骨骼肌包含多种细胞类型，包括定居的干细胞，每种细胞均对肌肉稳态和再生具有特定贡献。本文介绍肌肉干细胞及其细胞微环境的二维培养方法 离体 保持许多生理学特征的环境 体内，并描述了环境特征。
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方法文章
小鼠骨骼肌未分级批量培养以重现微环境与干细胞静息状态
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摘要
摘要
骨骼肌是人体最大的组织，具有多种功能，从运动到体温调节均依赖于它。其功能发挥及损伤后的修复依赖于多种细胞类型，以及核心肌细胞（肌纤维、肌肉干细胞）与其微环境之间复杂的分子信号交流。大多数实验条件既无法保留这种复杂的生理微环境，也不能实现 离体 静息状态下肌肉干细胞的研究，静息状态对其功能至关重要。本文概述了一种用于 离体 在肌肉干细胞微环境细胞成分共培养条件下，通过机械法和酶解法分离肌肉组织，获得多种细胞类型的混合物，并将其置于二维培养体系中。免疫染色结果显示，一周内培养体系中即出现多种微环境细胞，同时存在肌纤维以及关键的Pax7阳性细胞，后者表现出静息态肌肉干细胞的特征。这些独特性质使该实验方案成为扩增细胞及生成类静息态干细胞的有力工具，可用于研究基础生物学问题及转化医学问题。
引言
运动、呼吸、代谢、身体姿势以及体温维持均依赖于骨骼肌，因此骨骼肌功能异常可导致严重的病理状态（如肌病、肌肉营养不良等）1。鉴于其重要功能和在机体中的广泛分布，骨骼肌已引起全球众多研究实验室的关注，致力于揭示维持正常肌肉功能的关键机制，并寻找潜在的治疗靶点。此外，骨骼肌也被广泛用作研究组织再生和干细胞功能的模型，因为健康的肌肉在经历完全损伤和退化后能够实现完全自我修复，这主要归功于其固有的干细胞2；这些细胞也被称为卫星细胞，位于肌纤维周围基底膜下方3。
成年骨骼肌的核心细胞是肌纤维（长条状合胞体多核细胞）和卫星细胞（具有成肌潜能的干细胞，在未受伤时处于静息状态）。后者是肌肉再生过程中的核心细胞，若缺乏这些细胞，肌肉再生便无法进行4,5,6,7。在卫星细胞所处的微环境中，存在多种细胞类型和分子因子向其传递信号。这一微环境在发育过程中逐步形成，并持续至成年期8。成年肌肉中含有多种细胞类型（内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、纤维脂肪生成祖细胞-FAPs、调节性T细胞等）9,10以及细胞外基质成分（层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、原纤维蛋白、periostin等）11，这些成分在健康、疾病及再生状态下相互作用，并与卫星细胞发生交互。
在实验条件下维持这一复杂的微环境至关重要，但也极具挑战性。同样困难的是维持或使细胞回归静息状态，而静息状态对卫星细胞至关重要9。目前已提出多种方法以部分应对这些挑战，每种方法均有其优缺点（详见讨论部分）。本文介绍一种可部分克服上述两项障碍的方法。首先获取肌肉组织，随后通过机械和酶消化方法将其解离，再将获得的异质性细胞混合物进行培养。在培养过程中，可检测到微环境中多种细胞类型，并观察到回归静息状态的卫星细胞。本实验方案的最后一步，介绍了免疫荧光染色步骤，该步骤利用广泛认可的标记物实现对各类细胞的检测。
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方案
