本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）的不完全弗氏佐剂中，主动诱导C57BL/6小鼠产生实验性自身免疫性脑脊髓炎。
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摘要
摘要
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导，需通过将MOG多肽与含灭活的完全弗氏佐剂（CFA）乳化后进行免疫。 结核分枝杆菌分枝杆菌的抗原成分可激活树突状细胞，进而刺激T细胞产生促进Th1反应的细胞因子 通过 Toll样受体。因此，抗原攻击期间存在的分枝杆菌的数量和种类与实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发展直接相关。本文提供了一种替代性方法，通过使用含有热灭活分枝杆菌的改良不完全弗氏佐剂，在C57BL/6小鼠中诱导EAE。 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 菌株 K-10
M. paratuberculosis，一种属于 鸟分枝杆菌 复合物是反刍动物约翰氏病的致病因子，并已被确认为多种人类T细胞介导疾病（包括多发性硬化症）的风险因素。总体而言，用该复合物免疫的小鼠 Mycobacterium paratuberculosis 比使用含该菌株的完全弗氏佐剂（CFA）免疫的小鼠发病更早且疾病更严重 M. tuberculosis H37Ra 在相同剂量（4 mg/mL）下的抗原决定簇 鸟分枝杆菌 亚种 副结核分枝杆菌 （MAP） 菌株 K-10 能够在效应阶段诱导强烈的 Th1 型细胞免疫反应，其特征是 T 淋巴细胞（CD4）数量显著增加+ CD27+），树突状细胞（CD11c+ I-A/I-E+）和单核细胞（CD11b+ CD115+) 与使用CFA免疫的小鼠相比，在脾脏中达到最高水平。此外，针对MOG肽的T细胞增殖反应似乎在 M. paratuberculosis-免疫小鼠。使用脑炎原（例如，MOG35-55) 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis 配方中的成分可能是激活树突状细胞以启动髓鞘表位特异性CD4的一种替代且经过验证的方法+ EAE 诱导阶段的 T 细胞。
引言
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病常用的模型1存在多种EAE模型：通过不同髓鞘肽与强效佐剂联合使用进行主动免疫，或通过过继免疫 体外 髓鞘特异性CD4转移+ 淋巴细胞，以及自发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的转基因模型2每种模型都具有特定的特征，可用于研究EAE的不同方面，如疾病 onset（起病）、效应阶段或慢性阶段。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）模型是研究慢性神经炎症和脱髓鞘免疫介导机制的良好模型，其特征为单核细胞炎症浸润、周围白质脱髓鞘，以及在疾病达峰后恢复能力降低。1.
通过用MOG35-55肽段在完全弗氏佐剂（CFA）中免疫易感小鼠，随后腹腔注射百日咳毒素，可诱导MOG-EAE模型。这会增加血脑屏障的通透性，使在外周被激活的髓鞘特异性T细胞进入中枢神经系统（CNS），并在该处被再次激活3。CFA在EAE诱导中起关键作用，其机制是增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，并促进与体液免疫和细胞介导免疫相关的细胞因子表达4。这一机制主要归因于油中乳化的灭活Mycobacterium tuberculosis，其组分可对免疫系统产生强烈刺激5。事实上，EAE的诱导效果与抗原攻击期间存在的分枝杆菌含量直接相关6。
将其他灭活的分枝杆菌（如Mycobacterium butyricum）添加至不完全弗氏佐剂7 中，以及不同佐剂组合的使用8，均可调节实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的临床病程，从而影响实验结果的可重复性。Mycobacterium avium 亚种 paratuberculosis（MAP）是反刍动物约翰氏病的致病因子，已被发现与人类中枢神经系统（CNS）的炎症性疾病相关9，因其抗原成分可在多发性硬化症和视神经脊髓炎谱系障碍患者中引发强烈的体液免疫和细胞介导免疫反应9。因此，在本实验方案中，我们提出一种替代性且可重复的方法，即用M. paratuberculosis替代CFA中的M. tuberculosis，以诱导MOG-EAE模型。
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方案
所有小鼠实验均经顺天堂大学医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号 290238），并依照美国国立卫生研究院动物实验指南进行。
1. 实验的总体说明
