需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

癌症细胞中离子通道的筛选

4.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65427

⸱

2023年6月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

靶向离子通道的药物干预是治疗实体瘤的一种有前景的策略。本文提供了详细的操作方案，用于表征癌细胞中离子通道的功能，并检测离子通道调节剂对癌细胞存活力的影响。

摘要

离子通道对于细胞发育和维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的紊乱可导致多种疾病或通道病的发生。癌细胞利用离子通道促进自身的发育，增强肿瘤的形成能力，并适应包含多种非癌细胞的微环境。此外，肿瘤微环境中生长因子和激素水平的升高可导致离子通道表达增加，从而促进癌细胞的增殖与存活。因此，药理学上靶向离子通道可能是一种治疗实体恶性肿瘤（包括原发性和转移性脑癌）的有前景的策略。本文描述了用于表征癌细胞中离子通道功能的实验方案，以及分析离子通道调节剂对其癌细胞存活力影响的方法。这些方法包括对细胞进行离子通道染色、检测线粒体的极化状态、利用电生理技术确定离子通道功能，以及开展细胞活力检测以评估药物效力。

引言

膜转运蛋白对于细胞间的通讯以及维持细胞稳态至关重要。在各类膜转运蛋白中，离子通道能够驱动细胞的生长与发育，并帮助细胞在复杂多变的环境中维持其正常状态。已有研究报道，离子通道在系统性肿瘤以及中枢神经系统（CNS）肿瘤的发生和发展过程中也发挥着推动和支持作用1,2。例如，KCa3.1通道参与调控膜电位和细胞体积，这在细胞周期调控中具有重要意义。研究表明，功能异常的KCa3.1通道可导致肿瘤细胞异常增殖3。此外，离子通道还可能促进癌症的转移扩散。以瞬时受体电位（TRP）通道为例，其介导Ca2+和Mg2+的内流，这种离子内流可激活多种激酶和热休克蛋白，进而调控肿瘤周围细胞外基质的结构与功能，从而在启动癌症转移过程中发挥重要作用4。

由于离子通道可能参与癌症的发生发展，因此它们也可能成为抗癌药物治疗的靶点。例如，对包括化疗和新型免疫治疗在内的治疗方式产生耐药性，与离子通道功能失调有关5,6,7。此外，离子通道正逐渐成为抑制癌症生长和发展的关键药物靶点，目前已有研究在评估已获批的小分子药物（FDA批准）的再利用，以及包括单克隆抗体在内的生物大分子药物1,2,8,9。尽管在此领域已取得诸多进展，但针对离子通道的抗癌药物研发仍处于相对初级阶段。部分原因在于研究癌细胞中离子通道所面临的独特挑战。例如，在建立电生理检测方法时，对于作用较慢的化合物，以及通道激活与药物作用之间的时间差异，存在技术上的局限性。此外，化合物的溶解度也可能阻碍研究进展，因为目前常用的大多数自动化电生理系统使用疏水性基质，可能导致化合物吸附而产生假象。进一步地，天然产物、多肽和单克隆抗体等大分子生物有机治疗药物，使用传统电生理检测方法进行筛选在技术上也具有挑战性10。最后，癌细胞的生物电特性仍远未被充分理解11。

同时，离子通道的免疫荧光染色通常具有挑战性。部分原因在于离子通道结构的复杂性及其在膜中的存在环境，这些因素会影响用于显微镜研究的抗体的制备和使用。尤其重要的是，用于染色离子通道的抗体必须经过特异性、亲和力和可重复性的验证。针对离子通道的商业抗体应根据其验证策略和已发表文献记录进行评估。实验中应包含阴性对照，以通过靶蛋白的敲低或敲除来证明不存在非特异性结合。或者，也可使用基于mRNA或蛋白质检测结果确定不含或极少表达靶蛋白的细胞系作为阴性对照。例如，本研究展示了γ-氨基丁酸（GABA）受体 亚基Gabra5在髓母细胞瘤细胞系（D283）中的定位。对D283细胞进行siRNA敲低处理，并使用另一种小脑髓母细胞瘤细胞系Daoy 细胞进行Gabra5染色，均未观察到明显染色信号（数据未显示）。

本文介绍了分析离子通道功能以及离子通道调节剂对癌细胞作用的方法。所提供的实验方案包括：（1）对细胞中的离子通道进行染色，（2）检测线粒体的极化状态，（3）利用电生理学技术鉴定离子通道功能，以及（4） 体外 药物验证。这些方案强调对A型γ-氨基丁酸（GABA）的研究A受体2,12,13,14,15,16一种氯离子通道和主要的抑制性神经递质受体。然而，本文所述方法同样适用于研究其他多种癌细胞和离子通道。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 培养细胞中离子通道的免疫标记

