Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

摘要

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）_35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）的不完全弗氏佐剂中，主动诱导C57BL/6小鼠产生实验性自身免疫性脑脊髓炎。

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导，需通过将MOG多肽与含灭活的完全弗氏佐剂（CFA）乳化后进行免疫。 结核分枝杆菌分枝杆菌的抗原成分可激活树突状细胞，进而刺激T细胞产生促进Th1反应的细胞因子 通过 Toll样受体。因此，抗原攻击期间存在的分枝杆菌的数量和种类与实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发展直接相关。本文提供了一种替代性方法，通过使用含有热灭活分枝杆菌的改良不完全弗氏佐剂，在C57BL/6小鼠中诱导EAE。 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 菌株 K-10

M. paratuberculosis，一种属于 鸟分枝杆菌 复合物是反刍动物约翰氏病的致病因子，并已被确认为多种人类T细胞介导疾病（包括多发性硬化症）的风险因素。总体而言，用该复合物免疫的小鼠 Mycobacterium paratuberculosis 比使用含该菌株的完全弗氏佐剂（CFA）免疫的小鼠发病更早且疾病更严重 M. tuberculosis H37Ra 在相同剂量（4 mg/mL）下的抗原决定簇 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 （MAP） 菌株 K-10 能够在效应阶段诱导强烈的 Th1 型细胞免疫反应，其特征是 T 淋巴细胞（CD4）数量显著增加⁺ CD27⁺），树突状细胞（CD11c⁺ I-A/I-E⁺）和单核细胞（CD11b⁺ CD115⁺) 与使用CFA免疫的小鼠相比，在脾脏中达到最高水平。此外，针对MOG肽的T细胞增殖反应似乎在 M. paratuberculosis-免疫小鼠。使用脑炎原（例如，MOG_35-55) 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis 配方中的成分可能是激活树突状细胞以启动髓鞘表位特异性CD4的一种替代且经过验证的方法⁺ EAE 诱导阶段的 T 细胞。

引言

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病常用的模型¹存在多种EAE模型：通过不同髓鞘肽与强效佐剂联合使用进行主动免疫，或通过过继免疫 体外 髓鞘特异性CD4转移⁺ 淋巴细胞，以及自发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的转基因模型²每种模型都具有特定的特征，可用于研究EAE的不同方面，如疾病 onset（起病）、效应阶段或慢性阶段。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）模型是研究慢性神经炎症和脱髓鞘免疫介导机制的良好模型，其特征为单核细胞炎症浸润、周围白质脱髓鞘，以及在疾病达峰后恢复能力降低。¹.

通过用MOG_35-55肽段在完全弗氏佐剂（CFA）中免疫易感小鼠，随后腹腔注射百日咳毒素，可诱导MOG-EAE模型。这会增加血脑屏障的通透性，使在外周被激活的髓鞘特异性T细胞进入中枢神经系统（CNS），并在该处被再次激活³。CFA在EAE诱导中起关键作用，其机制是增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，并促进与体液免疫和细胞介导免疫相关的细胞因子表达⁴。这一机制主要归因于油中乳化的灭活Mycobacterium tuberculosis，其组分....

方案

所有小鼠实验均经顺天堂大学医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号 290238），并依照美国国立卫生研究院动物实验指南进行。

1. 实验的总体说明

1. 将小鼠单独饲养在动物房的笼具中，置于温度为 23 °C ± 2 °C、相对湿度为 50% ± 10%、12 小时光照/12 小时黑暗循环的受控无菌环境中，并提供 随意摄取 食物和水的获取
2. 分别向小鼠注射不含抗原的磷酸盐缓冲液（PBS）和完全弗氏佐剂（CFA），作为阴性对照和阳性对照。

2. 分枝杆菌抗原的制备

1. 在T25细胞培养瓶中，将M. paratuberculosis K-10菌株接种于添加了10% OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）、0.005%吐温80和2 mg/L分枝杆菌素J的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C培养2周。定期通过肉眼观察评估菌落生长情况。
   注意： 操作M. paratuberculosis时必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。
2. 将富集培养物置于500 mL锥形瓶中，加入终体积为200 mL的菌悬液（浓度为1.7 × 10⁵ 菌落形成单位（C....

