筛选癌细胞中的离子通道

膜转运蛋白对于细胞之间的通讯以及维持细胞稳态至关重要。在膜转运蛋白中，离子通道用于驱动细胞的生长和发育，并在具有挑战性和不断变化的环境中维持细胞的状态。据报道，离子通道还可以驱动和支持实体瘤的发展，包括全身和中枢神经系统（CNS）^1,2。例如，KCa3.1通道负责调节膜电位和控制细胞体积，这在细胞周期调节中很重要。据报道，有缺陷的KCa3.1通道有助于肿瘤细胞的异常增殖³。此外，离子通道可能有助于癌症的转移性播散。例如，瞬时受体电位 （TRP） 通道参与 Ca 2+ 和 Mg²⁺ 内流;这种涌入激活了几种激酶和热休克蛋白，它们的作用是调节肿瘤周围的细胞外基质，这反过来又对启动癌症转移^{很重要4。}

由于离子通道有助于癌症的发展，它们也可能是药物相关癌症治疗的靶标。例如，对治疗方式（包括化疗和新型免疫疗法）的耐药性与离子通道功能失调有关^5,6,7。此外，离子通道正在成为阻碍癌症生长和发展的重要药物靶点，正在研究重新利用的小分子（FDA批准）药物以及生物聚合物，包括单克隆抗体1,2,8,9。虽然在这方面取得了很大进展，但离子通道癌症药物的发现仍然不发达。这部分是由于研究癌细胞中离子通道的独特挑战。例如，在为慢效化合物设置电生理学测定方面存在技术限制，并且在通道活化和药物作用方面存在时间差异。此外，化合物的溶解度也会阻碍进展，因为目前常用的大多数自动化电生理系统都使用疏水底物，这可能会导致化合物吸附而导致伪影。此外，使用常规电生理学测定进行筛选大型生物有机分子疗法（如天然产物、肽和单克隆抗体）在技术上具有挑战性¹⁰。最后，癌细胞的生物电特性仍然知之甚少¹¹。

同时，离子通道的免疫荧光染色通常具有挑战性。这部分是由于它们的结构和它们在膜中的环境的复杂性，这会影响产生和使用抗体进行显微镜研究的能力。尤其重要的是，对用于染色离子通道的抗体的特异性、亲和力和重现性进行验证。应根据离子通道的商业抗体的验证策略和发表记录来考虑。实验应包括阴性对照，以证明通过敲低或敲除目标蛋白缺乏非特异性结合。或者，基于mRNA或蛋白质测定的靶蛋白不存在或丰度低的细胞系可以作为阴性对照。例如，这项研究显示了（GABA）受体亚基Gabra5在髓母细胞瘤细胞系（D283）中的定位。对具有siRNA敲低的D283细胞和另一种小脑髓母细胞瘤细胞系Daoy细胞进行Gabra5染色，并且没有明显的染色（数据未显示）。

本文介绍了分析和测定离子通道功能以及离子通道调节剂对癌细胞的影响的方法。为（1）离子通道染色细胞，（2）测试线粒体的极化状态，（3）使用电生理学建立离子通道功能以及（4）体外药物验证提供了方案。这些协议强调A型γ-氨基丁酸（GABA_A）受体2,12,13,14,15,16^，氯化阴离子通道和主要抑制性神经递质受体的研究。然而，这里介绍的方法适用于研究许多其他癌细胞和离子通道。

