较低²⁶。异养摄食对珊瑚在一系列温度范围内繁殖的影响很少被评估，但在温带珊瑚Cladocora caespitosa中，发现异养对于较低温度条件下的繁殖更为重要²⁷。可能需要更好地了解温度和摄食对繁殖产量的作用，以确定特定珊瑚礁（例如，与高食物供应相关的珊瑚礁²⁸）在气候变化下是否具有更高的招募能力。

与繁殖产量类似，温度和摄食对珊瑚繁殖时间的影响仍然研究不足，尽管繁殖与非生物/生物条件的同步是在变暖的海洋中招募成功的重要考虑因素²⁹。在实验室³⁰进行的珊瑚热调节研究中，较高的温度已被证明会导致更早的繁殖，并且在³¹季节从天然珊瑚礁收集的珊瑚中也观察到了这一点。然而，有趣的是，最近在 非原生境 流通系统中养殖了 1 年的喂养珊瑚中观察到了相反的趋势（即，在冬季温度较低的月球周期中发生繁殖，在夏季温度较高的月球周期中发生后期）³²。这一对比结果表明，在与丰富的能量资源相关的条件下，繁殖时间可能偏离典型模式。

不同温度情景下的长期对照实验有助于更好地了解异养对硬质珊瑚繁殖的影响。然而，在多个繁殖周期的非原生境条件下维持繁殖珊瑚群落可能具有挑战性（但参见以前的研究^32,33）。本文描述了在流通式水产养殖系统中主动摄食（食物来源:卤虫无节幼体）和长期养殖育雏珊瑚（Pocillopora acuta）的简单而有效的技术;然而，应该指出的是，所描述的所有技术也可用于循环水产养殖系统。为了证明这些技术，对在"喂养"和"未喂养"处理下保持在24°C和28°C的珊瑚群落的繁殖产量和时间进行了初步比较。选择这些温度分别近似于台湾南部冬季和夏季的海水温度^30,34;没有选择更高的温度，因为促进长期迁地养殖，而不是测试珊瑚对热应激的反应，是该实验的主要目标。此外，量化了喂养前后卤虫无节幼体的密度，以比较两种温度处理下异养喂养的可行性。

具体来说，从台湾南部国立海洋生物博物馆和水族馆研究设施的流通罐中获得24个P. acuta菌落（平均总线性延伸±标准差:21.3厘米±2.8厘米）。Pocillopora acuta 是一种常见的珊瑚物种，它既具有广播产卵，又具有典型的育雏繁殖策略^35,36。这些珊瑚的亲本群落最初是在大约2年前从出口礁（21.931°E，120.745°N）收集的，用于另一项实验³²。因此，本实验中使用的珊瑚群落是在非原生境养殖条件下饲养的;具体来说，菌落暴露于环境温度和 12 小时:12 小时光:暗循环，量子为 m−²·s⁻¹，每周喂食两次卤虫无节幼体。我们认识到，这种长期的异地培养可能影响了菌落对本实验中处理条件的反应。因此，我们想强调的是，这里的主要目的是通过展示一个应用的例子来说明如何有效地使用所描述的技术来异地养殖珊瑚，其中评估了温度和喂养对珊瑚繁殖的影响。

珊瑚菌落均匀分布在六个流通系统培养罐中（罐内长x宽x高:175 cm x 62 cm x 72 cm;罐光状态:12 h:12h 光:暗循环，250 μmol量子^m-2·s-1）（图1A）。其中三个罐中的温度设定为28°C，其他三个罐中的温度设定为24°C;每个储罐都有一个记录器，每 10 分钟记录一次温度（参见材料表）。使用冷却器和加热器独立控制每个水箱的温度，并使用流量马达保持水循环（参见材料表）。每个菌池中一半的菌落（n = 2 个菌落/池）每周喂食两次卤虫无节幼体，而其他菌落则不喂食。每次饲喂持续 4 小时，在两个独立的特定温度饲喂罐中进行。在饲养过程中，将所有菌落移入饲养罐，包括未饲喂的菌落，以标准化在罐之间移动菌落的潜在压力效应。饲喂和未饲喂处理中的菌落使用特定温度饲养罐内的网状框架放置在自己的隔室中，以便只有饲养条件下的菌落才能获得食物。每天上午09:00，通过计算一夜之间释放到幼虫收集容器中的幼虫数量，评估每个群落的珊瑚繁殖产量和时间。

