小鼠骨骼肌未分级批量培养以重现微环境与干细胞静息状态

摘要

骨骼肌包含多种细胞类型，包括定居的干细胞，每种细胞均对肌肉稳态和再生具有特定贡献。本文介绍肌肉干细胞及其细胞微环境的二维培养方法 离体 保持许多生理学特征的环境 体内，并描述了环境特征。

摘要

骨骼肌是人体最大的组织，具有多种功能，从运动到体温调节均依赖于它。其功能发挥及损伤后的修复依赖于多种细胞类型，以及核心肌细胞（肌纤维、肌肉干细胞）与其微环境之间复杂的分子信号交流。大多数实验条件既无法保留这种复杂的生理微环境，也不能实现 离体 静息状态下肌肉干细胞的研究，静息状态对其功能至关重要。本文概述了一种用于 离体 在肌肉干细胞微环境细胞成分共培养条件下，通过机械法和酶解法分离肌肉组织，获得多种细胞类型的混合物，并将其置于二维培养体系中。免疫染色结果显示，一周内培养体系中即出现多种微环境细胞，同时存在肌纤维以及关键的Pax7阳性细胞，后者表现出静息态肌肉干细胞的特征。这些独特性质使该实验方案成为扩增细胞及生成类静息态干细胞的有力工具，可用于研究基础生物学问题及转化医学问题。

引言

运动、呼吸、代谢、身体姿势以及体温维持均依赖于骨骼肌，因此骨骼肌功能异常可导致严重的病理状态（如肌病、肌肉营养不良等）¹。鉴于其重要功能和在机体中的广泛分布，骨骼肌已引起全球众多研究实验室的关注，致力于揭示维持正常肌肉功能的关键机制，并寻找潜在的治疗靶点。此外，骨骼肌也被广泛用作研究组织再生和干细胞功能的模型，因为健康的肌肉在经历完全损伤和退化后能够实现完全自我修复，这主要归功于其固有的干细胞²；这些细胞也被称为卫星细胞，位于肌纤维周围基底膜下方³。

成年骨骼肌的核心细胞是肌纤维（长条状合胞体多核细胞）和卫星细胞（具有成肌潜能的干细胞，在未受伤时处于静息状态）。后者是肌肉再生过程中的核心细胞，若缺乏这些细胞，肌肉再生便无法进行^4,5,6,7。在卫星细胞所处的微环境中，存在多种细胞类型和分子因子向其传递信号。这一微环境在发育过程中逐步形成，并持续至成年期⁸。成年肌肉中含有多种细胞类型（内皮细胞....

方案

所有实验均符合法国及欧盟在马东生物医学研究所（INSERM U955）适用的动物管理条例，特别是欧盟指令2010/63/UE。实验动物饲养于具有认证编号A94 028 379和D94-028-028的动物设施中，环境受控且配备丰富化设施；仅由授权研究人员和动物饲养员进行操作，并由动物饲养人员在动物存活期间定期进行视觉检查，以观察是否存在不适症状。动物在解剖前通过颈椎脱位法实施安乐死。在动物存活期间未进行任何干预性操作，因此无需获得伦理委员会及法国高等教育、研究与创新部对该操作的审批。根据欧盟指令2010/63/UE，安乐死及死后解剖无需伦理审批。本论文所呈现的结果来自野生型C57BL/6NRj品系（见材料表）以及转基因Tg:Pax7-nGFP品系¹²（由本团队培育）。本方案适用于8至12周龄的雄性和雌性小鼠。

1. 消化前试剂与设备的准备

1. 用70%乙醇喷洒解剖工具（直剪刀和弯剪刀、镊子，参见材料表），然后用纸巾擦干。将软木板表面覆盖铝箔，并在附近准备好10 cm的培养皿（每只动物一个）。确保纸巾和70%乙醇在操作时易于取用。
   注意：解剖结束后，先用清水冲洗解剖工具，再用70%乙醇喷洒，并用纸巾擦干。
2. 将旋转水浴锅设定为37 °C，并在50 mL离心管中配制消....

