线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。
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摘要
摘要
线粒体几乎存在于所有真核细胞中，其功能远不止能量生成，还包括铁硫簇、脂质或蛋白质的合成，以及钙离子稳态调控等重要生物学过程。2+ 缓冲作用以及凋亡的诱导。同样，线粒体功能障碍会导致多种严重的人类疾病，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病。为了执行这些功能，线粒体必须通过由两层膜构成的膜包膜与细胞其他部分进行通讯。因此，这两层膜必须持续相互作用。线粒体内膜与外膜之间的蛋白质性质的接触位点在这一过程中至关重要。迄今为止，已鉴定出多个此类接触位点。在本文所述的方法中 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 线粒体被用于分离接触位点，从而鉴定可能作为接触位点蛋白的候选分子。我们利用该方法鉴定了线粒体接触位点与嵴组织系统（MICOS）复合物，这是线粒体内膜中主要的接触位点形成复合物之一，从酵母到人类均保守存在。近期，我们进一步优化了该方法，鉴定出一种由Cqd1与Por1-Om14复合物组成的新接触位点。
引言
线粒体在真核生物中执行多种不同功能，其中最为人熟知的是通过氧化磷酸化产生ATP。其他功能包括铁硫簇的合成、脂质合成，以及在高等真核生物中参与Ca2+信号传导和诱导细胞凋亡1,2,3,4。这些功能与其复杂的超微结构密不可分。
线粒体的超微结构最初通过电子显微镜观察得以描述5。研究表明，线粒体是结构相当复杂的细胞器，由两层膜组成：线粒体外膜和线粒体内膜。这两层膜形成了两个水相区室：膜间隙和基质。线粒体内膜还可进一步分为不同的区域。内边界膜紧邻外膜，而嵴则形成向内凹陷的结构。所谓的嵴连接（crista junctions）将内边界膜与嵴相连（图1）。此外，渗透压收缩的线粒体电子显微照片显示，存在一些位点，其线粒体膜紧密连接6,7。这些被称为接触位点（contact sites）的结构由跨越两层膜的蛋白质复合物构成（图1）。这些....
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方案
1. 缓冲液与贮存液
- 用去离子水配制 1 M 3-吗啉丙磺酸（MOPS）溶液，pH 7.4。4 °C 保存。
- 用去离子水配制 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，pH 8.0。室温保存。
- 用去离子水配制 2.4 M 山梨醇溶液。高压灭菌后室温保存。
- 用去离子水配制 2.5 M 蔗糖溶液。高压灭菌后室温保存。
- 用异丙醇配制 200 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液。−20 °C 保存。
警告：PMSF 吞食后有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。 - 用去离子水配制 72% 三氯乙酸（TCA）溶液。4 °C 保存。
警告：TCA 可能引起呼吸道刺激、严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。 - 配制 SM 缓冲液：20 mM MOPS 和 0.6 M 山梨醇，pH 7.4。
- 配制膨胀缓冲液：20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4。
- 配制蔗糖梯度缓冲液：在 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA（pH 7.4）中分别配制 0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M 和 1.3 M 蔗糖溶液。
注意：所有缓冲液均可在 4 °C 保存；但建议将....
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结果
分离线粒体的内膜和外膜相对容易。然而，含有膜接触位点的囊泡的制备与分离则困难得多。在我们看来，有两个步骤至关重要：超声处理条件和所使用的梯度。
通常认为，线性梯度相较于阶梯梯度具有更好的分辨率。然而，线性梯度的可重复制备较为繁琐，且需要特殊设备。因此，我们建立了一种生成阶梯梯度的方法，该方法中各个阶梯之间的差异相对较小（见步骤3.5）。我们推测，在离心过程中阶梯梯度会达到平衡，从而形成近乎线性的梯度。引人注目的是，使用折射仪测定离心后各组分的蔗糖浓度发现，经过200,000 × g 条件下12小时离心后，阶梯梯度确实几乎转变为线性梯度（图3）。
从这些代表性结果中可以明显看出温和超声处理的重要性。在温和超声条件下（图4A），线粒体外膜标志物 Tom40 富集于早期低密度组分（第4号组分），而在后续组分中几乎完全不存在；线粒体内膜标志物 Tim17 则集中于高密度组分（第17号组分）。相比之下.......
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讨论
线粒体亚组分分离是一项具有多个高度复杂步骤的实验。因此，我们旨在进一步改进并在一定程度上简化我们已建立的方法32。此前面临的挑战主要包括需要使用复杂且高度专业化的设备，这些设备往往是自行搭建的装置，同时该方法还存在耗时长、能耗高的问题。为此，我们尝试去除用于制备和收集线性梯度的泵和自行搭建装置，转而采用阶梯梯度。重要的是，我们发现，至少在按照本文所述方法制备时，梯度在离心过程中会自然转变为线性梯度，因此该替代方案是可行的。该方法具有以下优势：（i）无需梯度混合器，从而减少了所需设备；（ii）节省实验当天的时间，因为梯度可预先制备；（iii）按照所述方法（包括在逐层叠加前将各梯度组分预先冷冻）制备时，具有高度可重复性（图3）。这些梯度亦可在−20°C长期保存。此外，本方法建议的沉降梯度加样方式也比类似方法中所述需将囊泡混合物置于梯度下方的加样方式更为简便9,32。浮力梯度加样需要使用带有长针头的注射器穿过已制备好的梯.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
M.E.H. 感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）提供的经费支持，项目编号为 413985647。作者们感谢慕尼黑路德维希-马克西米利安大学的 Michael Kiebler 博士 给予的慷慨且广泛的支持。我们感谢 Walter Neupert 在科学上的指导、有益的讨论以及持续的启发。 J.F. 感谢慕尼黑生命科学研究生院（LSM）提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 13.2 mL，开口超薄透明管，14 x 89 mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL，开口厚壁聚碳酸酯开口管，29 x 104 mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 固定角转子-铝制，8 x 50 mL，25,000 rpm，75,600 × g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| 阿贝折射仪 | Zeiss, Germany | 已停产， 可使用任意阿贝折射仪 | |
| accu-jet pro 移液控制器 | Brandtech, USA | BR26320 | 已停产， 任何移液控制器均可满足要求 |
| 1000 mL 烧杯 | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson 超声 3 mm 锥形微探头 | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200 和 400 瓦超声仪：玫瑰花结冷却池 | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Avanti JXN-26 离心机 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Optima XPN-100 ultra 超速离心机 | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-山梨醇 | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物） | Roth, Germany | 8043 | |
| 100 mL 锥形瓶 | Roth, Germany | X747.1 | |
| 刻度移液管，B 级，25:0，0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| 刻度移液管，B 级，5:0，0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| 冰浴装置 | neoLab, Germany | S12651 | |
| 磁力搅拌器 RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸） | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 移液器 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 移液器 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 移液器 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL 注射器 | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN 套管针 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| 搅拌子，15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| 蔗糖 | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti 摆桶转子 | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| 试管 | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| 组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 玻璃容器 | VWR, USA | 432-0200 | |
| 组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 带锯齿尖端的研杵 | VWR, USA | 432-0212 | |
| 三氯乙酸（TCA） | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | 已停产， 任何 TCA 均可满足要求（CAS: 73-03-9） |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
参考文献
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.
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