一种改进的线粒体接触位点分离方法

摘要

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。

摘要

线粒体几乎存在于所有真核细胞中，其功能远不止能量生成，还包括铁硫簇、脂质或蛋白质的合成，以及钙离子稳态调控等重要生物学过程。²⁺ 缓冲作用以及凋亡的诱导。同样，线粒体功能障碍会导致多种严重的人类疾病，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病。为了执行这些功能，线粒体必须通过由两层膜构成的膜包膜与细胞其他部分进行通讯。因此，这两层膜必须持续相互作用。线粒体内膜与外膜之间的蛋白质性质的接触位点在这一过程中至关重要。迄今为止，已鉴定出多个此类接触位点。在本文所述的方法中 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 线粒体被用于分离接触位点，从而鉴定可能作为接触位点蛋白的候选分子。我们利用该方法鉴定了线粒体接触位点与嵴组织系统（MICOS）复合物，这是线粒体内膜中主要的接触位点形成复合物之一，从酵母到人类均保守存在。近期，我们进一步优化了该方法，鉴定出一种由Cqd1与Por1-Om14复合物组成的新接触位点。

引言

线粒体在真核生物中执行多种不同功能，其中最为人熟知的是通过氧化磷酸化产生ATP。其他功能包括铁硫簇的合成、脂质合成，以及在高等真核生物中参与Ca²⁺信号传导和诱导细胞凋亡^1,2,3,4。这些功能与其复杂的超微结构密不可分。

线粒体的超微结构最初通过电子显微镜观察得以描述⁵。研究表明，线粒体是结构相当复杂的细胞器，由两层膜组成：线粒体外膜和线粒体内膜。这两层膜形成了两个水相区室：膜间隙和基质。线粒体内膜还可进一步分为不同的区域。内边界膜紧邻外膜，而嵴则形成向内凹陷的结构。所谓的嵴连接（crista junctions）将内边界膜与嵴相连（图1）。此外，渗透压收缩的线粒体电子显微照片显示，存在一些位点，其线粒体膜紧密连接^6,7。这些被称为接触位点（contact sites）的结构由跨越两层膜的蛋白质复合物构成（图1）。这些相互作用位点被认为对细胞存活至关重要，因其在调控线粒体动态变化与遗传、以及细胞质与基质之间代谢物和信号传递过程中具有重要作用⁸。

线粒体内膜中的MICOS复合物可能是目前研究最深入且功能最多样的膜接触位点形成复合物。MICOS于2011年在酵母中被首次描述，由六个亚基组成^9,10,11Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12 和 Mic10。这些蛋白形成一个定位于嵴连接处的约 1.5 MDa 的复合物^9,10,11删除任一核心亚基（Mic10 或 Mic60）均会导致该复合物的缺失^9,11，这表明这两个亚基对于MICOS的稳定性至关重要。有趣的是，MICOS不仅形成一个，而是与多种线粒体外膜蛋白及复合物形成多个接触位点：包括TOM复合物^11,12，TOB/SAM复合物^{9,12,13,14,15,16}Fzo1-Ugo1 复合物⁹, Por1¹⁰，OM45¹⁰，和 Miro¹⁷这强烈表明MICOS复合物参与了多种线粒体过程，例如蛋白质导入、磷脂代谢以及线粒体超微结构的形成。¹⁸后一种功能可能是其主要功能 MICOS，由于通过缺失MICOS复合物诱导 MIC10 或 MIC60 导致线粒体超微结构异常，几乎完全缺乏规则的嵴。相反，出现大量与内边界膜无连接的内部膜性囊泡并发生积聚^{19, 20}重要的是，MICOS 在从酵母到人类的进化过程中，其结构和功能均高度保守。 人类²¹MICOS 亚基突变与严重人类疾病之间的关联也凸显了其对高等真核生物的重要性^22,23尽管MICOS具有高度多功能性，但根据我们未发表的观察结果，必然还存在其他接触位点。事实上，已鉴定出多个其他接触位点，例如线粒体融合装置Mgm1-Ugo1/Fzo1。^24,25,26 或参与线粒体特异性磷脂心磷脂生物合成的 Mdm31-Por1²⁷最近，我们改进了该方法，由此在鉴定MICOS的基础上，进一步将Cqd1鉴定为一种新型膜接触位点的组成部分，该位点与外膜复合物Por1-Om14相互作用形成²⁸有趣的是，这一接触位点似乎还参与多种过程，如线粒体膜稳态、磷脂代谢以及辅酶Q的分布^28,29.