  1. 准备细胞和实验装置
    1. 将细胞以活跃生长的状态培养在75 cm2的培养瓶中。根据所用细胞系的倍增时间，当细胞融合度达到50%–90%时进行一次传代。
      注：本研究中使用了D283细胞，即一种第3组髓母细胞瘤细胞系。
    2. 将细胞从培养瓶中收集至离心管（15 mL或50 mL），加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA以解离贴壁细胞。室温（RT）孵育5分钟。5分钟后轻敲培养瓶三到五次，以帮助细胞脱落。加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基终止胰蛋白酶作用。
    3. 室温下以480 × g离心5分钟。小心吸除上清液，不要扰动细胞沉淀。
    4. 根据培养物的密度，用5 mL至10 mL培养基重悬细胞。
      注：细胞密度应与活跃生长状态一致，具体取决于培养瓶中细胞的融合度。应通过肉眼观察估算最佳细胞密度；具体而言，细胞融合度应在40%–90%之间，并均匀分布。
    5. 取100 µL细胞悬液，加入含有100 µL 0.4%台盼蓝的1.5 mL离心管中，用于标记非活细胞。 根据细胞系不同，在室温下孵育5–15分钟。 
    6. 使用血细胞计数板（见材料表）手动计数10 µL溶液中的细胞。计数血细胞计数板16个方格四个角的每个角落中未染色的活细胞。将平均细胞数乘以稀释倍数再乘以10,000，得到每毫升的细胞数（cells/mL）。也可使用自动细胞计数仪。
    7. 将细胞稀释至1 × 105 cells/mL，使用各细胞系指定的培养基。在6孔板的每孔中接种1.8 mL细胞悬液，每孔含一张预先用0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸按制造商说明包被的22 mm × 22 mm盖玻片（见材料表）。
      注：可考虑测试多聚-D-赖氨酸和多聚-L-赖氨酸的使用，因有文献报道不同细胞系对二者存在偏好性17,18。某些细胞系含有可降解多聚-L-赖氨酸的蛋白酶，而有报道称多聚-D-赖氨酸对某些细胞系具有毒性。相反，据报道神经元细胞（如PC12细胞）在多聚-D-赖氨酸表面生长更佳。
    8. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中过夜培养，使细胞贴附于盖玻片。使用倒置显微镜配合20倍物镜观察细胞贴附情况。
      注：在进行处理或直接免疫染色前，细胞必须完全贴附于盖玻片。此时可通过加入浓缩储备液（例如600 µL的4倍浓度溶液）或将培养基更换为含药物的1倍浓度新鲜培养基，对细胞进行药物处理（或溶剂对照处理）；随后将细胞放回培养箱继续培养最多48小时。溶剂处理组用于评估药物对目标分子表达水平和定位的影响。本研究中，D283细胞用600 µL浓度为3.2 µM的GABAA受体正向变构调节剂QH-II-06614（见材料表）处理48小时。对照组细胞则加入等体积的DMSO。
  2. 免疫标记前准备：固定、通透与封闭
    1. 用2.5 mL 1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4， 见材料表）冲洗细胞，立即吸除溶液。
    2. 使用1 mL含4%多聚甲醛（PFA）的1× PBS在室温下固定细胞1小时。
      注：尽管4% PFA是免疫染色的标准固定剂，但也可使用戊二醛或乙二醛固定膜蛋白用于免疫荧光。基于酒精的固定方法（如冰甲醇处理）可能导致形态保存较差，并造成膜蛋白丢失19,20。
    3. 在摇床上用2.0 mL 1× PBS洗涤六次（每次5分钟）。在室温下孵育1小时，封闭缓冲液由1× PBS、0.8% Triton X-100和10%与一抗宿主物种匹配的正常血清组成（也可用3% BSA或牛血清白蛋白第五组分替代正常血清）。
      注：此步骤用于阻断非特异性结合。
  3. 免疫标记
    注：加入荧光标记抗体后，应尽快进行检测以防止光漂白。与标记抗体的孵育过程需避光。使用含有自由基清除剂的封片剂可减少光漂白。封片后应将载玻片置于避光不透明容器中（4 °C）保存。成像时，可通过降低激发光强度和缩短曝光时间来最小化光漂白。
    1. 通过在150 mm培养皿底部铺上滤纸制备湿盒。用无菌蒸馏水润湿滤纸。裁剪一块适合覆盖滤纸的实验室薄膜，在其上绘制3 × 2网格，并标记以保持6孔板中盖玻片的方向。将实验室薄膜置于滤纸上，暴露上下边缘以使湿盒保持湿润。
    2. 在含3% BSA的1× PBS中，按所需稀释比例为每张盖玻片准备100 µL一抗溶液。为检测GABRA基因的蛋白产物，使用稀释比例为1:200的兔源重组单克隆一抗（Gabra5抗体，中段区域；见材料表）。
      注：为经验性确定产生最佳信噪比的一抗浓度，可在保持二抗浓度恒定的情况下，使用一系列不同稀释度的一抗进行测试。建议采用1:100、1:250、1:500、1:750和1:1,000的稀释梯度以确定最佳一抗浓度。
    3. 将6孔板中的盖玻片从封闭液转移至实验室薄膜上的对应网格位置。弃去6孔板中的封闭液，保留该板用于后续洗涤步骤。
    4. 小心地将100 µL稀释后的一抗加至每张盖玻片中央，避免液体溢出盖玻片边缘。室温孵育1小时。
    5. 向6孔板每孔加入2.5 mL 1× PBS。将盖玻片转移回6孔板中的对应孔位。
    6. 用2.5 mL 1× PBS洗涤六次，每次5分钟。
      注：洗涤过程中切勿让盖玻片干燥，否则可能导致背景荧光信号增强。
    7. 将盖玻片放回实验室薄膜上的正确位置。为每张盖玻片加入100 µL用1× PBS + 1%–5% BSA稀释的二抗。
      注：初始实验中，Alexa Fluor 488标记的二抗（见材料表）在1× PBS + 3% BSA中按1:1,000稀释。必要时可通过提高浓度以检测低丰度靶蛋白，或降低浓度以减少背景信号，从而优化二抗浓度。
    8. 后续所有步骤均应尽量减少光照，防止偶联的二抗发生光漂白。用铝箔包裹培养皿，室温孵育1小时。
    9. 将盖玻片转移回6孔板。在摇床上用2.5 mL 1× PBS洗涤六次，每次5分钟。将板倒置于水槽或废液容器上方以去除PBS。最后一次洗涤后，在孔中保留PBS以便于取出盖玻片。
    10. 为每张盖玻片标记一张显微镜载玻片。在载玻片中央滴加一滴含DAPI（用于细胞核染色）的甘油封片剂（见材料表）。
    11. 用镊子将盖玻片从孔中取出，轻轻放置于载玻片中央的封片剂液滴上。
      注：避免封片剂中产生气泡。
    12. 用小块滤纸吸除多余封片剂。用指甲油密封盖玻片边缘，待其完全干燥后再进行成像。将载玻片置于不透明塑料盒中，4 °C保存。
  4. 成像与分析
    1. 使用荧光显微镜配合40倍油镜（见材料表）采集图像。
    2. 使用合适的滤光片观察荧光图像。
    3. 注：对于Alexa Fluor 488，使用激发/发射波长为496 nm/519 nm；对于DAPI，使用激发/发射波长为358 nm/461 nm。
    4. 采集并保存数字图像文件。采用4 × 4的像素合并（binning）值以加快图像采集速度并降低背景噪声。
    5. 制备最终图像。图像可使用ImageJ或商业软件进行处理。结果如图1所示。

