小鼠骨骼肌的普通散装培养物，以概括生态位和干细胞静止

运动、呼吸、新陈代谢、身体姿势和体温维持都依赖于骨骼肌，因此骨骼肌功能障碍会导致使人衰弱的病症（即肌病、肌营养不良等）。¹. 鉴于其基本功能和丰富性，骨骼肌引起了全球研究实验室的关注，这些实验室致力于了解支持正常肌肉功能并可作为治疗靶点的关键方面。此外，骨骼肌是研究再生和干细胞功能的广泛使用模型，因为健康的肌肉在完全损伤和退化后可以完全自我修复，这主要是由于其驻留的干细胞²;这些也称为卫星细胞，位于肌纤维外围的基底层下³.

成人骨骼肌的核心细胞是肌纤维（长合胞体多核细胞）和卫星细胞（具有肌源性潜力的干细胞，在损伤激活它们之前处于静止状态）。后者细胞是肌肉再生的中心细胞，在没有它们的情况下，这个过程不会发生4,5,6,7。在它们的直接微环境中，有多种细胞类型和分子因子向它们发出信号。这个生态位在整个发育过程中逐渐建立，直到成年⁸.成人肌肉含有多种细胞类型（内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、纤维脂肪祖细胞-FAPs、调节性T细胞等）^9,10和细胞外基质成分（层粘连蛋白，胶原蛋白，纤连蛋白，原纤维蛋白，骨膜蛋白等）¹¹ 在健康、疾病和再生的背景下相互相互作用以及与卫星细胞相互作用。

在实验环境中保留这个复杂的生态位是基本的，但具有挑战性。同样困难的是保持或恢复静止状态，这是对卫星小区至关重要的细胞状态⁹。已经引入了几种方法来部分应对这些挑战，每种方法都有其优点和缺点（详见讨论部分）。在这里，提出了一种可以部分克服这两个障碍的方法。肌肉最初被收获，然后在异质细胞混合物被放入培养物之前通过机械和酶促分解。在培养过程中，检测到生态位的许多细胞类型，并观察到已恢复静止的卫星细胞。作为协议的最后一步，介绍了允许通过使用普遍接受的标记物检测每种细胞类型的免疫荧光步骤。

所有实验均符合法国和欧盟的动物法规，特别是指令2010/63/UE。动物被饲养在动物设施的受控和富集环境中，认证编号为A94 028 379和D94-028-028;它们仅由授权的研究人员和动物看护人处理，并由动物饲养人员目视检查其一生中是否有不适迹象。他们在解剖前因颈椎脱位而被安乐死。在动物的一生中没有进行任何介入手术;因此，没有必要获得伦理委员会和法国高等教育、研究和创新部对该程序的批准。事实上，根据 2010/63/UE 指令，安乐死和尸后解剖不需要伦理许可。本手稿中介绍的结果来自野生型C57BL / 6NRj系（见 材料表）和转基因 Tg:Pax7-nGFP 系¹²（由我们团队培育）。该方案应用于8-12周龄的雄性和雌性小鼠。

1.试剂和设备制备预消化

1. 用70%乙醇喷洒解剖工具（直剪刀和弯剪刀，镊子，见 材料表），并用纸擦干。在软木板上涂上铝箔，并在附近放置 10 厘米的培养皿（每只动物一个）。将纸张和 70% 乙醇放在触手可及的地方。
   注意:在解剖结束时，用水冲洗解剖工具，然后用70%乙醇喷洒，并用纸擦干。
2. 将旋转水浴设置为37°C，并通过将DMEM与1%青霉素 - 链霉素，0.5U / mL胶原酶，3U / mL分散酶（参见 材料表）和0.2%BSA在50mL管中混合来制备消化混合物（20mL /动物）。
3. 将消化混合物通过细胞培养罩中的0.22μm过滤器。
   注意:建议每次都新鲜准备消化混合物。

2. 酶解后的试剂和设备准备

1. 消化后，混合物可以冷冻或培养。冷冻时，准备 10% DMSO:90% 胎牛血清 （FBS） 以及一组冻存管（每 2 mL 冻存管 1 mL 细胞悬液）。对于培养，准备培养基（补充有 1% 青霉素 - 链霉素、4 ng/mL bFGF 和 20% FBS 的 DMEM）和一组 8 孔板。在电镀细胞之前，必须对板进行涂层（步骤7.1中提供了详细信息）。
2. 对于染色，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（0.15 mL /孔的8孔板）和封闭溶液（PBS中的5%无IgG牛血清白蛋白[BSA];0.15mL /孔的8孔板）中制备4%多聚甲醛（PFA）。
   注意:不要吸入PFA粉末;在化学罩下准备和处理。

