一种分离线粒体接触位点的改进方法

线粒体在真核生物中发挥着各种不同的功能，其中最著名的是通过氧化磷酸化产生ATP。其他功能包括铁硫簇的产生、脂质合成，以及在高等真核生物中，^Ca2+ 信号传导和诱导细胞凋亡 1,2,3,4。这些功能与其复杂的超微结构密不可分。

线粒体超微结构首先通过电子显微镜⁵ 描述。结果表明，线粒体是由两层膜组成的相当复杂的细胞器:线粒体外膜和线粒体内膜。因此，这些膜形成了两个水室:膜间空间和基质。线粒体内膜可以进一步分为不同的部分。内边界膜与外膜保持紧密联系，嵴形成内陷。所谓的嵴连接连接内边界膜和嵴（图1）。此外，渗透收缩的线粒体的电子显微照片显示存在线粒体膜紧密连接的位点 ^6,7。这些所谓的接触位点是由跨越两个膜的蛋白质复合物形成的（图1）。人们认为，这些相互作用位点对于细胞活力至关重要，因为它们对线粒体动力学和遗传的调节以及胞质溶胶和基质之间的代谢物和信号的转移^{非常重要8。}

线粒体内膜中的MICOS复合物可能是特征最好、用途最广泛的接触位点形成复合物。MICOS 于 2011 年在酵母中描述，它由六个亚基⁹、10、1 ^{1 组成}:Mic60、Mic27、Mic26、Mic19^、Mic12 和 ^Mic10。它们形成一个大约 1.5 MDa 的复合物，定位于嵴连接 9,10,11。核心亚基 Mic10 或 Mic60 的缺失导致该复合物 ^9,11 的缺失，这意味着这两个亚基对 MICOS 的稳定性至关重要。有趣的是，MICOS 不仅与各种线粒体外膜蛋白和复合物形成一个接触位点，而且与多个接触位点形成:TOM 复合物 ^11,12、TOB/SAM 复合物 9、¹²、^13、14、15、¹⁶、Fzo1-Ugo1 复合物⁹、Por1 10^、OM45 10 和 Miro ¹⁷.这强烈表明 MICOS 复合物参与各种线粒体过程，例如蛋白质输入、磷脂代谢和线粒体超微结构的产生¹⁸。后一种功能可能是MICOS的主要功能，因为通过MIC10或MIC60缺失诱导的MICOS复合物的缺失导致线粒体超微结构异常，几乎完全缺乏规则的嵴。相反，与内边界膜不相连的内膜囊泡积聚^19、20。重要的是，MICOS 在形式和功能上从酵母到人都是保守的²¹。MICOS 亚基突变与严重人类疾病的关联也强调了其对高等真核生物的重要性^22,23。尽管MICOS具有高度的通用性，但必须存在其他接触点（基于我们未发表的观察结果）。事实上，已经确定了其他几个接触位点，例如，线粒体融合机制 Mgm1-Ugo1/Fzo1 24、^25、26 或 Mdm31-Por1，它们参与线粒体特异性磷脂心磷脂 ²⁷ 的生物合成。最近，我们改进了导致我们鉴定 MICOS 的方法，以将 Cqd1 鉴定为与外膜复合物 Por1-Om14²⁸ 形成的新接触位点的一部分。有趣的是，这个接触位点似乎也参与了多个过程，例如线粒体膜稳态、磷脂代谢和辅酶 Q^28,29 的分布。

在这里，我们使用了前面描述的线粒体分馏 9,30,31,32,33 的变体。线粒体的渗透处理导致线粒体外膜的破坏和基质空间的收缩，使两个膜仅在接触部位靠近。这允许通过温和的超声处理产生仅由线粒体外膜或线粒体内膜组成的囊泡，或在两个膜的接触部位产生囊泡。由于线粒体内膜具有更高的蛋白质脂质比，因此与线粒体外膜囊泡相比，线粒体内膜囊泡表现出更高的密度。密度的差异可用于通过蔗糖浮力密度梯度离心分离膜囊泡。因此，线粒体外膜囊泡在低蔗糖浓度下积累，而线粒体内膜囊泡在高蔗糖浓度下富集。含有接触位点的囊泡浓缩在中间蔗糖浓度（图2）。以下方案详细描述了这种改进的方法，与我们先前建立的方法³²相比，它需要更少的专业设备，时间和能量，并为鉴定可能的接触位点蛋白提供了有用的工具。