2. 检测线粒体的极化状态

注意：本方案采用TMRE（四甲基罗丹明乙酯）检测法标记活性线粒体的膜电位，该电位呈负电性21,22。TMRE是一种可穿透细胞膜的红橙色阳离子染料，因其带正电荷，可在活性线粒体中聚集，这是由于活性线粒体具有相对负电性的膜电位。失活或去极化的线粒体膜电位降低，无法按比例富集TMRE。FCCP（羰基氰化物-4-三氟甲氧基苯腙）是一种氧化磷酸化（OXPHOS）的离子载体解偶联剂，可使线粒体膜去极化，从而阻止TMRE的积累和滞留23。此过程如图2所示。

  1. 细胞准备与实验装置搭建
    1. 将细胞培养于75 cm²培养瓶中2 培养瓶。吸去培养基，用不含钙和镁的1×PBS冲洗细胞。
    2. 加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA以消化贴壁细胞，在室温下孵育5分钟，然后将细胞重悬于10 mL培养基中。
    3. 从培养瓶中收集细胞至15 mL离心管中。在480 x g 室温孵育5分钟。吸除培养基。
    4. 用5 mL至10 mL培养基重悬细胞，具体体积取决于原始培养物的汇合度，使细胞浓度达到血细胞计数板每个方格50–100个细胞。如有必要，调整体积以获得准确计数所需的细胞密度。
    5. 吸取100 µL细胞悬液，加入含有100 µL 0.4%台盼蓝的1.5 mL离心管中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。将细胞稀释至3 × 10⁶ 个/mL。4 细胞/mL，使用不含酚红的培养基。
      注意：使用不含酚红的DMEM培养基，因为酚红暴露会抑制膜通透性，并可能导致背景自发荧光。
    6. 将2.5 mL细胞悬液（每孔75,000个细胞）接种至6孔板中，每孔预先放置经多聚-D-赖氨酸按照制造商说明包被的22 × 22 mm盖玻片（参见 材料表).
    7. 将细胞置于加湿的5% CO₂培养箱中培养2 在37 °C下孵育过夜，以使细胞贴附于盖玻片上。
    8. 在倒置显微镜下使用20倍物镜观察细胞贴壁情况。在继续后续操作前，细胞必须完全贴附于盖玻片上。
  2. 配制储备液
    1. 配制1 mM（1,000倍浓缩液）的TMRE（分子量 = 514.96 g/mol）储备液（见 材料表)，将1 mg TMRE溶解于1.94 mL DMSO中。分装后避光保存于−20 °C。避免反复冻融。
    2. 配制50 mM（2,500倍）FCCP（分子量 = 254.17 g/mol）储备液（线粒体氧化磷酸化解偶联剂），将10 mg FCCP溶解于786.9 µL DMSO中。分装后避光保存于−20 °C。避免反复冻融。
    3. 注意：制备好的储备液是TMRE线粒体膜电位检测试剂盒的一部分（参见 材料表).
  3. 确定细胞系的 TMRE 浓度
    1. 在细胞培养基中配制500 nM的TMRE工作液。工作液需避光保存。
    2. 将TMRE加入到盖玻片上培养的细胞中，终浓度为50–200 nM。操作时，先吸除培养基，再替换为含有TMRE的培养基。
    3. 在37 °C下孵育20分钟。为便于成像，请错开处理时间，因为细胞需在活体状态下观察。
    4. 用 1× PBS 清洗细胞两次，然后将盖玻片倒置在已标记最终 TMRE 浓度的显微镜载玻片上。
    5. 立即对活细胞进行成像（峰值 Ex/m = 549 nm/575 nm
      注意：样本一旦从培养环境中取出并置于显微镜载玻片上，线粒体健康状况会迅速下降，因此需立即进行成像。作为盖玻片的替代方案，可直接在玻璃底培养皿中对细胞进行成像。
    6. 使用现有的显微镜和软件采集图像。
      注意：在线粒体膜电位探针TMRE的浓度优化过程中确定实验性显微成像参数，并在后续实验中保持相同条件，以确保数据的准确比较。本方案采用共聚焦显微镜及配套软件（见 材料表).
    7. 选择最佳的TMRE浓度，该浓度取决于细胞系。
      ​注意：通常最低的TMRE浓度即可提供最佳信号，以分辨线粒体TMRE水平的变化，该浓度可产生均匀且易于检测的荧光信号。
  4. 检测细胞的极化状态
    1. 检测准备
      1. 配制所需浓度的处理药物储备液，并制备含有待检测化合物终浓度的培养基。对于FCCP，储备液浓度应为20 mM（用DMSO将50 mM的储备液稀释获得）。
      2. 一次处理一个盖玻片，向细胞中加入 1.8 mL 培养基和待测化合物。
      3. 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞与待测化合物共同孵育2 在加湿环境中孵育所需时间。
        注意：处理时间将根据测试化合物改变线粒体膜电位的作用机制而有所不同。对于FCCP等能够快速直接使线粒体膜电位去极化的强效质子载体，需在处理后短时间内立即进行分析（数分钟内）。相比之下，那些通过间接影响线粒体电子传递链功能的化合物（例如改变蛋白质激活、蛋白质周转或需要蛋白质合成的化合物），其处理效应可能需要更长时间才能显现。
      4. 孵育期间，打开显微镜并将其设置为预定的最佳成像参数，包括增益、激光强度、图像采集速率、平均次数和曝光时间。
      5. 药物处理期结束后，向对照组和药物处理组细胞中各加入 200 µL 10 倍浓度的 TMRE（上述已确定的最佳浓度）。
      6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育15-30分钟2 在 湿润环境。轻柔吸去培养基，并用1×PBS冲洗细胞一次。
      7. 重复用1×PBS洗涤一次，以避免细胞培养基或处理化合物引起的背景干扰，并将盖玻片倒置在已标记处理条件的显微镜载玻片上。
      8. 在 E 点对活细胞进行成像x/m = 549 nm/575 nm。使用共聚焦显微镜，在细胞完整性丧失之前，以高速成像模式（512 像素 × 512 像素，平均次数 = 4）采集多个 z 轴层扫视野。
      9. 保存并储存图像文件以供分析。对下一个实验条件重复该步骤。
    2. 实验对照
      1. 使用无处理（阴性）对照，操作步骤同上（3.1.1–3.1.8），但在培养基中不添加待测化合物。
      2. 使用质子载体化合物FCCP作为线粒体膜电位破坏（阳性）对照。加入1.8 mL的20 µM FCCP（参见 材料表) 加入培养基中。按照上述步骤（3.1.1–3.1.2）以及步骤 3.1.3–3.1.8 中所述的细胞成像方法，在 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育 10 分钟2 在使用TMRE染色前，置于加湿环境中。
        注意：这些实验需要设置阳性和阴性对照。
    3. 定量分析
      1. 从每个z轴堆栈中心区域的一个代表性图像中，测量单个细胞的捕获像素强度。本研究中选择了一个单一的焦平面以方便分析。
      2. 分析每种处理条件下至少30个完整细胞的像素强度。使用Excel或Prism计算每种处理条件下像素强度的平均值，并以均值±标准误的形式用柱状图展示结果。
        ​注意：ImageJ 也可用于荧光定量。此外，TMRE 染色荧光还可使用商业软件平台进行定量。