所有实验均符合法国及欧盟在马东生物医学研究所（INSERM U955）适用的动物管理条例，特别是欧盟指令2010/63/UE。实验动物饲养于具有认证编号A94 028 379和D94-028-028的动物设施中，环境受控且配备丰富化设施；仅由授权研究人员和动物饲养员进行操作，并由动物饲养人员在动物存活期间定期进行视觉检查，以观察是否存在不适症状。动物在解剖前通过颈椎脱位法实施安乐死。在动物存活期间未进行任何干预性操作，因此无需获得伦理委员会及法国高等教育、研究与创新部对该操作的审批。根据欧盟指令2010/63/UE，安乐死及死后解剖无需伦理审批。本论文所呈现的结果来自野生型C57BL/6NRj品系（见材料表）以及转基因Tg:Pax7-nGFP品系12（由本团队培育）。本方案适用于8至12周龄的雄性和雌性小鼠。
1. 消化前试剂与设备的准备
- 用70%乙醇喷洒解剖工具（直剪刀和弯剪刀、镊子，参见材料表），然后用纸巾擦干。将软木板表面覆盖铝箔，并在附近准备好10 cm的培养皿（每只动物一个）。确保纸巾和70%乙醇在操作时易于取用。
注意：解剖结束后，先用清水冲洗解剖工具，再用70%乙醇喷洒，并用纸巾擦干。 - 将旋转水浴锅设定为37 °C，并在50 mL离心管中配制消化液（每只动物20 mL），将DMEM与1%青霉素-链霉素、0.5 U/mL胶原酶、3 U/mL分散酶（参见材料表）以及0.2% BSA混合。
- 在细胞培养超净台中，将消化液经0.22 µm滤器过滤。
注意：建议每次实验前新鲜配制消化液。
2. 消化后试剂与设备的准备
- 消化完成后，可将混合物冷冻保存或进行培养。若需冷冻，需配制10%二甲基亚砜（DMSO）:90%胎牛血清（FBS），并准备若干冻存管（每支2 mL冻存管中加入1 mL细胞悬液）。若进行培养，需配制培养基（DMEM培养基添加1%青霉素-链霉素、4 ng/mL bFGF及20% FBS），并准备若干8孔板。接种细胞前必须对孔板进行包被处理（具体步骤见第7.1步）。
- 进行染色时，需配制4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）（每8孔板孔加入0.15 mL），以及封闭液（PBS中含5%无IgG的牛血清白蛋白[BSA]；每8孔板孔加入0.15 mL）。
注意：避免吸入PFA粉末；配制和操作时应在化学通风橱内进行。
3. 解剖
- 用70%乙醇喷洒已处死的动物。使用大剪刀在腹部水平位置从身体左侧到右侧做一横向切口，并环绕腰部剪开。将后肢皮肤剥离，以暴露肌肉（图1A）。
- 将动物置于覆盖铝箔的软木板上，并固定对侧前肢和后肢。迅速将全部后肢肌肉（前侧和后侧）取下，放入置于冰上的10 cm培养皿中（图1B、C）。特别注意清除股四头肌及后侧肌肉周围区域的脂肪组织。若不影响整体解剖时间，此时也可一并去除筋膜、神经和肌腱。
注意：双侧后肢的解剖操作最佳时间应控制在15–20分钟。建议解剖总时间不超过30分钟。 - 间歇性地向肌肉滴加DMEM，以保持其湿润，但不宜过多，以免影响后续剪切操作。对另一侧后肢重复上述步骤。当一只动物的所有肌肉均放入培养皿后（图1D），用剪刀剪切7–10分钟，直至获得均匀的匀浆（图1E）。
注意：本方案中使用的DMEM添加了L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和4.5 g/L D-葡萄糖。
图1：培养前肌肉组织的制备。（A）去除皮肤以暴露后肢肌肉，如步骤3.1所述。（B、C）收获所有后肢肌肉，（B）围绕骨骼以及（C）骨骼之间的肌肉，如步骤3.2所述。（D）将收获的肌肉置于含DMEM液滴的10 cm培养皿中，并放在冰上以保持湿润，如步骤3.3所述。（E）用剪刀将肌肉精细剪碎，直至获得如本图所示质地均匀的糊状物。（F）最终离心后沉淀物的图像；蓝色箭头指示沉淀物位置，位于离心管壁一侧，虚线蓝线下方。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 消化
注意：消化结束后，每个动物需要准备一台4 °C的离心机、一桶冰、三个细胞滤筛（100 µm、70 µm、40 µm）以及三支50 mL离心管，用于第5部分操作。
- 按照步骤1.2所述方法制备并过滤消化液，将消化液置于冰上保存。