1. 培养细胞中的免疫标记离子通道

1. 准备细胞和实验装置
   1. 将细胞维持在75cm² 培养瓶中作为活跃生长的培养物。传代一次细胞，直到它们变得50%-90%汇合，具体取决于所用细胞系的倍增时间。
      注意:对于本研究，使用了D283细胞，即第3组髓母细胞瘤细胞系。
   2. 将培养瓶中的细胞收集到离心管（15 mL或50 mL）中，并加入2 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA以分离贴壁细胞。在室温（RT）下孵育5分钟。5分钟后，轻敲烧瓶三到五次以帮助分离细胞。将细胞收集在含有10%FBS的10mL培养基中以停止胰蛋白酶的作用。
   3. 在室温下以480× g 离心5分钟。 轻轻吸出培养基。不要打扰细胞沉淀。
   4. 根据培养物的密度，将细胞重悬于 5 mL 至 10 mL 培养基中。
      注意:密度必须与活跃生长的细胞一致，并且取决于烧瓶中细胞的汇合度。应使用视觉评估来近似最佳细胞密度;具体来说，细胞应该在40%-90%之间汇合且均匀分布。
   5. 取出 100 μL 细胞，并加入含有 100 μL 0.4% 台盼蓝的 1.5 mL 管中，以标记非活细胞。根据细胞系在室温下孵育5-15分钟。
   6. 使用血细胞计数器（参见 材料表）在 10 μL 溶液中手动计数细胞。计数血细胞计数器16个正方形的四个角中每个角落的活的，未染色的细胞。将平均细胞数乘以稀释因子，乘以 10,000 得到每毫升细胞数（细胞/mL）。或者，可以使用自动细胞计数仪。
   7. 将细胞稀释至1 x 10⁵ 个细胞/mL，放入为每个细胞系指定的培养基中。种子 1.将 8 mL 细胞放入含有 22 mm x 22 mm 盖玻片的 6 孔板的每个孔中，该盖玻片根据制造商的说明预涂有 0.1 mg/mL 聚-D-赖氨酸（参见 材料表）。
      注意:人们可能想要测试聚-D-赖氨酸和聚-L-赖氨酸的使用，因为有关于细胞系特异性偏好的报告^17,18。一些细胞系具有可以分解聚-L-赖氨酸的蛋白酶，而有报道称聚-D-赖氨酸对某些细胞系有毒。相比之下，神经元细胞，如PC12，据报道在聚-D-赖氨酸表面上更健康。
   8. 在37°C下在加湿的5%CO₂ 环境中培养细胞过夜，以使细胞附着在盖玻片上。用20倍物镜在倒置显微镜下检查细胞的附着。
      注意:在治疗或直接免疫染色之前，细胞必须完全附着在盖玻片上。此时，可以通过添加浓缩储备液（例如，600μL 4x储备溶液）或用含有所需1x浓度药物的新鲜培养基替换培养基来用药物（或载体对照）处理细胞;然后将细胞返回到培养箱中长达48小时。包括溶剂处理的细胞以评估药物对靶分子水平和定位的影响。在本研究中，用600μL的3.2μMGABA_A 受体阳性变构调节剂QH-II-066¹⁴ 溶液（参见 材料表）处理D283细胞48小时。对照细胞用等体积的DMSO处理。
2. 免疫标记的准备:固定、透化和封闭
   1. 用2.5mL的1x PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na 2 HPO 4,2mM KH₂PO₄，参见材料表）冲洗细胞，并立即吸出溶液。
   2. 在室温下使用 1 mL 的 4% PFA 在 1x PBS 中固定细胞 1 小时。
      注意:虽然4%PFA是免疫染色的标准固定剂，但戊二醛或乙二醛也可用于固定膜蛋白以进行免疫荧光。基于酒精的固定方法，例如用冰冷的甲醇处理，可能导致形态保存不佳和膜蛋白丢失^19,20。
   3. 在摇床上搅拌，用 2.0 mL 的 1x PBS（每次洗涤 5 分钟）洗涤六次。在室温下在由1x PBS与0.8%Triton X-100和10%正常血清匹配的一抗宿主物种组成的封闭缓冲液中孵育1小时（或者，可以使用3%BSA或牛血清级分V白蛋白代替正常血清）。