3. 使用电生理学建立离子通道功能

注意：本节中的实验步骤描述了使用自动化膜片钳技术在癌细胞系中筛选测试化合物的方法（图3）。

  1. 细胞准备
    1. 从健康的细胞培养物中收获细胞，确保无死亡细胞和/或细胞过度生长。使用化学细胞解离溶液 TrypLE 或手动细胞刮刀收获贴壁和成簇的细胞。对以团块或球状形式生长的细胞进行解离，这类生长方式在中枢神经系统癌细胞中尤为常见。
      注意：轻柔地解离细胞有助于维持对离子传导至关重要的膜蛋白完整性。
    2. 在室温下以 561 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于不含酚红的 DMEM 培养基中，加入 HEPES、青霉素/链霉素、20% FBS 和 4 mM L-谷氨酰胺（参见材料表），并维持在 37 °C。
      注意：使用不含酚红的 DMEM 培养基，因为酚红暴露会抑制膜通透性。
    3. 将细胞以低密度接种于多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，使单个细胞之间保持分离。
      注意：此处使用多聚-L-赖氨酸而非多聚-D-赖氨酸，因为多聚-L-赖氨酸具有更优的包被性能。
    4. 将细胞置于湿润培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 12 至 24 小时（最佳时间需自行确定），然后开始记录。
  2. 电生理记录
    1. 移除盖玻片上的培养基。用 1× PBS 轻柔清洗细胞两次。加入约 300 µL TrypLE 溶液。使用移液器轻柔吹打 4 至 5 次，直至细胞完全解离。
    2. 加入无血清培养基（DMEM，不含酚红），调整细胞浓度至每毫升至少含 100 万个细胞。使用 1 mL 移液器进一步分散细胞，获得无细胞团块的单细胞悬液。
    3. 将细胞悬液转移至 1 mL 离心管中。在 4 °C 下孵育 10 分钟以稳定细胞膜。将细胞置于摇床上（轻柔振荡）持续旋转，避免形成细胞团块。
    4. 准备 Port-a-Patch 系统（参见材料表）。打开计算机、放大器和灌流系统。启动 Patch-Master 软件，并创建新文件。
    5. 将缓冲液（细胞外液和内液）恢复至室温，然后分别装入对应的灌流管中。
      注意：GABAA 受体的记录需要使用"细胞外（浴槽）溶液"（含 161 mM NaCl、3 mM KCl、1 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、10 mM HEPES 和 6 mM D-葡萄糖，用 NaOH 调节 pH 至 7.4）以及"内液"（含 120 mM KCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA 和 10 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.2）。
    6. 用 5 µL 内液填充电极芯片（厂家提供）底部，将电极芯片放置于 Port-a-Patch 的法拉第罩顶部。向芯片中加入 10 µL 外液，通过 Patch-Master 软件在示波器上观察矩形脉冲信号（参见材料表）。
      注意：电阻值可能在 2–3 MΩ 范围内，但具体数值取决于细胞系。
    7. 在完成初始电子调节、软件提示用户加样且矩形脉冲可见后，开始记录。
    8. 轻柔地将 20 µL 单细胞悬液加至电极中央区域，通过软件监测电阻值变化，等待细胞贴附并形成吉欧姆封接。
    9. 可在软件左侧栏观察细胞贴附的实时进程。当细胞进入"全细胞模式"并保持稳定后，通过软件中打开一个记录协议开始记录。
    10. 将钳制电位设为 −80 mV。使用 Patch-Master 软件运行无间隙连续记录程序，以记录细胞电流。
    11. 获得稳定的基线后，通过软件左侧面板的自动灌流功能切换至配体及相应化合物的应用，并持续指定时间。
    12. 使用 Patch-Master 软件采集数据。
      注意：数据经 1 kHz 低通滤波，采样频率为 100 kHz。
    13. 使用 Nest-o-Patch 软件分析数据，计算电流反应的最大振幅（参见材料表）。

4. 体外 效价

注意：本实验详细说明了一种 MTS 法，用于测定药物效力。One Solution 细胞增殖检测试剂盒将所有必需的检测试剂预混成单一溶液，可一步加入细胞培养孔中，用于评估实验化合物处理后细胞的活力与增殖情况。该试剂应根据生产商的建议（参见材料表）进行重悬，分装后于 −20 °C 保存。本部分描述了该检测方法在特定细胞系中测定受试化合物 IC50 值的应用（图 4）。该 MTS 试剂也可用于在已知浓度下对大量化合物进行高通量筛选。