- 待所有肌肉组织切碎后，将匀浆转移至50 mL离心管中，并加入20 mL消化液。用封口膜包裹管盖边缘以防止泄漏，将离心管置于37 °C摇水浴中，以低至中等转速（50 rpm）振荡。
- 在37 °C孵育1小时后，打开管盖，使用10 mL移液器轻柔地上下吹打7次，使溶液混匀。重新用封口膜密封管盖，放回摇水浴中继续孵育。1小时后取出离心管，并关闭水浴。
注意：进行细胞培养时，可在该孵育期间按照步骤7.1所述方法对培养板进行包被处理，然后再进入第5节操作。
5. 过滤
- 用冷的DMEM（添加1%青霉素-链霉素）将消化管加至50 mL。通过倒置管子三次混匀。将DMEM置于冰桶中，用于后续步骤。
- 将一个100 µm细胞筛网置于新的50 mL离心管上。将消化后的混合液经细胞筛网滤入新管中。在4 °C下以600 × g离心5分钟。将上清液倒入液体废液容器中。
- 用1 mL冷的DMEM（添加1%青霉素-链霉素）重悬沉淀。用相同的DMEM将管内体积补至50 mL。注意：如果跳过离心步骤，后续的沉淀将更难识别和保留。
- 将一个70 µm细胞筛网置于新的50 mL离心管上。将离心后或重悬的混合液经细胞筛网滤入新管中。在4 °C下以80 × g离心5分钟。
注意：此步骤非必需，但建议执行以去除细胞碎片。 - 将一个40 µm细胞筛网置于新的50 mL离心管上。将上清液经细胞筛网滤入新管中。在4 °C下以600 × g离心5分钟，将上清液倒入液体废液容器，并在培养罩内用FBS重悬沉淀。此步骤的沉淀非常小（图1F）。
注意：通过40 µm筛网过滤可去除碎片，避免在后续培养物染色中产生非特异性信号。
6. （可选）冷冻
注意：第6节为可选步骤。在过滤后可以暂停实验流程，但这可能会降低细胞存活率和培养成功率。
- 加入 DMSO，配制成 10% DMSO:90% FBS 的比例，转移至冻存管中（每支 2 mL 冻存管加入 1 mL 重悬的细胞沉淀）。
- 将冻存管置于聚苯乙烯盒中，于 −80 °C 过夜。次日转移至 −150 °C 进行长时期保存。
注意：也可在 −80 °C 进行短期保存。 - 开始培养时，在 37 °C 水浴中快速解冻冻存管，直至细胞悬液完全融化。在超净工作台内与 4 mL DMEM 混合。在 4 °C 下以 600 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，后续操作按步骤 7.2 所述进行。
7. 培养
注意：冷冻或新鲜的细胞悬液预计可填充三到四个8孔板中的24至32个孔。
- 将包被液（应于4 °C或冰上解冻，储存时通常置于−20 °C）加入8孔板中进行包被。向一个孔中加入0.4 mL包被液，然后用移液器逐孔转移。在所有孔中完成转移后，可将包被液回收并重新冷冻，用于后续培养。细胞接种前，将包被好的培养板置于37 °C孵育30分钟。
- 向FBS-细胞悬液中加入含1%青霉素-链霉素的DMEM，并补充4 ng/mL bFGF（见材料表），以获得20% FBS : 80% DMEM的比例。
注意：尽管在原代成肌细胞培养及大规模培养中生成类卫星细胞时添加bFGF可能有益，但此步骤为可选，因为在约7天的大规模培养中省略bFGF并不会显著影响细胞产量。 - 将步骤7.2所得悬液每孔接种0.4 mL至已包被的8孔板中。
注意：对于冷冻和新鲜样品，按每只动物30 cm2培养面积计算。 - 将培养物置于37 °C、5% CO2条件下孵育，最长可达10天；当培养基开始变为黄褐色时（通常在5–7天后），每天更换一次培养基。
注意：为定量细胞周期S期的细胞13，可在固定前2小时加入10 µM EdU。若要捕获首个S期，应从接种时即加入10 µM EdU，并在培养40小时后固定。
8. 固定
注意：除非另有说明，第8-10节应在室温下进行。
- 用移液器吸出培养基，并用4% PFA固定细胞（每孔0.15 mL）。
注意：应在化学通风橱内添加PFA。
