利用生物标准品开展研究的可重复性与标准化：以血小板激动剂胶原相关肽为例

摘要

本文介绍了一种利用光透射比浊法对血小板激动剂交联胶原相关肽（CRP-XL）进行标准化的方法。尽管该方案主要针对血小板功能检测，但其实验流程可广泛应用于大多数生物分子和生物测定，以确保科学研究的严谨性和可重复性。

摘要

计量学——测量的科学——是很少有生物科学家在培训过程中系统学习的学科，而这对其发展不利；将简单的标准化流程应用于日常实验操作，能够增强数据的可信度，并确保在不同地点和时间下的可重复性。

本方法展示了如何标准化在止血研究和临床实践中广泛使用的核心实验室实验，即通过光透射聚集仪（LTA）检测血小板胶原受体（糖蛋白[GP]VI）激动剂交联胶原相关肽（CRP-XL）诱导的血小板聚集反应。采用该方法可确保实验室内结果的可重复性以及实验室间数据的一致性，不受激动剂储备液来源或供应商差异的影响。重要的是，该方法同样适用于其他血小板激动剂，乃至许多其他生物分子和生物检测方法。

以下流程包括对“标准品”和“待测样品”（即待检测物质）进行6-8个梯度的系列稀释，并在选定的检测方法（本例中为LTA）中平行运行。CRP-XL以质量/体积浓度使用，但并非所有材料在相同浓度下均表现出相同的生物活性，因此需制备系列稀释样品，以比较标准品与待测样品，确定产生等效活性所需的浓度。稀释系列必须覆盖0-100%的聚集反应范围。数据采用非线性回归法作图，并计算EC₅₀ 每个样品（标准品和待测样品）的值被确定。为确定活性，将EC₅₀ 将标准品的效价与待测样品的效价相除，以确定后者效价更高或更低的程度，并相应调整其浓度。该方法可确保每次加入检测体系的物质具有相同的生物学“活性”。

引言

我们许多人在实验中都会使用生物激动剂和拮抗剂，通常是在特定条件下通过生物测定法来量化它们对细胞功能的影响。本文所述方法针对的是血小板激动剂——交联胶原相关肽（CRP-XL），这是一种糖蛋白VI激动剂，能够激活血小板，其活性可通过多种检测方法进行测量（如光透射聚集测定法、显微镜检查、流式细胞术、Ca²⁺释放等），但该激动剂标准化方案适用于任何生物激动剂/拮抗剂和/或生物测定方法。物理科学领域在其日常工作中已广泛采用标准物质，商业领域中开发生物治疗药物的公司也深知使用参考标准的重要性¹，然而许多生物科学家，尤其是学术研究领域的研究人员，仍未能充分利用标准物质，这种缺失对科研成果的质量产生了负面影响。

CRP-XL 是血小板研究领域自1995年报道以来已使用数十年的一种特异性靶向GPVI的激动剂²，帮助学界自那时起不断明确GPVI与其他胶原结合性血小板蛋白之间的功能差异^3,4该激动剂可从多种商业渠道购买或在实验室内部制备。肽单体可从供应商处购得，随后在实验室内部进行交联，或直接采用其他方式 由供应商提供，但需额外收费。通过降低交付时的纯度要求（例如从95%降至70%），可进一步节省成本。目前对于CRP-XL的储存方式尚无统一标准：部分实验室选择低温冷冻保存，部分选择冷藏；有些在使用前保持冻干状态，而另一些则以溶液形式储存（溶剂为水或缓冲液，依偏好而定）。因此，各实验室库存的CRP-XL在质量和组成上均未实现标准化或统一。由于该激动剂的使用浓度是以质量/体积（mass/volume）而非活性单位表示，因此在不同实验室中，相同浓度（如1 μg/mL）的CRP-XL实际效价并不一致。值得注意的是，血小板研究领域中其他激动剂（如凝血酶）已实现标准化，以活性单位而非质量/体积进行供应和使用，因此学界转向以生物学活性单位替代质量/体积的使用方式并不存在显著障碍。此外，还需注意的是，患者对包括CRP-XL在内的血小板激动剂的反应存在个体差异，表现为对激动剂的敏感性以及反应能力（反应程度）的不同。⁵，因此使用一致剂量的激动剂显得尤为重要 活性 在检测中。

如果使用血小板激动剂时以其确定的活性而非质量/体积作为标准，便可确保一个实验室的实验结果能够与其他实验室的结果直接比较，并能够被准确地重复验证。在该领域就CRP-XL活性的储存和标准化方法达成共识之前，必须定期对材料进行检测，以确保其在数月乃至数年使用过程中的稳定性与一致性。