- 将小鼠单独饲养在动物房的笼具中，置于温度为 23 °C ± 2 °C、相对湿度为 50% ± 10%、12 小时光照/12 小时黑暗循环的受控无菌环境中，并提供 随意摄取 食物和水的获取
- 分别向小鼠注射不含抗原的磷酸盐缓冲液（PBS）和完全弗氏佐剂（CFA），作为阴性对照和阳性对照。
2. 分枝杆菌抗原的制备
- 在T25细胞培养瓶中，将M. paratuberculosis K-10菌株接种于添加了10% OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）、0.005%吐温80和2 mg/L分枝杆菌素J的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C培养2周。定期通过肉眼观察评估菌落生长情况。
注意： 操作M. paratuberculosis时必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。 - 将富集培养物置于500 mL锥形瓶中，加入终体积为200 mL的菌悬液（浓度为1.7 × 105 菌落形成单位（CFU）/mL，培养基同步骤2.1），在摇床培养箱中培养1周。
注意：由于污染微生物可能影响实验结果，需将细菌接种至Middlebrook 7H10固体培养基，以观察菌落形态，并通过M. paratuberculosis常规聚合酶链式反应（PCR）检测试剂盒验证纯度。 - 将细菌悬液在70 °C下灭活 5–10分钟，随后在3,000 × g条件下离心10分钟。将获得的沉淀用PBS洗涤两次，称重后通过超声波破碎，并于-20 °C保存。
- 将沉淀转移至无菌容器中，使用干冰或液氮迅速冷冻，立即转移至冷冻干燥室。
- 根据仪器说明书对M. paratuberculosis进行冷冻干燥（真空条件下-50 °C持续4小时）。
- 冻干结束后，从冻干机中取出不锈钢容器并转移至生物洁净工作台。使用不锈钢刮勺将附着在容器内壁上的干燥MAP块状物刮下，并尽可能研磨成细粉。
- 使用电子天平称量研磨后的细胞，手动将其以10 mg/mL的浓度分装至无菌10 mL小瓶中。
注意：细胞密度以每升样品的干重克数表示。培养3周后，1 mg（湿重）细菌沉淀约含有2.5 × 108 CFU。
3. MOG 35-55 乳剂的制备
- 取一管冻干的M. paratuberculosis（10 mg）内容物，用研钵和研杵研磨成细粉，加入10 mL不完全弗氏佐剂，配制成10 mg/mL的储备液。储存于-4 °C。
- 免疫前，将储备液稀释至终浓度为4 mg/mL。
- 将肽段MOG35-55溶于ddH2O中，配制成终浓度为2 mg/mL的溶液，并储存于-20 °C。
- 使用匀浆器，在5 mL离心管中将步骤3.2中的MOG35-55溶液（2 mg/mL）与等体积的佐剂（4 mg/mL）混合，直至形成浓稠的乳剂。每匀浆10秒后，将溶液置于冰上冷却20秒，并短暂离心以收集管壁上的液体。
- 将乳剂转移至1 mL注射器中，排尽所有空气，安装27 G针头。乳剂现可用于注射。
注意：由于在制备过程中MOG35-55的黏稠乳剂会有一定损失，建议制备所需量的1.5倍为宜。
4. 动物免疫
- 使用异氟烷吸入麻醉动物，以尽量减少动物的应激反应。
- 将乳剂（200 µL，含 MOG35-55 200 µg/只） 皮下注射至动物下背部。
- 在免疫后第0天和第2天，分别腹腔注射百日咳毒素（100 µL，含200 ng/只）。
注意：百日咳毒素对免疫系统具有多种抑制作用；避免摄入以及接触眼睛和皮肤。
5. 临床评估
- 每天监测小鼠的体重和临床症状。使用以下评分系统：0 = 无临床症状；1 = 尾巴松软；2 = 翻正反射受损和后肢无力；3 = 后肢完全瘫痪；4 = 后肢完全瘫痪并伴有前肢部分瘫痪；5 = 濒死状态。
注意：一旦首次观察到临床症状，应为动物提供更多的饮水和食物。将啮齿类动物饲料软化并润湿后，从饲料盒中取出并放置于笼底。对于脱水动物，给予皮下补液，或通过口服灌胃给予啮齿类动物饲料糊。若小鼠需要此类支持超过3天，则实施安乐死。 - 为避免或尽量减少动物疼痛与痛苦，采用以下 humane endpoints（人道终点）：体重减轻超过20%、临床评分 ≥4.0、评分为3时丧失翻正反射，以及动物无法自主接触饲料或饮水持续24小时。
注意：在EAE诱导后第30天，通过腹腔注射戊巴比妥（≥150 mg/kg）对小鼠实施安乐死。
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结果
将C57BL/6小鼠分为若干组（每组总数 n = 15），分别使用含有M. paratuberculosis的乳剂或采用常规CFA方法免疫MOG35-55。所有小鼠组均表现出急性单相性疾病，其特征为在免疫后14–17天出现一次致病性高峰，随后在接下来的10天内症状部分缓解（图1A）。无论性别如何，使用含M. paratuberculosis佐剂免疫的小鼠在免疫后8–9天即出现更早的发病时间，并且在急性期表现出比CFA免疫小鼠更高的疾病严重程度（图1B）。各组之间在体重上无显著差异（图1C）。按照先前发表的方法11，对EAE小鼠脾细胞进行流式细胞分析，并通过3H-胸苷掺入法评估T淋巴细胞的增殖活性。所有EAE小鼠的脾细胞，无论所用佐剂为何，均对MOG35-55<...
