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方法文章

癌症细胞中离子通道的筛选

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DOI：

10.3791/65427

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2023年6月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

靶向离子通道的药物干预是治疗实体瘤的一种有前景的策略。本文提供了详细的操作方案，用于表征癌细胞中离子通道的功能，并检测离子通道调节剂对癌细胞存活力的影响。

摘要

离子通道对于细胞发育和维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的紊乱可导致多种疾病或通道病的发生。癌细胞利用离子通道促进自身的发育，增强肿瘤的形成能力，并适应包含多种非癌细胞的微环境。此外，肿瘤微环境中生长因子和激素水平的升高可导致离子通道表达增加，从而促进癌细胞的增殖与存活。因此，药理学上靶向离子通道可能是一种治疗实体恶性肿瘤（包括原发性和转移性脑癌）的有前景的策略。本文描述了用于表征癌细胞中离子通道功能的实验方案，以及分析离子通道调节剂对其癌细胞存活力影响的方法。这些方法包括对细胞进行离子通道染色、检测线粒体的极化状态、利用电生理技术确定离子通道功能，以及开展细胞活力检测以评估药物效力。

引言

膜转运蛋白对于细胞间的通讯以及维持细胞稳态至关重要。在各类膜转运蛋白中，离子通道能够驱动细胞的生长与发育，并帮助细胞在复杂多变的环境中维持其正常状态。已有研究报道，离子通道在系统性肿瘤以及中枢神经系统（CNS）肿瘤的发生和发展过程中也发挥着推动和支持作用1,2。例如，KCa3.1通道参与调控膜电位和细胞体积，这在细胞周期调控中具有重要意义。研究表明，功能异常的KCa3.1通道可导致肿瘤细胞异常增殖3。此外，离子通道还可能促进癌症的转移扩散。以瞬时受体电位（TRP）通道为例，其介导Ca2+和Mg2+的内流，这种离子内流可激活多种激酶和热休克蛋白，进而调控肿瘤周围细胞外基质的结构与功能，从而在启动癌症转移过程中发挥重要作用4。

由于离子通道可能参与癌症的发生发展，因此它们也可能成为抗癌药物治疗的靶点。例如，对包括化疗和新型免疫治疗在内的治疗方式产生耐药性，与离子通道功能失调有关5,6,7。此外，离子通道正逐渐成为抑制癌症生长和发展的关键药物靶....

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方案

1. 培养细胞中离子通道的免疫标记

  1. 准备细胞和实验装置
    1. 将细胞以活跃生长的状态培养在75 cm2的培养瓶中。根据所用细胞系的倍增时间，当细胞融合度达到50%–90%时进行一次传代。
      注：本研究中使用了D283细胞，即一种第3组髓母细胞瘤细胞系。
    2. 将细胞从培养瓶中收集至离心管（15 mL或50 mL），加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA以解离贴壁细胞。室温（RT）孵育5分钟。5分钟后轻敲培养瓶三到五次，以帮助细胞脱落。加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基终止胰蛋白酶作用。
    3. 室温下以480 × g离心5分钟。小心吸除上清液，不要扰动细胞沉淀。
    4. 根据培养物的密度，用5 mL至10 mL培养基重悬细胞。
      注：细胞密度应与活跃生长状态一致，具体取决于培养瓶中细胞的融合度。应通过肉眼观察估算最佳细胞密度；具体而言，细胞融合度应在40%–90%之间，并均匀分布。
    5. 取100 µL细胞悬液，加入含有100 µL 0.4%台盼蓝的1.5 mL离心管中，用于标记非活细胞。 根据细胞系不同，在室温下孵育5–15分钟。 
    6. 使用血细胞计数板（见材料表）手动计数10 µL溶液中的细胞。计数血细胞计数板16个方格四个角的每个角落中未染色的活细胞。将平均细胞数乘以稀....

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结果

上述为可用于表征癌细胞中离子通道的部分实验步骤。第一个方案重点介绍了离子通道的染色方法。如文中所述，在对位于细胞外膜的离子通道或任何其他蛋白质进行染色时，存在诸多技术挑战。图中所示为 图1 是五聚体 GABA 受体亚基的染色A 受体。第二个方案重点展示了对癌细胞中线粒体极化状态的检测结果。线粒体在细胞存活与增殖以及细胞死亡过程中发挥着关键作用。在哺乳动物细胞中，当细胞受到应激刺激时，线粒体通过释放位于内膜与外膜之间的Bcl-2家族蛋白来激活凋亡过程。这些Bcl-2家族蛋白在细胞质中进一步激活caspase蛋白酶，从而介导程序性细胞死亡。细胞膜离子通道功能的改变可导致细胞内离子稳态失衡，包括线粒体内离子水平的变化，进而引起膜电位的丧失，最终触发细胞凋亡。14. Ca水平2+，K+，Na+，和 H+ 是信号传导事件中的重要决定因素，可触发线粒体启动的细胞死亡。如图所示 图2

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讨论

离子通道功能的改变会影响细胞内信号级联反应，从而影响细胞的整体功能。在过去十年中，人们越来越清楚地认识到，离子通道在癌细胞的生长和转移过程中具有重要作用。重要的是，许多离子通道是已获批治疗多种疾病的药物的主要靶点24。研究人员已开始探索离子通道是否可作为抗癌治疗的靶点，初步结果令人鼓舞2,16,25。目前，该领域才刚刚开始探究离子通道在癌症发生发展及作为治疗靶点方面的作用，而这两个方向的前景均十分广阔。

本文提供了分析癌细胞中离子通道并确定该通道是否为治疗靶点的详细步骤。这些实验方法可作为研究癌细胞中离子通道的指导。文中描述了多种方法，包括癌细胞中离子通道的可视化、离子通道调控对癌细胞极化状态影响的测定、利用电生理学分析离子通道功能的不同策略，以及癌细胞存活能力的检测。

免疫荧光染色可用于检测离.......