生物标准品的活性赋值必须通过多中心协作研究（例如^6,7）完成，并需要专业 expertise。国际血栓与止血学会（ISTH）支持的一项多中心协作研究最近强调了建立血小板激动剂生物标准品的必要性⁸；在国际通用的CRP-XL标准品问世之前，研究人员可在本地对其自用材料进行标准化，以确保其活性在时间上的稳定性，并确保新采购的商业或自制材料与以往制备的材料以及本领域其他研究者的材料具有可比的活性。

方案

应从知情同意的健康志愿者处采集血液，并根据当地规定进行处理。本方案通过光透射比浊法（LTA）检测富血小板血浆（PRP）中激动剂诱导的血小板聚集。国际血栓与止血学会（ISTH）提供了标准化方案，包括2013年发布的PRP制备和LTA方法⁹。 根据当地伦理委员会的规定，按照ISTH建议将全血采集至含4%柠檬酸钠的采血管中。过去2周内服用过任何非甾体抗炎药（NSAID）的献血者应予以排除。

1. 检测步骤

1. 取一份CRP-XL储备液，用检测缓冲液（Tyrodes¹⁰缓冲液）（表1）稀释至起始浓度，该浓度应能引起最大程度的聚集（参见第1.3步下方的注释）。
   注：文献中通常使用1 μg/mL的浓度即可诱导最大聚集，但某些实验室可能需要更高浓度才能达到相同效果——请据此调整稀释系列
2. 对标准品制备相应的稀释系列（参见第1.3步下方的注释及图1），使其浓度与待测试剂相同。
3. 在检测缓冲液中为待测样品和标准品分别制备6至8个浓度点的稀释系列，使聚集反应从100%降至0%。一个8点稀释系列浓度曲线的示例如表2所示。
   注：一些实验室将激动剂以总体积10%加入，例如将50 μL激动剂加入450 μL血小板中，从而将10倍浓缩液稀释至最终1倍浓度；而另一些实验室则加入更小体积（更高浓度）的激动剂，例如将5 μL激动剂加入495 μL血小板中——请确保所用稀释系列适用于该检测，并注意体积变化对血小板浓度的影响——同样需保持一致性。在本示例中，将30 μL的10倍激动剂加入270 μL富血小板血浆（PRP）中。
4. 待血小板静置并准备就绪后，将其分装至LTA比色皿中，加入搅拌子，并置于保温槽中使其温度升至37 °C。
5. 达到设定温度后，将比色皿放入聚集仪中，开始记录曲线。加入激动剂（同时搅拌），并记录数据。
6. 对每种浓度的待测样品和标准品重复步骤1.4，直至收集到绘制曲线所需的全部数据（示例曲线见图2）。
7. 计算待测试剂相对于标准品的效价；同样可采用任意指标——如最大聚集率或曲线下面积——只要保持一致性，并确保分析模型能适当地拟合数据即可。

2. 检查浓度曲线

1. 首先，检查浓度-反应曲线是否平行。虽然有许多软件包均可实现此功能，但此处以 Graphpad Prism 为例进行说明（参见 图3).
   1. 输入数据，使 log(浓度) 位于 X 轴，反应值（最大聚集率/% AUC）位于 Y 轴（图3A)
   2. 转化CRP-XL浓度（图3B)
   3. 选择 非线性回归 来自 分析 功能并使用剂量-反应刺激/抑制方程。
   4. 选择对数（激动剂）与反应（可变斜率）曲线拟合——根据数据情况选择三参数或四参数拟合，以最适合者为准。
   5. 通过使用以下方法确定曲线是否平行 比较 标签（如图所示） 图3C）并点击按钮以比较数据集，确保斜率（坡度）和渐近线（的 顶部 和 底部 曲线的）是等效的。在此示例中， 坡度 测试样品的值为2.279，标准品的值为2.025，比值为1.125。
   6. 如果斜率平行（例如，斜率比的可接受标准在0.8–1.25之间）且渐近线等效，则继续进行效价（EC₅₀）使用步骤 2.1.3 和 2.1.4 进行计算。在本示例中，步骤 2.1.5 的评估已确认两条渐近线等价，因此将渐近线参数约束为相等。
   7. 将EC分装₅₀ 将测试品的效价与标准品的效价相除，以确定相对效价。在本示例中，测试品/标准品（0.07259/0.1498）= 0.4846，即测试品的效价为标准品的一半。
   8. 根据效价差异调整质量/体积浓度，即如果标准品先前使用浓度为 1 µg/mL，则新物料的使用浓度应为 1/0.4846 = 2.063 µg/mL，以确保实验中所用活性物质的量具有可比性