1. 在非原生境水产养殖池中悬挂珊瑚群落

1. 在养殖罐上放置一个缺口杆（长 x 宽 x 高:75 cm x 1 cm x 3 cm），以下称为"吊杆"，以准备悬挂珊瑚群落。
   注意:本实验中使用的吊杆是定制的，但只要一根带有突出螺钉（即充当槽口）的简单 PVC 管就足够了，只要它可以稳定地放置在培养罐的顶部并且足够坚固以容纳珊瑚。
2. 测量一条钓鱼线（参见 材料表）的长度为 ~1.5 m，然后将其对折两次。
   注意:钓鱼线的初始长度应根据珊瑚群落在养殖池中所需的最终位置来选择。
3. 在折叠的钓鱼线的末端打一个小的反手结，该钓鱼线的初始末端是钓鱼线的初始端。
   注意: 打结后，底部应该有两个大环，顶部应该有一个小环。
4. 将珊瑚群放在两个大环的中间，使环位于珊瑚群周围，并在珊瑚悬挂在水中时可以牢固地固定珊瑚。
5. 将钓鱼线的小顶环钩入吊杆上的凹槽中（图 1B）。

2. 珊瑚喂养

1. 制作喂食容器
   1. 使用亚克力管（长 x 宽 x 高:25 厘米 x 60 厘米 x 25 厘米）构建一个矩形框架。在框架中制作两个单独的隔间，分别放置喂食和未喂食的珊瑚（图1C）。
      注:使用亚克力管是因为它重量轻（即与较重的PVC管相反），因此可以促进进料容器更容易进出培养罐。
   2. 使用热胶枪将 100 μm 的浮游生物网粘附在框架的底部和侧面。
   3. 在管道上（特别是沿框架的侧面和底部）钻总共 ~10 个小孔（直径 0.5 厘米），以防止进料容器在放入培养罐时漂浮。
   4. 在喂食容器的每个角落的浮游生物网上钻孔（直径~0.5厘米）。
   5. 将一根 8 厘米长、直径为 0.5 厘米的管子穿过角孔，然后使用热胶枪将其固定到位。
      注意: 在进料过程中，这些管子将连接到气泵和气泡石（有关详细信息，请参阅步骤 2.3.2）。
2. 卤虫 培养
   1. 从独立的喂养罐中收集2L海水，并将海水倒入 卤虫 孵化容器中（图1D）。
      注:在用于演示方案的本实验中，使用了两个独立的治疗专用饲喂罐，这需要准备两个用于 卤虫 培养的孵化容器。
   2. 在添加 卤虫 囊肿之前，将气泵连接到连接到孵化容器底部的管道约10分钟。
   3. 等待时，使用天平测量8g 卤虫 囊肿（参见 材料表）。
      注:如Huang等人¹⁹所建议的那样，要获得35个卤虫无节幼体/mL的平均密度，请使用4g卤虫囊肿与1L海水的比例。
   4. 10分钟后，将8g 卤虫 囊肿倒入孵化容器中。
   5. 将 卤虫 囊肿孵育48小时。
3. 准备进料罐
   1. 将喂食容器放入喂食罐中，使容器顶部高于水面。
   2. 将喂食容器角管的外部连接到气泵，气泵将向气泡石供应空气，以促进喂食过程中的水循环。
   3. 在喂食开始前~5分钟打开气泵。
4. 卤虫 无节幼体富集和收集
   1. 在所需的饲喂时间前 2 小时向孵化容器中加入 1.5 mL 富集饲料（参见 材料表）。
      注:Huang等人推荐的比例为0.75mL浓缩饮食与1L海水的比例¹⁹。
   2. 2小时后，关闭向孵化容器供应空气的阀门。
   3. 用纸板箱盖住孵化容器以排除环境光，并在孵化容器底部放置光源（手机手电筒就足够）5分钟，以将卤虫无节幼体吸引到容器底部，从而促进活卤虫无节幼体与空壳的分离。
   4. 5分钟后，取出盒子和光源。