      注意:此步骤用于阻止非特定绑定。
3. 免疫标记
   注意:加入与荧光团偶联的抗体后，必须尽快进行测量以防止光漂白。与偶联抗体的孵育需要避光。使用含有清除自由基的试剂的封片剂将减少光漂白。密封盖玻片后，将载玻片储存在不透光的容器（4°C）中。成像时，可以通过限制激发照明的强度和曝光时间来最小化光漂白。
   1. 通过在150毫米培养皿的底部衬上滤纸来准备加湿室。用无菌蒸馏水润湿滤纸。在一块切割的实验室薄膜上绘制一个 3 x 2 网格以适合滤纸的顶部，并对其进行标记以保持 6 孔板中盖玻片的方向。将实验室薄膜放在滤纸的顶部，露出上下边缘以加湿腔室。
   2. 在含有 3% BSA 的 1x PBS 中，每张盖玻片制备 100 μL 所需稀释的一抗。要检测 GABRA 基因蛋白产物，请使用稀释度为1:200的兔重组单克隆一抗（Gabra5抗体，中间区域;参见 材料表）。
      注意:要凭经验确定在背景上产生最佳信号的一抗浓度，请使用一抗的稀释系列，同时保持二抗浓度恒定。建议使用 1:100、1:250、1:500、1:750 和 1:1,000 稀释度，以确定最佳一抗浓度。
   3. 将盖玻片从6孔板中的块溶液转移到实验室薄膜上绘制的网格上的适当位置。从6孔板中丢弃封闭溶液，并保留板以进行洗涤步骤。
   4. 小心地将 100 μL 稀释的一抗添加到每个盖玻片的中心。避免将溶液放在盖玻片的边缘。在室温下孵育1小时。
   5. 向 6 孔板的每个孔中加入 2.5 mL 的 1x PBS。将盖玻片转移回 6 孔板中的适当位置。
   6. 用 2.5 mL 的 1x PBS 进行六次洗涤，每次 5 分钟。
      注意:在冲洗步骤中不要让盖玻片干燥，因为这可能会导致背景荧光信号。
   7. 将盖玻片放回实验室胶片上的正确位置。对于每个盖玻片，加入 100 μL 在 1x PBS + 1%-5% BSA 中稀释的二抗。
      注意:最初，与Alexa Fluor 488偶联的二抗（参见 材料表）在1x PBS + 3%BSA中以1:1,000稀释度使用。必要时，可以通过增加浓度以检测低丰度靶蛋白或降低浓度以降低背景来优化二抗浓度。
   8. 对于其余步骤，尽量减少光照，以防止偶联二抗的光漂白。用铝箔覆盖培养皿，并在室温下孵育1小时。
   9. 将盖玻片转移回 6 孔板。使用摇床，用 2.5 mL 的 1x PBS 进行六次洗涤，每次洗涤 5 分钟。通过将板倒置在水槽或废物容器上来卸下 PBS。最后一次洗涤后，将PBS留在井中，以便于取出盖玻片。
   10. 为每个盖玻片标记显微镜载玻片。在载玻片中心加入一滴含有DAPI的含甘油的封片剂（以染色细胞核）（参见 材料表）。
   11. 使用镊子从孔中取出盖玻片，然后将其轻轻地放在载玻片中心的安装介质滴上。
       注意:避免在封片剂中形成气泡。
   12. 使用小片滤纸去除多余的封片剂。用指甲油密封盖玻片的边缘，并在成像前让抛光剂完全干燥。将载玻片储存在不透明的塑料盒中，温度为4°C。
4. 成像和分析
   1. 用荧光显微镜在40倍物镜下用浸油采集图像（参见 材料表）。
   2. 使用适当的滤光片可视化荧光图像。
   3. 注意:对于Alexa Fluor 488，请使用496 nm / 519 nm的激发/发射;对于 DAPI，请使用 358 nm/461 nm 的激发/发射。
   4. 捕获并保存数字图像文件。4 x 4 的合并值用于提高图像收集率并减少背景。
   5. 准备最终图像。图像可以使用 ImageJ 或市售软件进行处理。结果如图 1所示。