1. 缓冲液和储备溶液

1. 在去离子水中制备 1 M 3-吗啉基丙烷-1-磺酸 （MOPS） 溶液，pH 7.4。储存在4°C。
2. 在去离子水中制备500mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0。在室温下储存。
3. 在去离子水中制备2.4M山梨糖醇。高压灭菌后在室温下储存。
4. 在去离子水中制备2.5M蔗糖。高压灭菌后在室温下储存。
5. 在异丙醇中制备200mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。储存在-20°C。
   注意:PMSF 如果吞咽是有毒的，会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。不要吸入灰尘，并戴上防护手套和护目镜。
6. 在去离子水中制备72%的三氯乙酸（TCA）。储存在4°C。
   注意:TCA 可能会导致呼吸道刺激、严重皮肤灼伤和眼睛损伤。不要吸入灰尘，并戴上防护手套和护目镜。
7. 准备SM缓冲液:20mM MOPS和0.6M山梨糖醇，pH 7.4。
8. 准备溶胀缓冲液:20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4。
9. 制备蔗糖梯度缓冲液:0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M 和 1.3 M 蔗糖，溶于 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA，pH 7.4。
   注意:所有缓冲液都可以储存在4°C;然而，建议将含蔗糖的缓冲液储存在-20°C以避免真菌生长。蛋白酶抑制剂必须在使用前新鲜添加。

2. 软骨小泡的产生

1. 根据既定方案新鲜分离粗酵母线粒体^34,35。
   注:在本实验中，从 酿酒酵母中分离出线粒体。没有必要产生没有其他细胞器的梯度纯线粒体。
2. 通过移液将10mg新鲜分离的线粒体重悬于1.6mL SM缓冲液（4°C）中（图2，步骤1）。
3. 将线粒体悬浮液转移到预冷的 100 mL 锥形瓶中。
4. 使用 20 mL 玻璃移液管缓慢加入 16 mL 溶胀缓冲液。在添加过程中，在冰上持续进行温和搅拌。这种渗透处理导致水吸收到基质空间中。线粒体内膜的肿胀会破坏外膜。然而，两层膜将在接触部位^{保持接触9}（图2，步骤2）。
5. 将样品在恒定的温和搅拌下在冰上孵育30分钟。
6. 使用 5 mL 玻璃移液管缓慢加入 5 mL 的 2.5 M 蔗糖溶液，将样品中的蔗糖浓度增加到约 0.55 M。这种渗透处理导致水从基质³⁶流出。内膜的收缩旨在最大限度地使其与外膜的残留碎片的距离最大化。这降低了通过超声处理产生内膜和外膜的人工杂化囊泡的可能性（图2，步骤3）。
7. 将样品在温和搅拌下在冰上孵育15分钟。
8. 使线粒体进行超声处理以产生提交软骨体膜囊泡（图2，步骤4）。
   1. 将线粒体悬浮液转移到预冷的玫瑰花结细胞中。
   2. 以10%振幅超声处理线粒体悬浮液30秒，同时在冰浴中冷却玫瑰花结细胞。
   3. 将悬浮液在冰浴中静置30秒。
   4. 重复步骤 2.8.2 和步骤 2.8.3 三次。
      注意: 超声处理条件会根据所使用的超声仪而有所不同。对于单个机器，优化是必要的。过于苛刻的超声处理会导致人工形成由线粒体内膜和外膜组成的囊泡。