备注：若所有孔同时固定，则在室温下用PFA孵育10分钟；若各孔在不同时间点固定，则向需固定的孔中加入PFA，并将培养板置于37 °C培养箱中孵育5分钟。 - 用移液器吸出PFA，每孔加入PBS冲洗10秒（每孔0.15 mL）。吸出PBS后，每孔加入新鲜PBS孵育5分钟（每孔0.15 mL）。
备注：若所有孔同时固定，则在室温下用PBS孵育；若各孔在不同时间点固定，则向已固定的孔中加入PBS，并将培养板置于37 °C培养箱中孵育5分钟。随后，每孔加入0.4 mL PBS，可将培养板置于培养箱中保存长达1周。
9. 透化与封闭
- 准备染色时，用移液器吸出 PBS，加入含 0.5% TritonX 100 的 PBS（每孔 0.15 mL）透化 8 分钟。用移液器吸出 TritonX 100，每孔加入 PBS 漂洗 10 秒（每孔 0.15 mL），吸出 PBS，再用 PBS 洗涤 5 分钟（每孔 0.15 mL）。
- 用含 5% 无 IgG 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 封闭 30–60 分钟（每孔 0.15 mL）。
10. 染色
- 用移液器吸出 BSA，加入用 PBS 稀释的一抗混合液（0.15 mL/孔）（参见材料表；稀释比例：抗 CD31 抗体 1:100，抗 FOSB 抗体 1:200，抗 GFP 抗体 1:1,000，抗 KI67 抗体 1:1,000，抗 MyHC 抗体 1:400，抗 MYOD 抗体 1:200，抗 MYOG 抗体 1:150，抗 PAX7 抗体 1:100，抗 PDGFRa 抗体 1:50），于 4 °C 过夜孵育。
注意：一抗孵育后，收集抗体混合液，加入叠氮化钠，并根据抗体生产商的说明在 4 °C 或 −20 °C 保存，以备后续重复使用。 - 用移液器吸出抗体混合液，用 PBS 洗涤 10 秒（0.15 mL/孔），吸出 PBS，再用 PBS 洗涤 5 分钟（0.15 mL/孔）。
- 吸出洗涤用 PBS，加入用 PBS 稀释的二抗混合液（山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488、山羊抗兔 Alexa Fluor 555、山羊抗大鼠 Alexa Fluor 647、山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555、山羊抗鸡 Alexa Fluor 488，所有抗体稀释比例为 1:500–1,000）以及细胞核标记物（如 DAPI），总体积为 0.15 mL/孔（参见材料表），室温避光孵育 1 小时。
- 用移液器吸出二抗混合液，用 PBS 冲洗 10 秒（0.15 mL/孔），吸出 PBS，再用 PBS 洗涤 5 分钟（0.15 mL/孔），吸出 PBS，然后封片。
注意：若使用带有可拆卸隔片的 8 孔板，封片前需先移除隔片。
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结果
本方案可在保留卫星细胞及其内源性微环境中的大多数细胞的同时，进行肌肉细胞培养。图2总结了该方案的主要步骤，而解剖和消化过程的关键部分则展示于图1。建议解剖后肢肌肉组织（图1A-C），因为该肌群已被广泛研究，且具有共同的发育起源和分子层级关系14。建议在无菌条件下配制所有试剂混合物。此外，在细胞培养罩内将消化液通过0.22 µm滤器过滤后，可观察到较低的培养污染率。
当将大量制备的细胞悬液取1/30接种到包被的1 cm2孔板上时，在培养开始后3至4天即可观察到伸长的细胞。然而，这一时间可能因细胞浓度不同而有所变化，尤其是在扩增冻存的大量制备细胞时，伸长细胞的出现可能会延迟。大约7天后，培养基应变为黄色，此时需要每天更换培养基。此外，此时孔内应已被肌管覆盖。内皮细胞仅占培养...