2. 测试线粒体的极化状态

注意:该协议利用TMRE（四甲基罗丹明，乙酯）测定来标记活性线粒体中的膜电位，保持负电荷^21,22。TMRE是一种细胞渗透性，红橙色，带正电荷的染料，由于其相对负电荷而在活性线粒体中积累。非活性或去极化的线粒体降低了膜电位，并且不能按比例螯合TMRE。FCCP（羰基氰化物 4-[三氟甲氧基] 苯腙）是一种氧化磷酸化 （OXPHOS） 的离子载体解偶联剂，可使线粒体膜去极化，从而防止 TMRE²³ 的积累和隔离。如图 2 所示。

1. 准备细胞和实验装置
   1. 将细胞保持在75cm² 培养瓶中。吸出培养基，并用不含钙和镁的1x PBS冲洗细胞。
   2. 加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 以分离贴壁细胞。在室温下孵育5分钟，并将细胞重悬于10mL培养基中。
   3. 将培养瓶中的细胞收集到 15 mL 离心管中。在室温下以480× g 离心5分钟。 吸出培养基。
   4. 根据培养物的原始汇合度，将细胞重悬于5 mL至10 mL培养基中，使血细胞计数器上的细胞浓度为每平方50-100个细胞。如有必要，调整体积以提供准确计数所需的细胞密度。
   5. 取出 100 μL 细胞，并加入含有 100 μL 0.4% 台盼蓝的 1.5 mL 管中。使用血细胞计数器或自动细胞计数器计数细胞。将细胞稀释至3 x 10⁴ 细胞/ mL，在不含酚红的培养基中。
      注意:使用不含酚红的DMEM培养基，因为酚红暴露会抑制膜渗透性，并可能导致背景自发荧光。
   6. 根据制造商的说明，将每孔 2.5 mL 细胞悬液（75,000 个细胞）接种到含有 22 x 22 mm 盖玻片的 6 孔板中，该盖玻片预涂有聚-D-赖氨酸（参见 材料表）。
   7. 在37°C下用加湿的5%CO₂ 培养箱中培养细胞过夜，以使细胞附着在盖玻片上。
   8. 用20倍物镜在倒置显微镜下检查细胞的附着。在继续之前，细胞必须完全连接到盖玻片上。
2. 准备储备溶液
   1. 要制备 1 mM TMRE 储备溶液 （1,000x）（MW = 514.96 g/mol）（参见 材料表），请将 1 mg TMRE 溶解在 1.94 mL DMSO 中。等分并储存在-20°C避光。避免反复冻融循环。
   2. 要制备 50 mM （2,500x） 的 FCCP 储备溶液 （MW = 254.17 g/mol）（线粒体氧化磷酸化解偶联剂），将 10 mg FCCP 溶解在 786.9 μL DMSO 中。等分并储存在-20°C避光。避免反复冻融循环。
   3. 注意:制备的储备溶液是TMRE线粒体膜电位测定试剂盒的一部分（参见 材料表）。
3. 确定细胞系的TMRE浓度
   1. 在细胞培养基中制备500 nM工作TMRE溶液。保护工作溶液避光。
   2. 将TMRE添加到培养基中生长在盖玻片上的细胞中，最终浓度范围在50-200nM之间。为此，首先吸出培养基并用含有TMRE的培养基代替。
   3. 在37°C孵育20分钟。 确保错开处理时间以允许成像，因为细胞是实时查看的。
   4. 用1x PBS洗涤细胞两次，并在标有最终TMRE浓度的显微镜载玻片上倒置盖玻片。
   5. 立即对活细胞进行成像（峰E_x / E_m = 549 nm / 575 nm）。
      注意:从培养条件中取出后立即对样品进行成像，因为一旦将细胞从培养基中取出并放置在显微镜载玻片上，线粒体健康就会受到损害。作为盖玻片的替代品，细胞可以在玻璃底培养皿中成像。
   6. 使用可用的显微镜和软件捕获图像。
      注意:在TMRE浓度优化过程中建立实验显微镜成像参数，并在后续实验中保持相同的条件，以确保准确的数据比较。详细方案采用了共聚焦显微镜和兼容软件（参见 材料表）。
   7. 选择最佳的TMRE浓度，这取决于细胞系。
      注意:提供最佳信号以解析线粒体TMRE水平变化的TMRE浓度通常是最低的TMRE浓度，提供均匀且易于检测的荧光信号。
4. 测试电池的极化状态
   1. 检测试剂盒制备
      1. 以所需浓度制备处理储备溶液，并制备具有要测定的最终化合物浓度的培养基。对于FCCP，储备溶液应为20 mM（用DMSO从50 mM储备溶液制备）。
      2. 一次处理一张盖玻片，向细胞中加入 1.8 mL 培养基和测试化合物。
      3. 将细胞与测试化合物在37°C和5%CO₂ 在潮湿的环境中孵育所需的时间。
         注意:治疗时间将根据测试化合物可能改变线粒体膜电位的机制而有所不同。像FCCP这样快速直接去极化线粒体膜电位的强效质子载体需要在治疗后不久（几分钟内）进行分析。相比之下，间接影响线粒体电子传递链功能的化合物的治疗效果，例如改变蛋白质活化或蛋白质周转或需要蛋白质合成的化合物，可能需要更长的时间才能显示效果。
      4. 在孵育期间，打开显微镜，并将其设置为预定的最佳成像参数，包括增益、激光强度、图像捕获速率、平均值和曝光时间。
      5. 药物治疗期后，向对照和药物治疗的细胞中加入 200 μL 10x TMRE（上述确定的最佳浓度）。
      6. 在加湿环境中在37°C的5%CO₂ 中孵育15-30分钟。轻轻吸出培养基，并用1x PBS冲洗细胞一次。
      7. 重复1x PBS冲洗步骤以避免由细胞培养基或处理化合物引起的背景，并在标有处理条件的显微镜载玻片上倒置盖玻片。
      8. 对生活在E_{x /} E_m = 549 nm / 575 nm下的细胞进行成像。使用共聚焦显微镜，在细胞完整性丧失之前，通过高速图像捕获（512像素x 512像素，平均值= 4）收集多个z-stack场。
      9. 保存并存储图像文件以供分析。对下一个实验条件重复该过程。
   2. 实验性对照
      1. 使用如上所述的无处理（阴性）对照（步骤3.1.1-3.1.8），培养基中缺乏测试化合物。
      2. 使用由原细胞化合物FCCP组成的线粒体膜电位破坏（阳性）对照。向细胞中加入 1.8 mL 的 20 μM FCCP（参见 材料表）。如上所述（步骤3.1.1-3.1.2;和细胞成像，如步骤3.1.3-3.1.8所述），在用TMRE染色之前，在37°C下在5%CO₂ 中孵育10分钟。
         注意:这些实验需要阳性和阴性对照。
   3. 量化
      1. 从每个 z 堆栈中心区域的单个代表性图像中测量单个单元格的捕获像素强度。在这项工作中，选择了单一的焦点平面以方便分析。
      2. 分析每次处理至少 30 个细胞（全部）的像素强度。使用 Excel 或棱镜对每种处理的像素强度求平均值，并以条形图格式显示平均值的标准误差。
         注意:ImageJ也可用于荧光定量。或者，TMRE染色荧光可以通过商业软件平台进行定量。