3. 解剖

1. 用70%乙醇喷洒安乐死的动物。用大剪刀在腹部水平处做一个水平切口（身体左侧到右侧），并在腰部周围剪开。将皮肤从后肢上拉下来，露出肌肉（图1A）。
2. 将动物放在铝箔覆盖的软木板上，然后固定相对的前肢和后肢。快速将所有后肢肌肉（前部和后部）放入放置在冰上的10厘米培养皿中（图1B，C）。特别注意从股四头肌和后肌周围区域去除脂肪组织。筋膜、神经和肌腱也可以在这一点上切除，前提是这不会影响解剖所花费的总时间。
   注意:双侧后肢的最佳解剖时间应约为 15-20 分钟。建议解剖时间不超过30分钟。
3. 偶尔向肌肉中滴入DMEM以保持肌肉湿润，但不要太多，因为这会使切碎变得困难。对另一只后肢重复上述步骤。一旦一只动物的所有肌肉都在培养皿中（图1D），用剪刀将它们切碎7-10分钟以获得光滑的匀浆（图1E）。
   注:在该方案中，使用补充有L-谷氨酰胺，丙酮酸和4.5g / L D-葡萄糖的DMEM。

图 1:培养前肌肉准备。（A） 去除皮肤以露出后肢肌肉，如步骤 3.1 所述。（乙，丙）如步骤3.2所述，所有后肢肌肉都收获（B）在骨头周围和（C）之间。（D） 如步骤3.3所述，将收获的肌肉放入冰上的10厘米培养皿中，并用DMEM滴液保持湿润。（E） 用剪刀将肌肉切碎，直到获得具有本图像中描绘的稠度的光滑糊状物。（F） 最终离心后的颗粒图像;蓝色箭头突出显示了蓝色虚线下方的颗粒，该颗粒与管子相对。 请点击这里查看此图的较大版本.

4. 消化

注意:在消化结束时，第5部分需要4°C的离心机，一桶冰，三个细胞过滤器（100um，70um，40um）和三个50mL管（每只动物）。

1. 按照步骤1.2中的说明制备和过滤消化混合物。将混合物放在冰上。
2. 一旦所有肌肉都被切碎，将匀浆放入装有 20 mL 消化混合物的 50 mL 试管中。用柔性薄膜包裹盖子的边缘以防止泄漏，并将试管置于37°C振荡水浴中以中低速（50rpm）进行。
3. 在37°C下1小时后，打开盖子，用10mL移液管轻轻上下移液7次，以获得均匀的混合物。在盖子周围涂上新薄膜，然后将其放回摇晃的水浴中。1小时后，取出管子，关闭浴液。
   注意:对于培养物，在移至第 5 节之前，使用该孵育时间按照步骤 7.1 中的说明涂覆板。

5. 过滤

1. 用冷DMEM（补充有1%青霉素 - 链霉素）填充消化管，最多50mL。将试管倒置三次混合。将 DMEM 保存在冰桶中以备后续步骤使用。
2. 将 100 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 试管上。将消化的混合物通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以600× g 离心5分钟。 将上清液倒入液体废物容器中。
3. 将沉淀重悬于 1 mL 冷 DMEM（补充有 1% 青霉素 - 链霉素）中。用相同的 DMEM 填充试管至 50 mL。注意:如果跳过离心机，下一个颗粒将更难识别和维护。
4. 将 70 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 试管上。将离心/重悬的混合物通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以80× g 离心5分钟。
   注意:此步骤不是强制性的，但建议用于消除细胞碎片。
5. 将 40 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 管上。将上清液通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以600× g 离心5分钟，将上清液倒入液体废物容器中，并将沉淀重悬于培养罩下的FBS中。在此步骤中，颗粒非常小（图1F）。
   注意:通过40μm过滤器过滤可去除碎屑，这些碎屑将在培养物的后期染色中产生非特异性信号。

6.（可选）冻结

注意:第 6 部分是可选的。过滤后可以暂停实验方案，但这会降低细胞存活率和培养成功率。

该协议允许肌肉细胞培养，同时保留卫星细胞和大多数细胞的内源性生态位。图 2 总结了协议的主要步骤，而解剖和消化的基本部分如图 1 所示。建议对后肢肌肉组织进行解剖（图1A-C），因为这组肌肉经过充分研究，并且具有发育起源和分子层次结构14。建议在无菌条件下制备所有混合物。此外，当消化混合物通过细胞培养罩下的 0.22 μm 过滤器时，观察到较低的培养污染。

