使用生物学标准品进行研究的可重复性和协调性:以血小板激动剂胶原相关肽为例

我们中的许多人在实验中使用生物激动剂和拮抗剂，最常见的是在生物测定中，该测定量化了它们在特定条件下对细胞功能的影响。这里描述的方法适用于血小板激动剂胶原相关肽交联 （CRP-XL），这是一种激活血小板的糖蛋白 VI 激动剂，其活性可以在各种测定法（光透射聚集法、显微镜、流式细胞术、Ca²⁺ 释放等）中测量，但激动剂标准化方案适用于任何生物激动剂/拮抗剂和/或生物测定法。物理科学精通在日常工作实践中使用标准，在商业领域开发生物治疗药物的公司了解使用参考标准^的价值1，但许多生物科学家，特别是在学术研究界，它们仍然没有得到充分利用，缺乏使用会对科学产出的质量产生负面影响。

CRP-XL 是一种特异性 GPVI 特异性激动剂，自 1995 年被描述以来，血小板领域已经使用了几十年²，帮助社区自 ^3,4 以来将 GPVI 的作用与其他胶原结合血小板蛋白的作用区分开来。这种激动剂可以从各种商业来源采购或内部生产。肽单体可以从供应商处购买，然后在内部进行交联，也可以由供应商支付额外费用。通过降低交付时所需的纯度（例如，70% 对 95%），可以进一步节省成本。关于CRP-XL的储存方式也没有达成共识，有些选择低温储存，有些选择冷藏，有些选择将材料冻干直到使用，有些则将其储存在溶液（水或缓冲液，取决于偏好）中。因此，实验室储备的质量和组成是非标准化或协调的。由于该激动剂以规定的浓度（质量/体积）而不是活性单位使用，因此在一个实验室中，CRP-XL的效力（例如，1μg/mL）将与另一个实验室不同。值得注意的是，该领域使用的其他血小板激动剂已经标准化（例如，凝血酶，其以活性单位而不是质量/体积提供和使用），因此从质量/体积到生物单位的运动对社区来说应该不会太具有挑战性。还应该注意的是，患者对血小板激动剂（包括 CRP-XL）的反应在对激动剂的敏感性以及反应能力（反应^{程度）方面}是可变的5，因此在测定中使用一致量的激动剂活性更为重要。

如果血小板激动剂可以通过在规定的活性而不是重量/体积下使用它们来协调，则可以确保一个实验室的实验与其他实验室的实验直接比较，并且可以放心地准确再现。在现场就如何存储和标准化 CRP-XL 活动达成一致之前，必须对材料进行定期检查，以确保其在使用月/年内的一致性。

生物标准品的活性值分配必须通过协作的多中心研究（例如^6,7）完成，并且需要专业知识。最近，由国际血栓形成和止血学会 （ISTH） 支持的一项多中心合作研究⁸ 强调了建立血小板激动剂生物学标准的必要性;在国际CRP-XL标准可用之前，研究人员可以在当地对自己的材料进行标准化，以确保长期保持一致性，并且商业或内部采购的新材料与以前的制剂以及社区其他部分的制备具有相当的活性。

应从同意的健康志愿者处采集血液，并按照当地法规进行处理。该方案通过透光聚集法（LTA）测量激动剂诱导的富血小板血浆（PRP）中的血小板聚集。ISTH 提供标准化方案，包括 2013 年 PRP 制备方法和 LTA⁹。 根据当地伦理委员会的规定，根据ISTH的建议，将全血收集到4%柠檬酸钠中。排除在过去 2 周内服用过任何非甾体抗炎药的供体。