3. 利用电生理学建立离子通道功能

注意:本节中的程序描述了使用自动电生理学测定来筛选癌细胞系中的测试化合物（图3）。

1. 准备细胞
   1. 从缺乏死细胞和/或细胞过度生长的健康培养物中收获细胞。使用化学细胞分离溶液TrypLE或手动细胞刮刀收获贴壁和簇状细胞。解离成团或球状生长的细胞，这在中枢神经系统癌细胞中特别常见。
      注意:细胞的温和解离有助于保持离子电导所必需的膜蛋白的完整性。
   2. 在室温下以561× g 离心细胞10分钟。 弃去上清液，并将沉淀悬浮在DMEM（无酚红），HEPES和青霉素/链霉素中，含20%FBS和4mM L-谷氨酰胺（参见 材料表）保持在37°C。
      注意:使用缺乏酚红的DMEM培养基，因为酚红暴露会抑制膜渗透性。
   3. 将细胞以低密度铺在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，以便在单个细胞之间分离。
      注意:这里使用聚-L-赖氨酸，而不是聚-D-赖氨酸，因为聚-L-赖氨酸具有更好的涂层性能。
   4. 在记录之前，将细胞在37°C和5%CO₂ 在加湿室中孵育12小时至24小时（需要确定最佳时间）。
2. 电生理学记录
   1. 从盖玻片上取出培养基。用1x PBS轻轻洗涤细胞两次。加入 ~300 μL TrypLE 溶液。使用移液器轻轻向上/向下移液四到五次，直到细胞分离。
   2. 加入无血清培养基（DMEM）（不含酚红），并将每体积的最终细胞计数保持在至少100万个细胞/mL。使用 1 mL 移液器整理细胞以获得缺乏细胞簇的细胞悬液。
   3. 将细胞悬液转移到 1 mL 管中。将细胞在4°C孵育10分钟以稳定细胞膜。保持细胞在摇床上旋转（温和循环），以避免形成细胞团块。
   4. 准备 Port-a-Patch 设置（请参阅 材料表）。打开计算机、放大器和灌注系统。打开 Patch-Master 软件，然后创建一个新文件。
   5. 将缓冲液（细胞外和内部）带到室温，然后将缓冲液加载到相应的灌注管中。
      注意:GABA_A 受体的记录需要含有 161 mM NaCl、3 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.5 mM CaCl 2、10 mM HEPES 和 6 mM D-葡萄糖（使用 NaOH 调节至 7.4 的 pH 值）的"细胞外（浴）溶液"和含有 120 mM KCl、2 mM MgCl ₂、10 mM EGTA、 和 10 mM HEPES（使用 NaOH 将 pH 调节至 7.2）。
   6. 用 5 μL 内部溶液填充电极芯片（制造商提供）的底部，并将电极芯片放在 Port-a-Patch 的法拉第顶部。向芯片中加入 10 μL 外部溶液，并使用 Patch-Master 软件观察示波器上的矩形脉冲（参见 材料表）。
      注意:电阻可能在2-3 MΩ的范围内，但这取决于细胞系。
   7. 一旦矩形脉冲可见，在初始电子调整之后，在软件提示用户添加单元格之后，就开始记录。
   8. 将 20 μL 单细胞悬液轻轻添加到电极的中心部分，并通过观察软件中的电阻值等待细胞贴片，然后是千兆欧姆密封。
   9. 细胞修补的实时进度可以在软件的左栏中观察到。一旦细胞"保持全细胞模式"，通过在软件中打开协议来开始记录。
   10. 将保持电位设置为−80 mV。使用Patch-Master软件运行无间隙连续记录协议，以记录来自电池的电流。
   11. 获得稳定的基线，并使用软件左侧面板上的自动灌注选项卡在指定的持续时间内切换到配体和相应的化合物应用。
   12. 使用补丁主软件获取数据。
       注意:数据在1 kHz下进行低通滤波，在100 kHz下数字化。
   13. 通过使用Nest-o-Patch软件计算电流响应的最大幅度来执行数据分析（参见 材料表）。