结果

本方案可在保留卫星细胞及其内源性微环境中的大多数细胞的同时，进行肌肉细胞培养。图2总结了该方案的主要步骤，而解剖和消化过程的关键部分则展示于图1。建议解剖后肢肌肉组织（图1A-C），因为该肌群已被广泛研究，且具有共同的发育起源和分子层级关系¹⁴。建议在无菌条件下配制所有试剂混合物。此外，在细胞培养罩内将消化液通过0.22 µm滤器过滤后，可观察到较低的培养污染率。

当将大量制备的细胞悬液取1/30接种到包被的1 cm²孔板上时，在培养开始后3至4天即可观察到伸长的细胞。然而，这一时间可能因细胞浓度不同而有所变化，尤其是在扩增冻存的大量制备细胞时，伸长细胞的出现可能会延迟。大约7天后，培养基应变为黄色，此时需要每天更换培养基。此外，此时孔内应已被肌管覆盖。内皮细胞仅占培养.......

讨论

成年骨骼肌功能依赖于一系列精细协调的细胞相互作用和分子信号。本文介绍了一种可用于研究这些参数的 离体 高度模拟生理微环境的条件。

多个研究团队已报道 体外 培养成肌细胞的方法。这些方法旨在分离卫星细胞，以研究其成肌祖细胞特性。目前主要有两种方法用于分离纯化的卫星细胞，分别是从小腿比目鱼肌和/或趾长伸肌分离的肌纤维培养物中获取。¹⁸或使用一组抗体通过FACS分离卫星细胞：Pax7、CD34和a7-整合素用于阳性筛选，CD45、CD31和Sca1用于阴性筛选，来源为整体肌肉^19,20,21其他研究者也利用机械轻敲法从明胶包被培养板上的混合细胞培养物中分离原代成肌细胞，因为成肌细胞的黏附性较弱，与纤维/脂肪前体细胞（FAPs）等其他细胞相比更易通过机械方式脱落。²²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31	BD	550274	稀释比例 1:100
抗FOSB	Santa Cruz	sc-7203	稀释比例 1:200
抗GFP	Abcam	ab13970	稀释比例 1:1000
抗Ki67	Abcam	ab16667	稀释比例 1:1000
抗MyHC	DSHB	MF20-c	稀释比例 1:400
抗MYOD	Active Motif	39991	稀释比例 1:200
抗MYOG	Santa Cruz	sc-576	稀释比例 1:150
抗Pax7	Santa Cruz	sc-81648	稀释比例 1:100
抗PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	稀释比例 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	浓度 4 ng/mL
牛血清白蛋白（BSA）– 用于消化	Sigma Aldrich	A7906-1006	浓度 0.2%
无IgG、无蛋白酶BSA – 用于染色	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	浓度 5%
40 µm 细胞筛	Dominique Dutscher	352340
70 µm 细胞筛	Dominique Dutscher	352350
100 µm 细胞筛	Dominique Dutscher	352360
胶原酶	Roche	10103586001	浓度 0.5 U/mL
培养板	Sarstedt	94.6140.802
二甲基亚砜（DMSO）	Euromedex	UD8050-05-A
中性蛋白酶	Roche	4942078001	浓度 3 U/mL
解剖镊 5号	Fine Science Tools	91150-20
解剖镊 55号	Fine Science Tools	11295-51
解剖剪（大，直）	Fine Science Tools	9146-11	适用于剪切组织
解剖剪（小，弯）	Fine Science Tools	15017-10
解剖剪（小，直）	Fine Science Tools	14084-08
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT 试剂盒	ThermoFisher	C10340
胎牛血清 – 选项1	Eurobio	CVF00-01
胎牛血清 – 选项2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	包被溶液
Parafilm封口膜	Dominique Dutscher	090261	柔性薄膜
多聚甲醛 – 选项1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	浓度 4%
多聚甲醛 – 选项2	ThermoFisher	28908	浓度 4%
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
摇床水浴箱	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	浓度 0.5%
野生型小鼠	Janvier	C57BL/6NRj