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讨论
我们展示了一种可靠的替代方案，通过使用MOG肽主动诱导C57BL/6J小鼠产生严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）35-55 乳化于含佐剂的溶液中 M. paratuberculosis10采用该方法诱导EAE所导致的疾病严重程度高于使用CFA的常规方案。这种差异可能是由于分枝杆菌细胞壁中不同的脂质成分所致。11。事实上，与其他分枝杆菌不同的是， M. paratuberculosis 在细胞壁表面产生脂五肽抗原，而非糖肽脂质11该脂五肽不与其他近缘物种发生交叉反应，并已被证实是自身免疫性疾病患者体内强烈特异性体液免疫反应的靶标12分枝杆菌具有病原体相关分子模式，这些分子模式在免疫反应中发挥不同作用9例如，我们最近的研究表明，通过口服免疫接种 M. paratuberculosis 加重MOG-EAE的严重程度
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了日本促进科学学会基金（基金编号：JP 23K14675）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 CD115 抗体 | Biolegend, USA | 135505 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 CD11b 抗体 | Biolegend, USA | 101215 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 CD11c 抗体 | Biolegend, USA | 117313 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 CD16/32 抗体 | Biolegend, USA | 101302 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 CD4 抗体 | Biolegend, USA | 116004 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 CD8a 抗体 | Biolegend, USA | 100753 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 I-A/I-E 抗体 | Biolegend, USA | 107635 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| 抗小鼠 Ly-6C 抗体 | Biolegend, USA | 128023 | 用于流式细胞术，稀释比例 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC 增菌液 | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | 用于分枝杆菌的分离与培养 |
| C57BL/6J 小鼠 | Charles River Laboratory, 日本 | 3 周龄，雄性和雌性 | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | 用于细胞培养，使用前于 37 °C 预热 |
| 冷冻干燥机 | Eyela, 东京, 日本 | FDU-1200 | 用于细菌冻干 |
| 不完全弗氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant） | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | 用于佐剂配制 |
| Middlebrook 7H9 肉汤培养基 | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | 促进分枝杆菌生长 |
| 副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | 来源于牛的细菌 |
| 结核分枝杆菌 H37 Ra，冻干粉 | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | 用于佐剂配制 |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | 生长促进剂 | |
| 髓鞘少突胶质细胞糖脂蛋白（MOG）35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | 致脑炎肽段 |
| 卵清蛋白（257-264） | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | 增殖实验中的阴性对照抗原 |
| 百日咳毒素溶液 | Fujifilm Wako, 大阪, 日本 | 168-22471 | 来源于革兰氏阴性菌百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis），可增加血脑屏障通透性 |
| Polytron 匀浆器 PT 3100 | Kinematica | 用于抗原与佐剂的混合 | |
| RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | 用于细胞培养 |
| 胸苷 [Methyl-3H]，溶于 2% 乙醇，1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | 用于增殖实验，使用浓度为每孔 1 μCi |
| Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒 | Biolegend, USA | 423105 | 用于流式细胞术检测细胞活力 |
参考文献
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