4. 体外 效力

注意:此过程详细介绍了MTS测定以确定药物效力。One Solution细胞增殖测定将所有必需的检测试剂组合到制备的溶液中，该溶液可以一步添加到细胞培养孔中，以评估用实验化合物处理后的细胞活力和增殖。试剂按照制造商的建议（见 材料表）复溶，等分，并储存在-20°C。 本节描述了使用该测定法测定特定细胞系中测试化合物的IC₅₀ （图4）。该MTS试剂还可用于已知浓度的大量化合物的高通量筛选。

1. 准备细胞
   注意:细胞数量取决于每个细胞系的生长和代谢。在使用测定评估任何研究性治疗之前，通过实验确定最佳细胞数。
   1. 通过胰蛋白酶消化从培养物中收获贴壁细胞，并使用Accutase（参见 材料表）解离成团或球状生长的细胞。
      注意:胶质母细胞瘤和原发性髓母细胞瘤细胞系通常需要Accutase，因为它们倾向于成团或球状生长。
   2. 计数细胞，并在75μL体积中制备每孔10,000个细胞的细胞溶液。稀释要测试的细胞数的原液。每次稀释至少准备 1 mL。
   3. 将 75 μL 的每次稀释液板放入 96 孔板中的一组连续五个孔中。在37°C和5%CO₂ 下在潮湿环境（即培养箱）中孵育过夜。
      注意:生长或代谢缓慢的细胞系（在3天内酸化其生长培养基）可能需要超过10,000个细胞作为较高的细胞数量范围，而快速生长的细胞系（通常快于20小时倍增时间）需要更少的细胞。具有高代谢的细胞系每孔可能需要少于1,000个细胞。可以调整细胞范围以确定这些细胞系的MTS测定的最佳接种密度。
2. 模拟治疗控制
   1. 每孔加入 25 μL 培养基以模拟 MTS 测定中测试化合物的添加。
      注意:在实际的MTS测定中，将25μL的4x原液的所选处理浓度（此处为GABA_A 受体调节剂QH-II-066）添加到细胞中，以获得1x最终处理浓度，总体积为每孔100μL。
   2. 在加湿环境中在37°C和5%CO₂ 下孵育48小时。这模拟了在药物存在下的标准孵育。
3. 多糖测定
   1. 解冻所需的MTS试剂等分试样。每孔加入 20 μL MTS 试剂。在37°C和5%CO₂ 在加湿环境中孵育1小时。
   2. 在室温下离心板（1,350× g5 分钟）以除去气泡，这些气泡会干扰吸光度读数。
      注意:用细针去除任何气泡。
   3. 读取490nm处的吸光度。将数据另存为 Excel 文件。
   4. 将板在5%CO₂中返回到37°C，并在测定的4小时线性范围内重复读取。
      注意:在读取吸光度之前无需重新离心。来自后续读数的数据，特别是2小时读数，对于检查细胞系代谢MTS试剂的速度可能很重要，并且有助于选择用于测定的平板细胞数。
   5. 使用 Excel 或棱镜绘制 490 nm 处的吸光度光密度 （OD） 与电镀细胞数的关系。
   6. 选择测定的细胞编号。最佳细胞数将在线性范围内且低于饱和度 （OD₄₉₀ = 1）。
      注意:对于生长缓慢的细胞，可以将最高细胞数调节为每孔20,000个细胞，并且每孔可以省略500个细胞。
4. 确定集成电路₅₀
   1. 第 1 天:将细胞铺板以进行 MTS 测定
      1. 记录研究中每条细胞系的细胞系名称和传代号。为了在测定过程中对抗蒸发，至少用1x PBS，每孔100μL填充96孔板的外周顶部和底部行以及末端左右周长柱，以在测定过程中抵消蒸发。
      2. 接种在测定开始前确定的每个细胞系的最佳细胞数。将细胞接种在每孔 75 μL 不含酚红、不含抗生素的培养基中，不含 HEPES 缓冲液。FBS可以增加到20%，以支持细胞系的生长。
         注意:使用缺乏酚红的培养基，因为酚红暴露会抑制膜渗透性。
      3. 将样品接种至少五倍的样品以获得处理浓度。使用手动或自动血细胞计数器计数细胞。
         注意:要使用手动血细胞计数器，（1）准备重悬于台盼蓝培养基中的细胞的1:1稀释度;（2）孵育5-15分钟，具体取决于细胞系;（3）将10μL台盼蓝细胞加载到血细胞计数器计数室中;（4）计算四个角和中间方格的活细胞数，并确定每个平方的平均细胞数;（5）按如下方式计算每毫升活细胞:
         每毫升活细胞数 = 平均活细胞 × 2（稀释因子） × 10⁴
      4. 使用足够的体积在不含HEPES缓冲液的无酚红、无抗生素培养基中制备所需浓度的细胞（即，每孔75μL x 每板60孔= 每板4.5 mL细胞）。
         注意:每个板都需要有一个仅中等的背景减法控件。如有必要，培养基控制可以更换PBS孔。
   2. 第 2 天:添加治疗化合物
      1. 当将 25 μL 处理溶液加入接种在 75 μL 培养基中的细胞中（= 每孔 100 μL 总体积）时，以所需最终浓度的 4 倍准备实验处理，以给出所需的最终浓度。
      2. 通过连续稀释最高浓度储备液来制备测试溶液（在这种情况下，GABA_A 受体调节剂QH-II-066）。例如，如果最终药物浓度为 5.0 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM 和 0.3125 μM，则准备从 20 μM 开始的 1:1 系列稀释液，分别获得 10 μM、5 μM、2.5 μM 和 1.25 μM 浓度。
         注意:除了仅培养基对照外，每个板还需要两个基于细胞的对照:已知浓度的未处理细胞（单独培养基）和溶剂处理的细胞（通常是DMSO）。确保载体不会影响化合物活性范围内的细胞增殖是一种很好的做法。
      3. 加入测试化合物后，将细胞在37°C和5%CO₂ 在加湿环境中孵育48小时。
   3. 第 3 天:进行细胞增殖测定 （MTS）
      1. 计算所需的MTS试剂体积（每100μL测试培养物20μL），并解冻所需体积的等分MTS试剂（参见 材料表）。
      2. 涡旋，并确保试剂在使用前完全处于溶液中。将解冻的试剂移液到无菌的 25 mL 试剂储液槽中。
      3. 将 20 μL MTS 试剂（使用多通道移液器）移液到 96 孔板的每个孔中，其中包含 100 μL 培养基中的样品。
      4. 将板在37°C和5%CO₂ 在加湿环境中孵育1小时至4小时。可以在多个时间点读取板。通常，在1小时和2小时或3小时读取板。
      5. 培养基中的气泡会导致错误的结果。在读板器中读取之前，在室温下以1,350 x g 旋转板5分钟。针头或移液器吸头可用于去除离心后残留的任何气泡。
      6. 使用合适的酶标仪或分光光度计测量490nm处的吸光度（参见 材料表）。
      7. 将数据另存为 Excel 文件。
         注意:除了被测试的化合物外，在测试化合物存在下的孵育时间将根据代谢速率和所研究细胞系的生长而变化。48小时的孵育期是大多数细胞系和测试化合物的良好起点。
5. 数据分析
   1. 在Excel文件中传输数据，并通过增加测试化合物浓度来组织每个重复的数据。平均仅培养基对照值，并从实验数据中减去该值。
   2. 通过将每次重复的对照设置为100%增殖，确定处理孔中与载体孔（或溶剂处理的对照孔）相比的细胞增殖百分比。
   3. 将 Excel 中生成的数据传输到所选程序中。作者通常使用Prism软件（见 材料表）来确定抑制细胞增殖50%的药物浓度（IC₅₀）。
   4. 在 Prism 软件中，创建一个数据表，其中 X 列作为单元格编号，Y 列作为并排子列中五个重复值的平均 OD。
   5. 分析药物治疗时，在 X 列中输入治疗浓度值。用处理化合物名称和浓度单位标记x轴。
   6. 将 Excel 分析中计算出的重复细胞活力值输入到 Y 子列中。将y轴标记为细胞增殖（%）。
   7. 使用分析工具，在 XY 分析下选择 非线性回归 （曲线拟合）。
   8. 选择 剂量反应[抑制]与归一化反应-可变斜率。
   9. 执行分析功能。查看结果表以查看 IC₅₀ 和曲线拟合图的计算最佳拟合值。如果需要，可以将图形的 x 轴更改为对数刻度。