  1. 细胞的准备
    注意：细胞数量取决于每种细胞系的生长和代谢特性。在使用该检测方法评估任何实验处理之前，需通过实验预先确定最佳细胞数量。
    1. 通过胰蛋白酶消化法收集培养物中的贴壁细胞，并使用Accutase（参见 材料表) 以解离成团或成球生长的细胞。
      注意：胶质母细胞瘤和原代髓母细胞瘤细胞系通常需要使用Accutase，因为它们 tends to 以团块或球状形式生长。
    2. 计数细胞，并配制每孔含10,000个细胞、体积为75 µL的细胞悬液。根据待检测的细胞数量对原液进行稀释，每种稀释度至少准备1 mL。
    3. 将每种稀释液各 75 µL 加入 96 孔板中连续的五个孔内。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 在湿润环境中过夜（例如，置于培养箱内）。
      注意：生长缓慢或代谢较慢的细胞系（使培养基酸化所需时间超过3天）可能需要超过10,000个细胞作为较高的细胞接种数量范围；而生长迅速的细胞系（通常倍增时间短于20小时）则需要较少的细胞。代谢活性高的细胞系每孔可能需要少于1,000个细胞。可根据具体情况调整细胞数量范围，以确定这些细胞系在MTS实验中的最佳接种密度。
  2. 模拟处理对照
    1. 每孔加入 25 µL 培养基，以模拟在 MTS 实验中添加待测化合物的操作。
      注意：在实际的 MTS 实验中，加入 25 µL 浓度为 4 倍储备液的待测化合物处理液（此处为 GABA）A 受体调节剂（QH-II-066）将被加入细胞中，使每孔总体积为100 µL，终浓度为1x处理浓度。
    2. 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育2 在加湿环境中孵育 48 h。这模拟了药物存在条件下的标准孵育过程。
  3. MTS 检测
    1. 解冻所需体积的 MTS 试剂。每孔加入 20 µL MTS 试剂。于 37 °C、5 % CO₂ 条件下孵育2 在加湿环境中孵育1小时。
    2. 离心平板（1,350 × g 室温下静置5分钟以去除气泡，以免干扰吸光度读数。
      注意：使用细针头去除任何气泡。
    3. 在490 nm处读取吸光度。将数据保存为Excel文件。
    4. 将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2并在检测的4小时线性范围内重复读取。
      注意：读取吸光度前无需再次离心。后续时间点的读数，尤其是2小时的读数，对于分析细胞系代谢MTS试剂的速度具有重要意义，并有助于确定进行检测时接种至培养板的细胞数量。
    5. 绘制在 490 nm 处的吸光度光密度（OD）490）与使用 Excel 或 Prism 绘制的接种细胞数量之间的关系。
    6. 选择检测所需的细胞数量。最佳细胞数量应处于线性范围内且低于饱和值（OD490 = 1).
      注意：对于生长缓慢的细胞，可将接种的最高细胞数量调整为每孔20,000个，每孔500个细胞的组可省略。
  4. 确定IC50
    1. 第1天：为MTS实验接种细胞
      1. 记录研究中每种细胞系的名称和传代次数。为防止检测过程中液体蒸发，至少在96孔板的外周顶部和底部行以及左右两侧外周列的每个孔中加入100 µL的1×PBS。
      2. 根据实验前确定的每种细胞系的最佳数量进行接种。将细胞接种于不含酚红、抗生素和HEPES缓冲液的培养基中，每孔75 µL。可将胎牛血清（FBS）浓度提高至20%以支持细胞系的生长。
        注意：使用不含酚红的培养基，因为酚红暴露会抑制膜通透性。
      3. 以至少五个复孔接种样品用于处理浓度实验。使用手动或自动细胞计数板对细胞进行计数。
        注意：使用手动血细胞计数板时，（1）将悬浮于培养基中的细胞与台盼蓝按1:1比例稀释；（2）根据细胞系不同，室温孵育5–15分钟；（3）取10 µL台盼蓝染色后的细胞悬液加入血细胞计数板计数室；（4）计数四个角及中央五个大方格内的活细胞，计算每个大方格的平均细胞数；（5）按下式计算每毫升中的活细胞数量：