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讨论
成年骨骼肌功能依赖于一系列精细协调的细胞相互作用和分子信号。本文介绍了一种可用于研究这些参数的 离体 高度模拟生理微环境的条件。
多个研究团队已报道 体外 培养成肌细胞的方法。这些方法旨在分离卫星细胞，以研究其成肌祖细胞特性。目前主要有两种方法用于分离纯化的卫星细胞，分别是从小腿比目鱼肌和/或趾长伸肌分离的肌纤维培养物中获取。18或使用一组抗体通过FACS分离卫星细胞：Pax7、CD34和a7-整合素用于阳性筛选，CD45、CD31和Sca1用于阴性筛选，来源为整体肌肉19,20,21其他研究者也利用机械轻敲法从明胶包被培养板上的混合细胞培养物中分离原代成肌细胞，因为成肌细胞的黏附性较弱，与纤维/脂肪前体细胞（FAPs）等其他细胞相比更易通过机械方式脱落。22
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
对于 图2，使用了 Servier Medical Art（https://smart.servier.com/）的模板。FR 实验室由法国肌病协会（Association Française contre les Myopathies - AFM）资助。 通过 TRANSLAMUSCLE（资助号 19507 和 22946）、法国医学研究基金会 - FRM（EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793）、法国国家科研署 - ANR（ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73）以及法国抗癌联盟（IP/SC-17130）。上述资助方在本研究的设计、数据收集、分析、解释、报告以及本稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗CD31 | BD | 550274 | 稀释比例 1:100 |
| 抗FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | 稀释比例 1:200 |
| 抗GFP | Abcam | ab13970 | 稀释比例 1:1000 |
| 抗Ki67 | Abcam | ab16667 | 稀释比例 1:1000 |
| 抗MyHC | DSHB | MF20-c | 稀释比例 1:400 |
| 抗MYOD | Active Motif | 39991 | 稀释比例 1:200 |
| 抗MYOG | Santa Cruz | sc-576 | 稀释比例 1:150 |
| 抗Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | 稀释比例 1:100 |
| 抗PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | 稀释比例 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | 浓度 4 ng/mL |
| 牛血清白蛋白（BSA）– 用于消化 | Sigma Aldrich | A7906-1006 | 浓度 0.2% |
| 无IgG、无蛋白酶BSA – 用于染色 | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | 浓度 5% |
| 40 µm 细胞筛 | Dominique Dutscher | 352340 | |
| 70 µm 细胞筛 | Dominique Dutscher | 352350 | |
| 100 µm 细胞筛 | Dominique Dutscher | 352360 | |
| 胶原酶 | Roche | 10103586001 | 浓度 0.5 U/mL |
| 培养板 | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Euromedex | UD8050-05-A | |
| 中性蛋白酶 | Roche | 4942078001 | 浓度 3 U/mL |
| 解剖镊 5号 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 解剖镊 55号 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 解剖剪（大，直） | Fine Science Tools | 9146-11 | 适用于剪切组织 |
| 解剖剪（小，弯） | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| 解剖剪（小，直） | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT 试剂盒 | ThermoFisher | C10340 | |
| 胎牛血清 – 选项1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| 胎牛血清 – 选项2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | 包被溶液 |
| Parafilm封口膜 | Dominique Dutscher | 090261 | 柔性薄膜 |
| 多聚甲醛 – 选项1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | 浓度 4% |
| 多聚甲醛 – 选项2 | ThermoFisher | 28908 | 浓度 4% |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 摇床水浴箱 | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | 浓度 0.5% |
| 野生型小鼠 | Janvier | C57BL/6NRj |
参考文献
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