1.检测程序

1. 取等分试样的储备CRP-XL，并在测定（Tyrodes¹⁰）缓冲液（表1）中将其稀释至将导致最大聚集的起始浓度（参见步骤1.3下面的注释）。
   注:在文献中，1 μg/mL 的浓度将诱导最大聚集，但一些实验室需要更高的浓度才能达到相同的效果 - 相应地调整稀释度系列
2. 用标准品进行相应的稀释系列（参见步骤 1.3 和 图 1 下面的注释），使浓度与测试试剂相同。
3. 再次在测定缓冲液中为测试品和标准品生成 6 至 8 点稀释系列，使聚集响应从 100% 降至 0%。 表2显示了8点稀释系列浓度曲线的示例。
   注:一些实验室以总共 10% 的测定体积添加激动剂，例如，将 50 μL 激动剂添加到 450 μL 血小板中，以便它们在测定中将 10 倍浓度稀释至最终 1 倍浓度，而其他实验室则添加更小（更浓缩）体积的激动剂，例如，将 5 μL 激动剂添加到 495 μL 血小板中 - 只需确保稀释系列适合测定，同时牢记体积置换如何影响血小板浓度 - 再次保持一致。在该示例中，将 30 μL 10x 激动剂加入到 270 μL 富血小板血浆 （PRP） 中。
4. 一旦血小板静置并准备好使用，将它们分装到LTA比色皿中，加入搅拌棒，并让它们在保持孔中达到37°C。
5. 达到温度后，将比色皿放入聚集计并开始记录迹线。加入激动剂（搅拌）并记录数据。
6. 对测试和标准品的每种浓度重复步骤1.4，直到收集到绘制曲线所需的数据（示例曲线如图 2所示）。
7. 计算测试试剂相对于标准品的效力;同样，使用任何指标 - 最大聚合或曲线下面积 - 只要存在一致性并且分析模型适当拟合数据即可。

2. 检查浓度曲线

1. 首先，检查浓度响应曲线是否平行。有许多软件包可以做到这一点，但这里描述了 Graphpad Prism 的过程（参见 图 3）。
   1. 输入数据，使log（浓度）位于X轴上，响应（%最大聚集/ AUC）位于Y轴上（图3A）
   2. 转换CRP-XL浓度（图3B）
   3. 从分析函数中选择非线性回归，并使用剂量反应刺激/抑制方程。
   4. 选择对数（激动剂）与响应（可变斜率）- 使用3向或4向拟合，具体取决于哪种拟合最适合数据。
   5. 使用 "比较 "选项卡确定曲线是否平行（ 如图 3C 所示），然后单击按钮比较数据集，以确保斜率（山坡）和渐近线（曲线 的顶部 和 底部 ）相等。在本例中，测试的 山坡为 2.279，标准坡度为 2.025，比率为 1.125。
   6. 如果斜率是平行的（例如，斜率比在0.8-1.25之间的验收标准）并且渐近线是等效的，则使用步骤2.1.3和2.1.4继续进行效力（EC₅₀）计算。在此处显示的示例中，渐近线已受到约束，因为步骤 2.1.5 中的评估确认渐近线是等效的。
   7. 将标准的 EC₅₀ 值除以测试值以确定相对效力。在此处显示的示例中，test/standard （0.07259/0.1498） = 0.4846，即"test"的效力是标准的一半。
   8. 调整质量/体积浓度以考虑效力差异，即，如果之前以 1 μg/mL 的浓度使用标准品，则新材料的使用浓度为 1/0.4846 = 2.063 μg/mL），以确保在实验中使用相当量的活性材料

图 1 是稀释系列的示意图，旨在强调标准品和测试都需要稀释系列。 图2A 显示了标准的聚合迹线，而测试数据如图 2B所示。在 0.075 μg/mL 时，对标准品有明确的响应，而对于测试，相应的浓度 （0.075 μg/mL） 是平坦的，即没有响应。这些数据用于绘制后续图形，以给出 EC50。在此所示的示例中，使用100%最大聚集来绘制浓度-响应曲线并确定EC50， 如图3所示。

图 1:测试（左）和标准品（右）的两种稀释系列的图形说明。 从最高浓度（建议浓度:10 μg/mL CRP-XL）开始，在 8 个点（>3 个对数单位）上平行进行连续 1/2 稀释。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:标准品（左）和测试稀释系列（右）的聚集迹线。 随着血小板聚集的进行（x 轴），通过样品并到达传感器的光量增加（y 轴）。（a） 标准。（B） 测试. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:数据输入和分析。 （A） 输入数据，（B） 转换，（C，D） 分析并行性（要求软件判断希尔坡度和渐近线是否具有可比性 [C]）。（E） 如果曲线平行，则使用非线性回归曲线拟合确定效力 （EC50）。（F） 绘制的转换数据。有关更多详细信息，请参阅方法。请点击这里查看此图的较大版本.

表1:Tyrodes缓冲液的组成。

表 2:显示 8 点稀释系列的示例。

作者没有什么可声明的。