        ​每毫升活细胞数 = 平均活细胞数 × 2（稀释倍数） × 104
      4. 使用足量体积的不含酚红、不含抗生素且不含有HEPES缓冲液的培养基来制备所需浓度的细胞悬液（例如，每孔75 µL × 每板60孔 = 每板4.5 mL细胞悬液）。
        注意：每块板都需要设置仅含培养基的对照，用于背景扣除。如有必要，培养基对照可替代PBS孔。
    2. 第2天：加入处理化合物
      1. 将实验处理液配制为所需最终浓度的4倍浓度，以便在向每孔含75 µL培养基的细胞中加入25 µL处理液后，达到预期的最终浓度（每孔总体积为100 µL）。
      2. 配制测试溶液（本实验中为 GABA）A 通过将最高浓度的储备液进行系列稀释，制备受体调节剂QH-II-066。例如，若最终药物浓度分别为5.0 µM、2.5 µM、1.25 µM、0.625 µM和0.3125 µM，则从20 µM开始进行1:1系列稀释，依次获得10 µM、5 µM、2.5 µM和1.25 µM的浓度。
        注意：除仅含培养基的对照外，每块板还需设置两个基于细胞的对照：未处理细胞（仅培养基）和溶剂处理细胞（通常为DMSO），后者需使用已知浓度的溶剂。建议确保在化合物活性浓度范围内，所用溶剂不会影响细胞增殖。
      3. 加入待测化合物后，在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 在加湿环境中孵育 48 小时。
    3. 第3天：进行细胞增殖检测（MTS）
      1. 计算所需 MTS 试剂的体积（每 100 µL 检测培养液需 20 µL），并解冻相应体积的分装 MTS 试剂（参见 材料表).
      2. 涡旋混匀，确保试剂完全溶解后再使用。将解冻后的试剂用移液器转移至无菌的25 mL试剂储液槽中。
      3. 向含有100 µL培养基样品的96孔板各孔中加入20 µL MTS试剂（使用多通道移液器）。
      4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育培养板2 在湿润环境中 1 小时至 4 小时。可在多个时间点读板。通常在 1 小时和 2 小时或 3 小时读板。
      5. 培养基中的气泡可能导致错误结果。在使用酶标仪读数前，将酶标板在1,350 x g 室温下静置5分钟。可使用针头或移液器吸头去除离心后残留的气泡。
      6. 使用合适的酶标仪或分光光度计在 490 nm 处测定吸光度（参见 材料表).
      7. 将数据保存为 Excel 文件。
        注意：在测试化合物存在下的孵育时间将根据所研究细胞系的代谢速率、生长情况以及被测化合物的性质而有所不同。对于大多数细胞系和测试化合物，48小时的孵育时间是一个合适的起始点。
  5. 数据分析
    1. 将数据导入 Excel 文件中，并按测试化合物浓度递增的顺序整理每个重复实验的数据。计算仅含培养基的对照组平均值，并从实验数据中减去该值。
    2. 将对照组（溶剂处理的对照孔）的细胞增殖率设定为100%，据此计算各重复样本中处理孔的细胞增殖百分比。
    3. 将 Excel 中生成的数据导入所选程序。作者通常使用 Prism 软件（参见 材料表) 以确定抑制细胞增殖50%的药物浓度（IC50).
    4. 在 Prism 软件中，创建一个数据表，将 X 列设为细胞数量，Y 列设为五个并列子列重复值的平均吸光度（OD）。
    5. 在分析药物处理时，将处理浓度值输入 X 列。以处理化合物名称和浓度单位标记横轴。
    6. 将从 Excel 分析中计算出的重复细胞活力值输入到 Y 子列中。将 y 轴标记为细胞增殖（%）。
    7. 使用分析工具进行选择 非线性回归 （曲线拟合）在XY分析下。
    8. 选择 剂量-反应（抑制）与标准化反应的关系- 可变斜率
    9. 执行分析功能。查看结果表格，以获取计算得出的IC最佳拟合值50 以及曲线拟合图。如有需要，可将图表的横坐标调整为对数刻度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