以上是可用于表征癌细胞中离子通道的选择程序。第一个方案突出显示离子通道的染色。如前所述，在染色离子通道或就此而言，染色细胞外膜中存在的任何蛋白质时存在许多挑战。图1所示是五聚体GABAA受体亚基的染色。第二个协议强调了测试癌细胞中线粒体极化状态的结果。线粒体对细胞活力和增殖以及细胞死亡起着至关重要的作用。在哺乳动物细胞中，线粒体通过释放线粒体内膜和外膜之间的Bcl-2家族蛋白来激活细胞凋亡以响应细胞应激。在细胞质中，Bcl-2家族蛋白激活半胱天冬酶蛋白酶，介导程序性细胞死亡。质膜离子通道功能的改变可导致细胞内离子稳态的破坏，包括线粒体内的离子水平，这可能导致膜电位的丧失，从而触发细胞凋亡14。Ca2+、K+、Na+ 和 H+ 的水平是信号传导事件的重要决定因素，可触发线粒体引发的细胞死亡。图2所示用细胞渗透性带正电荷的染料TMRE染色，以标记和成像活性线粒体中的膜电位，其保持负电荷21,22。TMRE是一种红橙色染料，由于其相对负电荷而与活性线粒体结合。去极化或无活性的线粒体降低了膜电位，因此无法隔离TMRE。在该实验中，离子载体解偶联剂FCCP是一个重要的对照，因为它使线粒体膜去极化，从而防止TMRE23的积累。第三个方案强调单细胞膜片钳电生理学。图3所示是从患者来源的髓母细胞瘤细胞系D283记录的痕量的代表性记录。最后，第四个方案强调了确定癌细胞增殖状态的测定。图4所示是MTS测定如何工作的详细信息，以及与损害所研究癌细胞活力的试剂（在本例中为DAOY）孵育时的板和读数的图示。

图1:离子通道染色细胞。 （A）在D283髓母细胞瘤癌细胞中对GABRA5（GABAA受体的一个亚基）进行染色。（B）用荧光染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）处理的固定细胞，其与DNA结合。（C）合并对Gabra5和DAPI染色的髓母细胞瘤癌细胞。比例尺 = 10 μm。该图改编自Kallay等人14。请点击此处查看此图的大图。

图 2:测试线粒体的极化状态 。 （A）活D283髓母细胞瘤癌细胞用增加浓度的药物QH-II-066治疗。然后用带正电荷的细胞渗透性TMRE（四甲基罗丹明，乙酯）处理细胞，其积聚在活性（带负电荷）线粒体中。去极化或无活性的线粒体降低了膜电位，因此无法保留TMRE染料;结果，它们显示出低荧光信号。通过荧光显微镜成像;FCCP（羰基氰4-[三氟甲氧基]苯腙）。峰值:λ ex，549 nm;λem， 575 nm.比例尺 = 10 μm。 （B） 使用软件平台定量 TMRE 染色（图 A 中显示的图像）。数据表示为平均值的平均值和标准误差。该图改编自Kallay等人14。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:使用电生理学建立离子通道功能 。 （A） 显示的是 Port-a-Patch 设置或钻机，由法拉第笼 （a）、记录室 （b） 和抽吸单元（c，右）组成。（B） Port-a-Patch 钻机的俯视图，突出显示了配备灌注入口 （a）、出口 （b） 和参比电极 （c） 的记录室。（C） Port-a-Patch连接到具有自动和手动操作模式和溶液储液器的快速溶液交换灌注系统。（D）使用Port-a-Patch钻机（Nanion）和D283髓母细胞瘤癌细胞的全细胞膜片钳电生理学记录的代表性电流轨迹。施加GABA（10μM）5秒，保持电位为−80 mV。（E）使用Port-a-Patch钻机（Nanion）和D283髓母细胞瘤癌细胞与GABA（1μM）和GABAA 受体激动剂（全身麻醉）丙泊酚（50μM）共同应用，从全细胞膜片钳电生理学记录中具有代表性的电流迹线，后者增强了单独GABA诱导的电流。 请点击此处查看此图的大图。

图4:用于评估药物效力的MTS测定 。 （A）用于评估药剂效力的"MTS测定"背后的化学反应，反映在细胞增殖的减少上。通过存活的细胞还原MTS四唑，产生染料甲胺。（B） 一个 96 孔板，显示随着药物浓度的增加而进行的 MTS 测定的比色结果。在该实验中，DAOY髓母细胞瘤癌细胞用增加浓度的临床前药物KRM-II-08（GABAA 受体的正变构调节剂）处理。（C）用MTS测定法生成的剂量反应曲线（来自96孔板的定量）。 请点击此处查看此图的大图。

表1:手动与半自动和/或全自动电生理学设置的比较。

D.A.P.K. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人、总裁兼首席执行官，S.S. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人，也是 Bexion Pharmaceuticals， Inc. 的药物安全监测委员会成员。