当将 1/30 的散装制备物接种到包被的 1 cm2 孔板上时，培养开始后 3-4 天可以看到细长的细胞。然而，这可能因细胞浓度而异，并且细长的细胞可能会在较晚开始出现，特别是在扩展冷冻散装制剂时。大约 7 天后，培养基应该变黄，此时需要每天更换培养基。此外，在这一点上，孔需要用肌管覆盖。内皮细胞只占培养物的一小部分。成功培养的主要指标是丰富的 PAX7+ 细胞，这可能需要固定和染色。 Tg:Pax7-nGFP line12 是一种方便的小鼠模型，它允许以 GFP 表达的形式可视化 PAX7 阳性;因此，卫星小区可以很容易地被报告体GFP检测到。可以在倒置落射荧光显微镜上以 20 倍放大倍率观察到 GFP，从而可以在培养过程中分析培养成功率。这也使得在散装培养物中对PAX7-GFP细胞进行活体成像成为可能。培养物的放置时间不得超过 10 天。之后，储备细胞的数量开始下降，肌管可能会从板上脱落。失败的培养，包括基于最近冷冻细胞培养的经验，仍然可以产生大部分纤维，但很少产生 PAX7-GFP 细胞。当使用没有PAX7荧光标记物的小鼠时，有必要进行染色以评估储备细胞生成的功效。

以下抗体已经过测试，并且与方案第 10 节中介绍的染色方案配合良好:抗 PAX7（卫星细胞和活化成肌细胞的标志物 15;也是该培养物中出现的储备细胞的标志物）、抗肌球蛋白（肌管的标志物15）、抗 CD31（内皮细胞的标志物16）、抗 GFP（如果使用报告小鼠）、 抗 MYOD（成肌细胞的标志物 15）、抗 MYOG（分化肌细胞的标志物15）、抗 KI67（增殖细胞的标志物17）和抗 PDGFRα（FAP 的标志物15）。图 3 显示了培养 7 天后的肌原性和生态位细胞。关于图3A-C，肌肉块是从野生型小鼠中培养的，而对于图3D-F，肌肉块是从上述Tg:Pax7-nGFP系中培养的。用 PAX7 和 KI67 进行双重染色（图 3A）可以标记培养 5 天后出现的储备细胞并具有肌肉干细胞特征，例如退出细胞周期（KI67-状态）和定位为形成的肌管的"卫星"。用MyHC和MYOG进行双重染色（图3B，D，E）可以标记通过肌肉分化进展的细胞，从而逐渐表达MYOG，然后合并形成多核MyHC +肌管。用CD31或PDGFRα染色允许标记生态位细胞（图3C），例如内皮细胞和FAP。图3D，E显示了由GFP标记的新兴储备单元。与GFP和MyHC共染色可以评估储备细胞的卫星细胞位置（图3E），而与GFP和其他活化/分化标志物共染色可以评估储备细胞的静止样性质（图3F）。

图 2:协议步骤概述。 （A-D）（A）解剖，（B）消化，（C）过滤和（D）培养的顺序步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:细胞群的免疫染色。 （A） 肌源性（以 PAX7 标记;绿色）和循环（以 KI67 标记;红色）细胞的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。非循环肌原细胞（KI67-PAX7+）的存在表明，该方案可以从野生型小鼠中产生静止样细胞，这些细胞在培养7天时是丰富的。（B） 野生型小鼠细胞培养 7 天后肌管（以肌球蛋白重链 [MyHC] 标记;绿色）和肌细胞（以 MYOG 标记;红色）的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（C） 野生型小鼠细胞培养 7 天后，肌原细胞（以 PAX7 标记;绿色）、间充质纤维-成脂祖细胞（以 PDGFRa 标记;红色）和内皮细胞（以 CD31 标记;品红色）的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（D） 培养 Tg:Pax7-nGFP 小鼠细胞 8 天后 GFP+ 细胞（绿色）和肌细胞（以 MYOG 标记;品红色）的免疫荧光，其中表达 PAX7 的细胞以核 GFP 标记。（E） 培养 Tg:Pax7-nGFP 小鼠细胞 7 天后 GFP+ 细胞（绿色）和肌管（用 MyHC 标记;红色）的免疫荧光。请注意，卫星细胞样细胞在 7 天后出现在培养物中。（F） 共表达卫星细胞 （PAX7）、激活 （FOSB）、增殖 （KI67） 或肌源性分化 （MYOD、MYOG） 标志物的 GFP+ 细胞比例的定量。误差线表示标准偏差。比例尺:100 um。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者声明没有利益冲突。