上述为可用于表征癌细胞中离子通道的部分实验步骤。第一个方案重点介绍了离子通道的染色方法。如文中所述，在对位于细胞外膜的离子通道或任何其他蛋白质进行染色时，存在诸多技术挑战。图中所示为 图1 是五聚体 GABA 受体亚基的染色A 受体。第二个方案重点展示了对癌细胞中线粒体极化状态的检测结果。线粒体在细胞存活与增殖以及细胞死亡过程中发挥着关键作用。在哺乳动物细胞中，当细胞受到应激刺激时，线粒体通过释放位于内膜与外膜之间的Bcl-2家族蛋白来激活凋亡过程。这些Bcl-2家族蛋白在细胞质中进一步激活caspase蛋白酶，从而介导程序性细胞死亡。细胞膜离子通道功能的改变可导致细胞内离子稳态失衡，包括线粒体内离子水平的变化，进而引起膜电位的丧失，最终触发细胞凋亡。14. Ca水平2+，K+，Na+，和 H+ 是信号传导事件中的重要决定因素，可触发线粒体启动的细胞死亡。如图所示 图2

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

离子通道功能的改变会影响细胞内信号级联反应，从而影响细胞的整体功能。在过去十年中，人们越来越清楚地认识到，离子通道在癌细胞的生长和转移过程中具有重要作用。重要的是，许多离子通道是已获批治疗多种疾病的药物的主要靶点24。研究人员已开始探索离子通道是否可作为抗癌治疗的靶点，初步结果令人鼓舞2,16,25。目前，该领域才刚刚开始探究离子通道在癌症发生发展及作为治疗靶点方面的作用，而这两个方向的前景均十分广阔。

本文提供了分析癌细胞中离子通道并确定该通道是否为治疗靶点的详细步骤。这些实验方法可作为研究癌细胞中离子通道的指导。文中描述了多种方法，包括癌细胞中离子通道的可视化、离子通道调控对癌细胞极化状态影响的测定、利用电生理学分析离子通道功能的不同策略，以及癌细胞存活能力的检测。