3.软骨囊泡的分离

1. 通过在4°C下以20,000× g 离心20分钟，将生成的囊泡与剩余的完整线粒体分离。 完整的线粒体将沉淀，而囊泡将留在上清液中。
2. 浓缩囊泡混合物。
   1. 将上清液转移到新鲜的超速离心管中。
   2. 使用配备 0.8 mm x 120 mm 套管的 1 mL 注射器在管底部加载 0.3 mL 的 2.5 M 蔗糖溶液垫。
   3. 在4°C下以118,000× g 离心100分钟。
      注意:这里使用了最大半径为 153.1 mm 的摆动铲斗转子。离心条件很大程度上取决于转子，当使用另一个转子时，必须进行调整。
3. 离心后，囊泡将在蔗糖垫的顶部显示为圆盘。弃去约90%的上清液。现在，通过上下移液将浓缩囊泡重悬于剩余的缓冲液中（包括2.5M蔗糖）来收获浓缩囊泡。将悬浮液转移到冰冷的 Dounce 均质器中。
4. 使用聚四氟乙烯陶器以至少10次冲程均质化悬浮液。
5. 准备蔗糖梯度。
   1. 对于具有五个步骤（1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M和0.8 M蔗糖，溶于20 mM MOPS和0.5 mM EDTA，pH 7.4）的11 mL步进梯度，每层含有2.2 mL蔗糖溶液。
      注意:建议使用折光仪来测量和调整蔗糖浓度;但是，这不是必需的。将 10 μL 缓冲液施加到折光仪上，并检测相应的折光率。蔗糖浓度的计算方法如下:
      
      1.3333代表水的折射率。0.048403 是从摩尔折射率到水溶液中蔗糖浓度的线性缩放得到的蔗糖比转化指数 ³⁷。
   2. 将最高浓度的蔗糖加入离心管中，并将管置于-20°C。 等到图层完全冻结后再应用下一个图层。相应地进行，直到添加最后一层，并将梯度储存在−20°C。
      注意:请记住在开始实验时将冷冻梯度转移到4°C，以使梯度解冻。这大约需要3小时。对于这里的离心，使用了容量为 13.2 mL 的摆动吊篮转子。当使用不同的转子时，必须相应地调整梯度步进体积。
6. 使用折光仪测量样品的蔗糖浓度。如果无法使用折光仪，则可以假设蔗糖浓度为2 M。这个假定的蔗糖浓度将成为下一步的基础。
7. 通过加入适量的20mM MOPS，0.5mM EDTA，1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（pH 7.4）将蔗糖浓度调节至0.6M。如果蔗糖浓度估计为2M而不是测量，建议在调整后测试浓度是否足够低。在试管中将少量样品（约 50 μL）涂在 200 μL 的 0.8 M 蔗糖上。样品必须保持在0.8M蔗糖的顶部。
8. 将样品（约1mL）加载到蔗糖梯度的顶部（保留10%以备后用）。小心移液对于避免梯度干扰很重要（图2，步骤5）。
9. 通过在200,000× g 和4°C离心12小时来分离囊泡。如果可能，将离心机设置为缓慢的加速和减速，以避免梯度的干扰（图2，步骤6）。
   注意:这里使用了最大半径为 153.1 mm 的摆动铲斗转子。离心条件很大程度上取决于转子，当使用另一个转子时，必须进行调整。
10. 使用 1 mL 移液器从 上到下收集 700 μL 馏分的梯度。这将产生 17 个分数，从而获得足够的分辨率。

4. 提交软骨囊泡的分析

1. 通过将每个级分置于两次连续进行的TCA沉淀³⁸中来浓缩蛋白质，以制备SDS-PAGE样品。
   1. 向各个馏分中加入 200 μL 72% TCA，并混合直至溶液均匀。将馏分在冰上孵育30分钟，并通过在20,000× g 和4°C下离心20分钟沉淀沉淀的蛋白质。弃去上清液，加入500μL的28%TCA溶液，充分混合，重复离心步骤。
   2. 用 1 mL 丙酮 （-20°C） 洗涤沉淀，并在 20,000 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。 弃去上清液，让沉淀风干。将沉淀重悬于60μLSDS样品缓冲液中，并将样品在95°C下孵育5分钟。
      注:在第一次TCA沉淀后，大量的蔗糖将残留，特别是在高密度馏分中。这将通过额外的 TCA 沉淀来消除。
2. 通过 SDS-PAGE³⁹ 和免疫印迹 40、^41、42、43 分析每个级分的²⁰ μL。