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披露

D.A.P.K. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人、总裁兼首席执行官。S.S. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人，并担任 Bexion Pharmaceuticals, Inc. 药物安全监测委员会成员。

致谢

作者感谢Thomas E. & Pamela M. Mischell家族基金会对S.S.的支持，以及Harold C. Schott基金会对S.S.在UC医学院设立的Harold C. Schott讲席教授职位的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABS SpectraMax 酶标仪Molecular DevicesABS
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 488InvitrogenA32723山羊抗兔
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062100倍
B27 添加剂Gibco12587-010不含维生素A
生物安全柜LABCONCO302381101II级，A2型
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP1606-100
CO2 培养箱Fisher Scientific13-998-211Heracell VIOS 160i
氯化钙Fisher ScientificC7902二水合物
细胞培养皿，150 mmFisher Scientific12-600-004细胞培养处理
细胞培养瓶，75 cm2Fisher Scientific430641U细胞培养处理
细胞培养板，6孔Fisher Scientific353046细胞培养处理
细胞培养板，96孔Fisher Scientific353072细胞培养处理
离心机EppendorfEP-5804R带制冷功能
Corning CoolCellFisher Scientific07-210-0006
盖玻片，22 × 22 mmFisher Scientific12-553-450Corning品牌
D283 MedATCCHTB-185
DABCO 封片剂EMS17989-97
D-葡萄糖Sigma Life SciencesD9434
二甲基亚砜Sigma AldrichD2650细胞培养级
DMEM/F12 基础培养基Fisher Scientific11330-032含酚红
DMEM/F12，无酚红Fisher Scientific21041-025
EGTASigma AldrichE4378
表皮生长因子STEMCELL78006.1
FCCPAbcamAB120081
胎牛血清，经鉴定Gibco10437-028
碱性成纤维细胞生长因子MilliporeGF003
GARBA5 抗体AvivaARP30687_P050兔多克隆抗体
GlutamaxGibco35050-061
甘油封片剂EMS17989-60含DAPI和DABCO
血细胞计数板Millipore Sigma
肝素STEMCELL7980
HEPESHyCloneSH3023701溶液
HEPESFisher ScientificBP310-500固体
ImageJ开放平台含Fiji插件
Immuno Mount DAPIEMS17989-97
KRM-II-08实验化合物，无法从商业渠道获得
Leica Application Suite XLeica Microsystems
白血病抑制因子NovusN276314100U
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
氯化镁Sigma AldrichM9272六水合物
共聚焦显微镜LeicaSP8
光学显微镜VWR76382-982DMiL 倒置显微镜
MTS - Promega 一步法试剂PromegaG3581
多通道移液器，0.5–10 µLEppendorfZ683914
多通道移液器，10–100 µLEppendorfZ683930
多通道移液器，30–300 µLEppendorfZ683957
Nest-O-PatchHeka
Neurobasal-A 培养基Gibco10888022不含维生素A
Neurobasal-A 培养基Gibco12348-017无酚红
非必需氨基酸Gibco11140-050
NOR-QH-II-66实验化合物，无法从商业渠道获得
ParafilmFisher Scientific50-998-9444英寸宽
多聚甲醛EMSRT-15710
PATHCHMASTERHeka
青霉素-链霉素Gibco15140-122
灌流系统Nanion4000120
PFAEMSRT-15710
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificAAJ75889K2试剂级
聚-D-赖氨酸Fisher ScientificA3890401
聚-L-赖氨酸Sigma Life SciencesP4707
Port-a-PatchNanion21000072
氯化钾Sigma Life SciencesP5405
一抗InvitrogenMA5-34653兔单克隆抗体
PrismGraphPad
丙泊酚Fisher ScientificNC07586761 mL 安瓿
QH-II-66实验化合物，无法从商业渠道获得
试剂储液槽VWR89094-664无菌
载玻片，75 × 25 mmFisher Scientific12-544-7单面磨砂
碳酸氢钠Corning25-035-Cl
氯化钠Fisher ScientificS271-3
丙酮酸钠Gibco11360-070
Synth-a-Freeze 冷冻保存培养基GibcoR00550用于冷冻保存
TMREFisher Scientific50-196-4741试剂
TMRE 试剂盒AbcamAB113852试剂盒
吐温X-100Sigma AldrichNC0704309
台盼蓝Gibco15-250-061溶液，0.4%
胰蛋白酶/EDTAGibco25200-072溶液，0.25%
涡旋混合器VWR97043-562
Whatman 滤纸Fisher Scientific09-927-841

参考文献

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment....

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