结果

图1 是一个稀释系列的示意图，旨在强调标准品和待测样品均需要进行系列稀释。图2A 显示了标准品的聚集曲线，而待测样品的数据则显示在 图2B 中。在 0.075 µg/mL 浓度下，标准品表现出明显的响应，而待测样品在相同浓度（0.075 µg/mL）下的信号平坦，即无响应。这些数据用于绘制后续图表以获得 EC₅₀。在本示例中，使用100%最大聚集率绘制浓度-响应曲线并确定 EC₅₀，如 图3 所示。

图 1：测试样品（左侧）和标准品（右侧）两种稀释系列的图示说明。 从最高浓度开始（建议浓度：10 µg/mL CRP-XL），在8个点上平行进行连续1:2稀释（>3个对数单位）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：标准（左）和测试稀释系列（右）的血小板聚集曲线。 随着血小板聚集的进行（x轴），透过样品并到达传感器的光量增加（y轴）。(A) 标准品。(B) 测试样品。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：数据录入与分析。（A）录入数据，（B）对数据进行转换，并对（C、D）数据进行平行性分析（可要求软件判断Hill斜率和渐近值是否具有可比性[C]）。（E）若曲线具有平行性，采用非线性回归曲线拟合方法确定效价（EC₅₀）。（F）绘制经转换后的数据图。详情请参见方法部分。请点击此处查看该图的放大版本。

台氏液缓冲液9
成分	浓度	备注
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0.34 mM
KCl	2.9 mM
NaHCO3	12 mM
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	20 mM
葡萄糖	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7.3

表1：Tyrode缓冲液的成分。

8点稀释系列
稀释1	10 µg/mL
稀释2	5 µg/mL
稀释3	2.5 µg/mL
稀释4	1.25 µg/mL
稀释5	0.625 µg/mL
稀释6	0.3125 µg/mL
稀释7	0.15625 µg/mL
稀释8	0.073125 µg/mL

表2：一个8点稀释系列的示例。

讨论

如图所示，材料的标准化过程非常直接。尽管评估新批次材料和/或检查当前批次材料是否随时间保持稳定且活性未下降需要花费一定时间，但其优势在于实验可重复进行，并且结果可在多年间进行比较，而不仅限于某一批试剂的有效期。此外，这也意味着其他研究人员能够准确地重现检测条件，从而使全球范围内的研究群体实现标准化。该实验方案中的关键步骤包括全血采集和富血小板血浆（PRP）制备⁹，以及在配制稀释系列时的操作精确性。在进行半数有效浓度（EC₅₀）比较之前，还需确保待测曲线与标准曲线具有平行性。如果曲线不平行，或其渐近线不一致，则可能表明待测物质与标准物质在某种程度上存在差异。

所有从事生物科学工作的人都知道，生物检测的结果并不总是具有一致性，因此在评估数据时必须考虑到这一点。在下图所示的示例中，尽管我们使用相同的供体来测定两种非常相似甚至完全相同的材料的效价，其Hill斜率和渐近线仍不完全相同。然而，我们能够接受一定程度的变异性，并得出结论：在此情况下，这两条曲线是平行的，因此 适合用于比较和调整效价。生物分子体积大且结构复杂，生产过程中的翻译后修饰可能会影响其在生物检测中的效价。生物分子及其检测方法的标准化不能仅依靠质量或体积来实现，而必须通过生物检测中生物活性的定量与比较来完成¹¹。实验人员必须依靠自身的专业训练和经验，结合具体检测的背景来评估数据。

该技术的局限性在于，尽管数据可能提示试剂存在某些问题，但无法指明具体是什么 问题。仍需进一步工作以确定材料不可比的原因。在理想情况下，任何对 实验及后续科学结论至关重要的材料都应通过质谱分析进行验证，但这并不总是可行的选择。然而，如果数据不可比，则仍有必要以某种方式进行深入调查。该方法的另一个局限是所需的时间和资源。理想情况下，应在3至6名供体中比较测试样品与标准品，以更有把握地确认材料的生物学活性，但我们认为这种投入对于支持实验的可重复性和可靠性是合理的。并非每次实验都需要对生物材料进行标准化，但至少应对每一批新制备的激动剂进行标准化，最好根据其稳定性和使用频率更频繁地开展。事实上，若能提供标准品，国际标准化组织可在该方面提供明确指导。

尽管此处所示示例是在测量血小板聚集的背景下针对CRP-XL的，但比较生物分子在生物测定中生物学活性的方案在整个领域内具有广泛适用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	S1804	溶于水的抗凝剂9
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		一种交联的三股螺旋肽2,4，序列为 GCP*(GPP*)GCP*G（单字母氨基酸代码：P* = 羟脯氨酸），由 Peptide Protein Research Ltd. 定制合成获得。
比色皿和搅拌子	Stago	86921	聚集仪用耗材
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		数据分析软件包
富血小板血浆			从健康志愿者全血中分离获得，志愿者在至少10天内未使用非甾体抗炎药物8。