分离线粒体内膜和外膜相对容易。然而，含有接触位点的囊泡的产生和分离要困难得多。在我们看来，有两个步骤是关键和必不可少的:超声处理条件和使用的梯度。

通常，与阶梯梯度相比，线性梯度被认为具有更好的分辨率。然而，它们的可重复生产是乏味的，需要特殊的设备。因此，我们建立了一种方法来生成各个步骤之间差异相对较小的阶梯梯度（参见步骤3.5）。我们推测，离心时步骤梯度将得到平衡，从而产生几乎线性的梯度。引人注目的是，使用折光仪离心后单个馏分的蔗糖浓度测定表明，在以 200,000 x g 离心 12 小时后，阶梯梯度确实几乎变成了线性（图 3）。

在这些代表性结果中，轻度超声处理的重要性是显而易见的。在温和的超声处理条件下（图4A），线粒体外膜标记物Tom40在早期的低密度组分（4号组分）中富集，而在后期组分中几乎不存在。线粒体内膜标记物 Tim17 集中在高密度组分（组分 17）中。相反，接触位点蛋白Mic60在中间蔗糖浓度的馏分（馏分编号12-14）中积累，表明各种膜囊泡的成功生成和随后的分离。相反，在更苛刻的超声处理条件下，线粒体外膜标记物Tom40可以在梯度的较低部分检测到（组分14和组分17， 图4B）。此外，在中等密度的馏分中存在大量Tim17（馏分13和馏分14， 图4B）。中等密度部分中外膜和内膜标记物的非特异性积累表明混合膜的人工形成，这抑制了候选蛋白质的鉴定。

图 1:线粒体超微结构的示意图。 线粒体的示意图，用于显示不同的区室、膜和蛋白质位置。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:线粒体分离分离接触位点蛋白的工作流程。 协议中描述的过程的示意图概述。（1）新鲜分离的线粒体（2）渗透膨大（3），然后萎缩。（4）反对对萎缩的线粒体进行轻度超声处理以产生软骨体囊泡。（5）将囊泡混合物浓缩并加载到蔗糖梯度上。（6）通过离心，线粒体外膜囊泡在低蔗糖浓度下富集，线粒体内膜囊泡在高蔗糖浓度下富集，接触部位囊泡在中等蔗糖浓度下富集。缩写:MIM，线粒体内膜;MOM，线粒体外膜。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:通过离心生成线性梯度。 平行制备两步梯度（1.3 M、1.13 M，然后1.02 M、0.96 M和0.8 M，溶于20 mM MOPS和0.5 mM EDTA，pH 7.4），并将1 mL 0.6 M蔗糖溶于20 mM MOPS和0.5 mM EDTA（pH 7.4）中。将梯度在 200,000 x g 和 4°C 下离心 12 小时，并分 17 次收获。通过使用折光仪测定各个梯度的单个馏分的蔗糖浓度来测试该方法的重现性。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:使用明确的超声脉冲分离接触位点蛋白。 （甲，乙）将新鲜分离的酵母线粒体进行渗透处理并暴露于超声处理。使用蔗糖浮力密度梯度离心分离生成的囊泡。梯度分离，对各馏分中的蛋白质进行TCA沉淀。使用指定的抗体通过免疫印迹分析线粒体外膜 （Tom40）、线粒体内膜 （Tim17） 和接触位点 （Mic60） 标记蛋白的分布。（A） 轻度超声处理（4 x 30 秒，10% 振幅）导致外膜蛋白（低密度组分）和内膜蛋白（高密度组分）的清晰分离。此外，接触位点蛋白 Mic60 成功地富集在中等密度的馏分中。（B） 更苛刻的超声处理（4 x 30 s，20% 振幅）导致杂交囊泡的产生，因此不允许接触位点的明确分离。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者声明不存在利益冲突。