   5. 在孵化容器下方放置一个 3 L 量壶。
   6. 从孵化容器上拆下管子，让 卤虫 无节幼体和海水溶液流入量壶;收集 1 L 卤虫 无节幼体和海水溶液。
      注意:在孵化容器中仅收集一半的体积，以排除不需要的空壳。
   7. 站在靠近喂食罐的地方，将卤虫无节幼体和海水溶液倒入100μm过滤器，将卤虫无节幼体（将保留在过滤器中）与海水中分离。
   8. 用喂养罐中的水冲洗过滤器内的 卤虫 无节幼体两次。
   9. 卤虫无节幼体现在可以使用了。
5. 喂养珊瑚群落
   1. 通过将步骤 2.4.8 中的过滤器放入进料罐中，卸载 卤虫 无节幼体。
   2. 用手搅拌水箱中的水，使 卤虫 无节幼体均匀分布。
      注意:在此步骤之后收集样品用于 卤虫 无节幼体密度的"预喂养"定量（有关详细信息，请参见步骤3.1）。
   3. 将每个吊杆（珊瑚群落仍悬挂在杆上）从培养罐移动到喂食罐，并将杆定位，使其牢固地放在喂食罐的顶部。珊瑚暴露在空气中的持续时间应尽可能短。
      注意:确保菌落没有相互接触，并且有足够的空间来捕获食物（例如，相距~5厘米）。
   4. 关闭喂食罐内的灯，或使用非密封盖盖住喂食罐，以免喂食过程中受到光线干扰。
   5. 让菌落不受干扰地喂养4小时。
   6. 4小时后，收集样品用于 卤虫 无节幼体密度的"喂养后"定量（有关详细信息，请参见步骤3.1）。
6. 喂食后清理
   1. 喂食完成后，移除珊瑚群落。将吊杆单独从喂食罐中取出，并用各自养殖罐中的海水彻底冲洗每个珊瑚，以去除任何残留的 卤虫 无节幼体。
      注意: 在稳定的表面上冲洗菌落，而不是在悬挂时冲洗菌落，以降低在冲洗过程中菌落来回摆动时可能发生的损坏风险。根据最初的转移，尽可能短珊瑚暴露在空气中的持续时间。
   2. 将吊杆（挂有珊瑚）放回培养罐中。
   3. 拆下连接进料容器和气泵的管子，然后从进料罐中取出进料容器。
   4. 用淡水彻底冲洗喂养容器，以去除所有剩余的 卤虫 无节体。

3. 量化喂养前后的 卤虫 无节幼体密度

1. 收集样本
   1. 在两个时间点收集样本:首先，当 卤虫 无节幼体被卸载并均匀分布在喂养容器中时（步骤2.5.2），以及喂养过程完成后（步骤2.5.6）。
   2. 对于每个时间点，使用三个注射器分别从进料容器的表面、中间层和底层抽取 20 mL 水。
2. 样品稀释
   1. 对于每个注射器，将 20 mL 水样转移到独立的 500 mL 烧杯中。
   2. 向烧杯中加入 180 mL 热水 （~60 °C）（1:10 稀释）。
      注意:热水用于固定 卤虫 无节幼体，以提高计数的准确性。
   3. 将 2 mL 水样从烧杯中加入到 9 孔板的每个孔中。
      注意:在吸取 2 mL 样品之前，将样品混合在烧杯中，使 卤虫 无节幼体均匀分布在水柱中。
   4. 在立体显微镜下使用6.5倍放大倍率计算每个孔中 卤虫 无节幼体的数量（参见 材料表）。
3. 计算 卤虫 无节幼体的密度
   1. 将每个孔中的卤虫无节幼体数除以2，得到每mL卤虫无节幼体数。然后，将该数字乘以 10（以考虑稀释）以计算卤虫无节幼体密度。
   2. 计算卤虫无节幼体的平均密度（即进料前与进料后 27 个孔重复的平均密度），以比较进食前和进食后之间的卤虫无节幼体密度。