免疫荧光染色可用于检测离...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

D.A.P.K. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人、总裁兼首席执行官。S.S. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人，并担任 Bexion Pharmaceuticals, Inc. 药物安全监测委员会成员。

致谢

作者感谢Thomas E. & Pamela M. Mischell家族基金会对S.S.的支持，以及Harold C. Schott基金会对S.S.在UC医学院设立的Harold C. Schott讲席教授职位的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABS SpectraMax 酶标仪Molecular DevicesABS
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 488InvitrogenA32723山羊抗兔
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062100倍
B27 添加剂Gibco12587-010不含维生素A
生物安全柜LABCONCO302381101II级，A2型
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP1606-100
CO2 培养箱Fisher Scientific13-998-211Heracell VIOS 160i
氯化钙Fisher ScientificC7902二水合物
细胞培养皿，150 mmFisher Scientific12-600-004细胞培养处理
细胞培养瓶，75 cm2Fisher Scientific430641U细胞培养处理
细胞培养板，6孔Fisher Scientific353046细胞培养处理
细胞培养板，96孔Fisher Scientific353072细胞培养处理
离心机EppendorfEP-5804R带制冷功能
Corning CoolCellFisher Scientific07-210-0006
盖玻片，22 × 22 mmFisher Scientific12-553-450Corning品牌
D283 MedATCCHTB-185
DABCO 封片剂EMS17989-97
D-葡萄糖Sigma Life SciencesD9434
二甲基亚砜Sigma AldrichD2650细胞培养级
DMEM/F12 基础培养基Fisher Scientific11330-032含酚红
DMEM/F12，无酚红Fisher Scientific21041-025
EGTASigma AldrichE4378
表皮生长因子STEMCELL78006.1
FCCPAbcamAB120081
胎牛血清，经鉴定Gibco10437-028
碱性成纤维细胞生长因子MilliporeGF003
GARBA5 抗体AvivaARP30687_P050兔多克隆抗体
GlutamaxGibco35050-061
甘油封片剂EMS17989-60含DAPI和DABCO
血细胞计数板Millipore Sigma
肝素STEMCELL7980
HEPESHyCloneSH3023701溶液
HEPESFisher ScientificBP310-500固体
ImageJ开放平台含Fiji插件
Immuno Mount DAPIEMS17989-97
KRM-II-08实验化合物，无法从商业渠道获得
Leica Application Suite XLeica Microsystems
白血病抑制因子NovusN276314100U
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
氯化镁Sigma AldrichM9272六水合物
共聚焦显微镜LeicaSP8
光学显微镜VWR76382-982DMiL 倒置显微镜
MTS - Promega 一步法试剂PromegaG3581
多通道移液器，0.5–10 µLEppendorfZ683914
多通道移液器，10–100 µLEppendorfZ683930
多通道移液器，30–300 µLEppendorfZ683957
Nest-O-PatchHeka
Neurobasal-A 培养基Gibco10888022不含维生素A
Neurobasal-A 培养基Gibco12348-017无酚红
非必需氨基酸Gibco11140-050
NOR-QH-II-66实验化合物，无法从商业渠道获得
ParafilmFisher Scientific50-998-9444英寸宽
多聚甲醛EMSRT-15710
PATHCHMASTERHeka
青霉素-链霉素Gibco15140-122
灌流系统Nanion4000120
PFAEMSRT-15710
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificAAJ75889K2试剂级
聚-D-赖氨酸Fisher ScientificA3890401
聚-L-赖氨酸Sigma Life SciencesP4707
Port-a-PatchNanion21000072
氯化钾Sigma Life SciencesP5405
一抗InvitrogenMA5-34653兔单克隆抗体
PrismGraphPad
丙泊酚Fisher ScientificNC07586761 mL 安瓿
QH-II-66实验化合物，无法从商业渠道获得
试剂储液槽VWR89094-664无菌
载玻片，75 × 25 mmFisher Scientific12-544-7单面磨砂
碳酸氢钠Corning25-035-Cl
氯化钠Fisher ScientificS271-3
丙酮酸钠Gibco11360-070
Synth-a-Freeze 冷冻保存培养基GibcoR00550用于冷冻保存
TMREFisher Scientific50-196-4741试剂
TMRE 试剂盒AbcamAB113852试剂盒
吐温X-100Sigma AldrichNC0704309
台盼蓝Gibco15-250-061溶液，0.4%
胰蛋白酶/EDTAGibco25200-072溶液，0.25%
涡旋混合器VWR97043-562
Whatman 滤纸Fisher Scientific09-927-841

参考文献

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437(2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109(2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48(2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606(2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376(2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958(2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IC (2022).
  25. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875(2019).
  26. Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  27. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  28. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  29. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573(2011).
  30. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  31. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202(2010).
  32. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  33. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  34. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  35. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  36. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

GABAA TMRE MTS
癌症细胞中离子通道的筛选
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。