此处，我们采用了一种此前描述过的线粒体分级分离方法的改进版本^{9,30,31,32,33}。线粒体经渗透处理后，其外膜被破坏，基质空间发生收缩，仅在膜接触位点处使内外膜保持紧密相邻。通过温和超声处理，可由此生成仅包含线粒体外膜、或仅包含线粒体内膜、或含有双膜接触位点的囊泡。由于线粒体内膜的蛋白与脂质比例远高于外膜，因此线粒体内膜囊泡的密度高于线粒体外膜囊泡。利用这一密度差异，可通过蔗糖密度梯度离心法分离不同膜来源的囊泡。因此，线粒体外膜囊泡聚集于低浓度蔗糖区域，而线粒体内膜囊泡则富集于高浓度蔗糖区域。含有膜接触位点的囊泡则集中于中等浓度蔗糖区域（图2）。以下实验方案详细描述了这一改进方法，与我们此前建立的方法³²相比，该方法所需专用设备更少，耗时更短，能耗更低，为鉴定潜在的膜接触位点蛋白提供了有力工具。

方案

1. 缓冲液与贮存液

1. 用去离子水配制 pH 7.4 的 1 M 3-吗啉丙磺酸（MOPS）溶液，4 °C 保存。
2. 用去离子水配制 pH 8.0 的 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，室温保存。
3. 用去离子水配制 2.4 M 山梨醇溶液，高压灭菌后室温保存。
4. 用去离子水配制 2.5 M 蔗糖溶液，高压灭菌后室温保存。
5. 用异丙醇配制 200 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液，−20 °C 保存。
   警告：PMSF 吞食后有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。
6. 用去离子水配制 72% 三氯乙酸（TCA）溶液，4 °C 保存。
   警告：TCA 可能引起呼吸道刺激、严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。
7. 配制 SM 缓冲液：20 mM MOPS 和 0.6 M 山梨醇，pH 7.4。
8. 配制膨胀缓冲液：20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4。
9. 配制蔗糖梯度缓冲液：在 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA（pH 7.4）中分别配制 0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M 和 1.3 M 的蔗糖溶液。
   注意：所有缓冲液可于 4 °C 保存；但含蔗糖的缓冲液建议保存于 −20 °C，以防止真菌生长。蛋白酶抑制剂需在使用前新鲜添加。

2. 亚线粒体囊泡的制备

1. 根据已建立的方案^34,35 新鲜制备粗酵母线粒体。
   注意：本实验所用线粒体来源于 Saccharomyces cerevisiae。无需制备不含其他细胞器的梯度纯线粒体。
2. 用移液器将10 mg新鲜制备的线粒体重悬于1.6 mL SM缓冲液中（4 °C）（图2，步骤1）。
3. 将线粒体悬液转移至预冷的100 mL锥形瓶中。
4. 使用20 mL玻璃移液管缓慢加入16 mL膨胀缓冲液。在加液过程中于冰上持续轻柔搅拌。该渗透处理会导致水分进入基质腔。线粒体内膜的膨胀将破坏外膜，但两层膜仍会在接触位点处保持连接⁹（图2，步骤2）。
5. 在冰上持续轻柔搅拌条件下孵育样品30分钟。
6. 使用5 mL玻璃移液管缓慢加入5 mL 2.5 M蔗糖溶液，使样品中蔗糖浓度升至约0.55 M。该渗透处理将导致基质中的水分外流³⁶。内膜的收缩旨在最大化其与残留外膜碎片之间的距离，从而降低通过超声处理产生由内膜和外膜组成的人工杂合囊泡的可能性（图2，步骤3）。
7. 在冰上轻柔搅拌条件下孵育样品15分钟。
8. 对线粒体进行超声处理以生成亚线粒体膜囊泡（图2，步骤4）。
   1. 将线粒体悬液转移至预冷的玫瑰花式细胞中。
   2. 在冰浴中冷却玫瑰花式细胞的同时，以10%振幅对线粒体悬液进行30秒超声处理。
   3. 将悬液在冰浴中静置30秒。
   4. 重复步骤2.8.2和步骤2.8.3共三次。
      注意：超声条件会因所用超声仪不同而有所差异。需针对不同仪器进行优化。过度剧烈的超声会导致由线粒体内膜和外膜组成的人工囊泡形成。