结果

将C57BL/6小鼠分为若干组（每组总数 n = 15），分别使用含有M. paratuberculosis的乳剂或采用常规CFA方法免疫MOG_35-55。所有小鼠组均表现出急性单相性疾病，其特征为在免疫后14–17天出现一次致病性高峰，随后在接下来的10天内症状部分缓解（图1A）。无论性别如何，使用含M. paratuberculosis佐剂免疫的小鼠在免疫后8–9天即出现更早的发病时间，并且在急性期表现出比CFA免疫小鼠更高的疾病严重程度（图1B）。各组之间在体重上无显著差异（图1C）。按照先前发表的方法¹¹，对EAE小鼠脾细胞进行流式细胞分析，并通过³H-胸苷掺入法评估T淋巴细胞的增殖活性。所有EAE小鼠的脾细胞，无论所用佐剂为何，均对MOG_{35-55<.......}

讨论

我们展示了一种可靠的替代方案，通过使用MOG肽主动诱导C57BL/6J小鼠产生严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）_35-55 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis¹⁰采用该方法诱导EAE所导致的疾病严重程度高于使用CFA的常规方案。这种差异可能是由于分枝杆菌细胞壁中不同的脂质成分所致。¹¹。事实上，与其他分枝杆菌不同的是， M. paratuberculosis 在细胞壁表面产生脂五肽抗原，而非糖肽脂质¹¹该脂五肽不与其他近缘物种发生交叉反应，并已被证实是自身免疫性疾病患者体内强烈特异性体液免疫反应的靶标¹²分枝杆菌具有病原体相关分子模式，这些分子模式在免疫反应中发挥不同作用⁹例如，我们最近的研究表明，通过口服免疫接种 M. paratuberculosis 加重MOG-EAE的严重程度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD115 抗体	Biolegend, USA	135505	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 CD11b 抗体	Biolegend, USA	101215	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 CD11c 抗体	Biolegend, USA	117313	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 CD16/32  抗体	Biolegend, USA	101302	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 CD4  抗体	Biolegend, USA	116004	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 CD8a  抗体	Biolegend, USA	100753	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 I-A/I-E 抗体	Biolegend, USA	107635	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
抗小鼠 Ly-6C  抗体	Biolegend, USA	128023	用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000
BBL Middlebrook OADC 增菌液	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	用于分枝杆菌的分离与培养
C57BL/6J 小鼠	Charles River Laboratory, 日本		3 周龄，雄性和雌性
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	用于细胞培养，使用前于 37 °C 预热
冷冻干燥机	Eyela, 东京, 日本	FDU-1200	用于细菌冻干
不完全弗氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant）	Difco Laboratories, MD, USA	263810	用于佐剂配制
Middlebrook 7H9 肉汤培养基	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	促进分枝杆菌生长
副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）K-10	ATCC, USA	BAA-968	来源于牛的细菌
结核分枝杆菌 H37 Ra，冻干粉	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	用于佐剂配制
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		生长促进剂
髓鞘少突胶质细胞糖脂蛋白（MOG）35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	致脑炎肽段
卵清蛋白（257-264）	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	增殖实验中的阴性对照抗原
百日咳毒素溶液	Fujifilm Wako, 大阪, 日本	168-22471	来源于革兰氏阴性菌百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis），可增加血脑屏障通透性
Polytron 匀浆器 PT 3100	Kinematica		用于抗原与佐剂的混合
RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）	Gibco Life Techologies, USA	11875093	用于细胞培养
胸苷 [Methyl-3H]，溶于 2% 乙醇，1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	用于增殖实验，使用浓度为每孔 1 μCi
Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒	Biolegend, USA	423105	用于流式细胞术检测细胞活力