4. 珊瑚幼虫收集

1. 制作幼虫收集容器（图1E）
   1. 选择一个6升的塑料水瓶，将瓶底完全切掉。
      注意:该开口将用于将菌落移入和移出幼虫收集容器。
   2. 通过从瓶子的每一侧切出一个 ~15 cm x 20 cm 的矩形来创建两个窗口。
      注意: 6 升塑料水瓶适用于直径 ~15 厘米的珊瑚;根据所研究的珊瑚的大小修改瓶子的大小。
   3. 使用热胶枪，然后使用环氧树脂将 100 μm 浮游生物网粘附在每个窗户上。
   4. 在瓶子底部的每一侧开两个小孔（直径~0.5厘米）。
   5. 将一根绳子穿过两个小孔，并系好两端，形成一个手柄，用于将幼虫收集容器钩在吊杆上。
   6. 初次使用前，将瓶子放入流通罐（没有珊瑚）中至少24小时，以去除任何胶水残留物。
2. 准备收集珊瑚
   1. 将幼虫收集容器完全浸入培养罐中。
   2. 将菌落放入幼虫收集容器中，同时保持菌落和容器浸没在水中。
   3. 将幼虫收集容器的手柄钩在吊杆上。
      注意: 悬挂后，确保收集容器的顶部高出水面 ~3 厘米。
   4. 重复步骤4.2.1-4.2.3，直到所有菌落都在其幼虫收集容器中。
3. 收集和计数珊瑚幼虫
   1. 准备一个 3 L 量壶、一个碗、一个 3 mL 移液管和 50 mL 试管。
   2. 从吊杆上解开钓鱼线，从幼虫收集容器中取出一个菌落。立即将菌落放回培养罐中。
      注意: 确保暴露在空气中的持续时间尽可能短。
   3. 将一只手放在幼虫收集容器的盖端。
      注意:当幼虫收集容器装满水时，它可能很重。如果没有适当的支撑，容器在从水中取出时可能会破裂。
   4. 从吊杆上解开幼虫收集容器"手柄"。
   5. 慢慢地将幼虫收集容器从水中提起。
   6. 将收集容器保持在培养罐上方约45°角几秒钟，让多余的水 通过 幼虫收集容器窗口流回罐中。
      注意: 不要将容器的角度超过 45°，以减少从容器顶部倒出幼虫的机会。
   7. 从水箱中取出幼虫收集容器，并将其放在量壶的顶部。
   8. 拧开盖子之前，用一根手指对盖子施加适度的压力，然后拧开盖子。
      注意:如果收集容器内的水没有首先由手指支撑，则在取下盖子时会迅速释放（即可能导致幼虫丢失）。
   9. 将量壶内的一些水倒入碗中。
   10. 使用3mL移液管将幼虫移入50mL管中，手动计算碗中幼虫的数量。
       注意:请注意，一些幼虫可能会卡在移液器内。如果发生这种情况，请将一些海水吸入移液器中，轻轻摇晃，同时用一根手指密封移液器以松开幼虫。
   11. 继续步骤4.3.9和步骤4.3.10，直到所有幼虫都计数完毕。在这个阶段，幼虫可以用于后续的实验。
   12. 对所有其他珊瑚群重复步骤4.3.2-4.3.10。
       注意: 量壶和碗应在菌落之间冲洗。
   13. 计数完成后，用清水彻底冲洗每个收集容器，尤其是窗户。

所描述的方案允许 （1） 比较不同摄食和温度处理之间单个珊瑚群落的繁殖产量和时间，以及 （2） 评估 卤虫 无节幼体在不同温度下摄食的可行性。在此，对研究结果进行了简要概述，但由于该实验的短期性质（即只有一个繁殖周期）和使用适应 异地 条件的珊瑚群落，因此对温度和喂养对珊瑚繁殖的影响的广泛解释应谨慎。