3. 线粒体亚微粒泡的分离

1. 在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 20 分钟，将生成的囊泡与剩余的完整线粒体分离。完整的线粒体会形成沉淀，而囊泡则保留在上清液中。
2. 浓缩囊泡混合物。
   1. 将上清液转移至新的超速离心管中。
   2. 使用配备 0.8 mm × 120 mm 套管的 1 mL 注射器，在离心管底部加入 0.3 mL 的 2.5 M 蔗糖溶液作为垫层。
   3. 在 4 °C 条件下以 118,000 × g 离心 100 分钟。
      注：此处使用最大半径为 153.1 mm 的摆动桶转子。离心条件高度依赖所用转子类型，若更换转子则需相应调整离心参数。
3. 离心后，囊泡将出现在蔗糖垫层的顶部，形成一个圆盘状结构。弃去约 90% 的上清液。然后通过上下吹打，将浓缩的囊泡重悬于剩余缓冲液（含 2.5 M 蔗糖）中，并将悬液转移至预冷的 Dounce 匀浆器中。
4. 使用聚四氟乙烯材质的 Potter 匀浆器，至少进行 10 次匀浆操作。
5. 制备蔗糖梯度。
   1. 制备 11 mL 的五步阶梯梯度（各层分别为 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M 和 0.8 M 蔗糖，溶于 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA 中，pH 7.4），每层体积为 2.2 mL。
      注：建议使用折射仪测量并调整蔗糖浓度，但并非必需。取 10 µL 缓冲液加至折射仪上，检测相应的折射率。蔗糖浓度计算公式如下：
      
      1.3333 代表水的折射率。0.048403 是从摩尔折射率与水溶液中蔗糖浓度之间的线性关系推导出的蔗糖特异性换算系数³⁷。
   2. 将最高浓度的蔗糖溶液加入离心管中，并将离心管置于 −20 °C。待该层完全冻结后再加入下一层，依此操作直至加完最后一层，并将制备好的梯度保存在 −20 °C。
      注：实验开始前需将冷冻的梯度转移至 4 °C，使其充分解冻，此过程约需 3 小时。本次离心使用容量为 13.2 mL 的摆动桶转子。若使用其他转子，需相应调整梯度各层的体积。
6. 使用折射仪测定样品的蔗糖浓度。若无折射仪，也可假设蔗糖浓度为 2 M。该假设浓度将作为下一步操作的基础。
7. 通过加入适量的 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物（pH 7.4），将蔗糖浓度调整至 0.6 M。若蔗糖浓度未实测而是估计为 2 M，则建议在调整后验证浓度是否足够低。取少量样品（约 50 µL）加至含有 200 µL 0.8 M 蔗糖的试管顶部，样品应停留在 0.8 M 蔗糖液面上方。
8. 将样品（约 1 mL）小心加至蔗糖梯度顶部（保留 10% 作为后续对照）。加样时需谨慎操作，避免破坏梯度结构（图 2，步骤 5）。
9. 在 4 °C 条件下以 200,000 × g 离心 12 小时，以分离囊泡。如有可能，应设置离心机为慢加速和慢减速模式，以防止梯度扰动（图 2，步骤 6）。
   注：此处使用最大半径为 153.1 mm 的摆动桶转子。离心条件高度依赖所用转子类型，若更换转子则需相应调整离心参数。
10. 使用 1 mL 移液器从梯度顶部到底部收集样品，每份 700 µL，共收集 17 份，以获得足够的分辨率。

4. 线粒体亚微粒泡的分析

1. 通过将各组分进行两次连续的三氯乙酸（TCA）沉淀³⁸，浓缩蛋白质，以制备SDS-PAGE样品。
   1. 向各个组分中加入200 µL 72%的TCA，混匀至溶液均匀。将样品在冰上孵育30分钟，然后在20,000 × g、4 °C下离心20分钟，沉淀蛋白质。弃去上清液，加入500 µL 28% TCA溶液，充分混匀后重复离心步骤。
   2. 用1 mL丙酮（−20°C）洗涤沉淀物，并在20,000 × g、4 °C下离心10分钟。弃去上清液，让沉淀物自然风干。将沉淀物重悬于60 µL SDS上样缓冲液中，并在95 °C下孵育5分钟。
      注：第一次TCA沉淀后，尤其在高密度组分中会残留大量蔗糖。通过额外的TCA沉淀步骤可去除这些蔗游戏副本。
2. 采用SDS-PAGE³⁹和免疫印迹^40,41,42,43对每个组分取20 µL进行分析。