在我们的监测期间（2022 年 9 月），每个菌落都进行了繁殖，并且菌落之间的月总繁殖产量表现出很大的差异。菌落释放的幼虫总数从6到319只不等，除了一个菌落（在未投喂的24°C处理中）产生528只幼虫;所有菌落的数据如图2所示，但高产异常菌落未包含在数据分析中。繁殖产量受温度（广义线性混合效应模型;z = 5.35，p < 0.001）和摄食（z = 3.01，p < 0.003）的影响，温度和摄食处理之间存在显著的交互作用（z = 12.22，p < 0.001）。 在28°C下培养的菌落在未喂食时释放的幼虫（平均值±标准差;151±82）比喂食时（131±133）（广义线性混合效应模型，事后对比;z = 3.01，p = 0.014），但在24°C培养的菌落中发现相反的趋势，其中喂养的菌落（80±78）比未喂养的菌落（12±6）产生更多的幼虫（z = 11.91， 第 < 页 0.001）。

所有菌落的繁殖都发生在满月（农历第15天）之前（图3）。幼虫释放的平均农历日（MLD）（按繁殖量加权）范围为农历第6.5天至第11.1天，仅在月球周期早期繁殖的"未喂养的28 °C"菌落和在月球周期后期繁殖的"喂养的24 °C"菌落之间存在显著差异（线性混合效应模型， 事后对比，t = 4.10，p = 0.006）。

在正式生殖监测前一个月（2022 年 8 月），在喂养前后评估卤虫无节幼体密度;这在三个时间点重复:在该实验的珊瑚培养开始时（T0）和在处理条件下进行珊瑚培养2周和4周（图4）。T0 时的初步评估显示，在两种温度处理下，卤虫无节幼体的喂养前和喂养后密度没有差异。培养2周和4周后，两种温度处理后喂养后的卤虫无节幼体密度均较低（第2周:双向方差分析，F 1,104 = 128.45，p < 0.001;第4周:双向方差分析，F1,104 = 294.71，p < 0.001）。在评估的三个时间点中的任何一个时间点，温度处理之间的饲喂前密度（p > 0.05）或温度处理之间的饲喂后密度（p > 0.05）没有差异。

所有分析均在 R 中使用软件包 lme437、lmerTest 38、emmeans39、car 40 和 Hmisc41 进行。用于分析的数据和 R 脚本在 GitHub （https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission） 上公开提供。

图1:育雏硬质珊瑚的摄食和 异地 培养的实验设计和代表性材料示意图。 （A） 在24 °C或28 °C的流水养殖池中，在投饵和未投饵条件下养殖 Pocillopora acuta 的菌落;黑色圆圈代表殖民地。（B） 蜂群悬挂有钓鱼线，以减轻处理压力并促进养殖池和饲养池之间的有效移动。（C） 在饲养过程中，将所有菌落移动到特定温度饲养罐内的网状框架中。喂养菌落位于框架的一个隔室中，未喂养的菌落位于框架的另一个隔室中;只为喂养的殖民地提供食物。（D）在喂养处理中每周两次向菌落给予富 集的卤虫 无节幼体。（E） 将菌落放入幼虫收集容器中过夜，以量化一个月球周期内每天的繁殖产量。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:不同温度（24°C与28°C）和饲喂处理（饲喂与未饲喂）下 Pocillopora acuta 菌落的繁殖产量。 这些字母代表了不同治疗之间生殖产量的显着差异。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:不同温度（24°C与28°C）和饲喂处理（饲喂与未饲喂）下Pocillopora acuta菌落的繁殖时间。 垂直虚线表示每种处理的平均农历日（MLD）繁殖。治疗特异性图（A-D）的每个条形图内的色调表示单个菌落对每日总繁殖的贡献。这些字母代表了不同治疗之间生殖时间的显着差异。请点击这里查看此图的较大版本.

图4:在24°C和28°C温度处理下，珊瑚喂养前后的 卤虫 无节幼体密度。 在珊瑚喂食之前计算喂食前密度，在完成4 h珊瑚喂食会话后计算喂食后密度。在珊瑚养殖开始时（T0）评估 卤虫 无节幼体的密度，然后在流水养殖系统中2周和4周后在处理条件下评估。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。