结果

分离线粒体内膜和外膜相对容易。然而，含有接触位点的囊泡的制备与分离则困难得多。我们认为，其中两个步骤至关重要：超声处理条件和所使用的梯度。

通常认为，线性梯度相较于阶梯梯度具有更好的分辨率。然而，线性梯度的可重复制备过程繁琐，且需要特殊设备。因此，我们建立了一种生成阶梯梯度的方法，该方法中各个阶梯之间的差异相对较小（见步骤3.5）。我们推测，在离心过程中阶梯梯度会达到平衡，从而形成近乎线性的梯度。引人注目的是，使用折射仪测定离心后各组分的蔗糖浓度发现，经过200,000 × g 条件下12小时离心后，阶梯梯度确实几乎转变为线性梯度（图3）。

温和超声处理的重要性在这些代表性结果中显而易见。在温和超声条件下（图4A），线粒体外膜标志物Tom40富集于早期低密度组分（第4组分），而在后续组分中几乎不存在；线粒体内膜标志物Tim17则集中在高密度组分（第17组分）。相比之下，接触位点蛋白Mic60...

讨论

线粒体亚组分分离是一项具有多个高度复杂步骤的实验。因此，我们旨在进一步改进并在一定程度上简化我们已建立的方法³²。此前面临的挑战主要包括需要使用复杂且高度专业化的设备，这些设备往往是自行搭建的装置，同时该方法还存在耗时长、能耗高的问题。为此，我们尝试去除用于制备和收集线性梯度的泵和自行搭建装置，转而采用阶梯梯度。重要的是，我们发现，至少在按照本文所述方法制备时，梯度在离心过程中会自然转变为线性梯度，因此该替代方案是可行的。该方法具有以下优势：（i）无需梯度混合器，从而减少了所需设备；（ii）节省实验当天的时间，因为梯度可预先制备；（iii）按照所述方法（包括在逐层叠加前将各梯度组分预先冷冻）制备时，具有高度可重复性（图3）。这些梯度亦可在−20°C长期保存。此外，本方法建议的沉降梯度加样方式也比类似方法中所述需将囊泡混合物置于梯度下方的加样方式更为简便^9,32。浮力梯度加样需要使用带有长针头的注射器穿过已制备好的梯...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
13.2 mL，开口超薄透明管，14 x 89 mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL，开口厚壁聚碳酸酯开口管，29 x 104 mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 固定角转子-铝制，8 x 50 mL，25,000 rpm，75,600 × g	Beckman Instruments, Germany	363055
阿贝折射仪	Zeiss, Germany		已停产， 可使用任意阿贝折射仪
accu-jet pro 移液控制器	Brandtech, USA	BR26320	已停产， 任何移液控制器均可满足要求
1000 mL 烧杯	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson 超声 3 mm 锥形微探头	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200 和 400 瓦超声仪：玫瑰花结冷却池	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Avanti JXN-26 离心机	Beckman Instruments, Germany	B37912
Optima XPN-100 ultra 超速离心机	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Roche, Switzerland	11697498001
D-山梨醇	Roth, Germany	6213
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）	Roth, Germany	8043
100 mL 锥形瓶	Roth, Germany	X747.1
刻度移液管，B 级，25:0，0.1	Hirschmann, Germany	1180170
刻度移液管，B 级，5:0，0.05	Hirschmann, Germany	1180153
冰浴装置	neoLab, Germany	S12651
磁力搅拌器 RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000 移液器	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20 移液器	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200 移液器	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL 注射器	Braun, Germany	4022495251879
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Serva, Germany	32395.03
STERICAN 套管针 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
搅拌子，15 mm	VWR, USA	442-0366
蔗糖	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti 摆桶转子	Beckman Instruments, Germany	331362
试管	Eppendorf, Germany	3810X
组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 玻璃容器	VWR, USA	432-0200
组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 带锯齿尖端的研杵	VWR, USA	432-0212
三氯乙酸（TCA）	Sigma Aldrich, Germany	33731	已停产， 任何 TCA 均可满足要求（CAS: 73-03-9）
TRIS	Roth, Germany	4855