一种用于透射电子显微镜工作流程、结果分析与数据管理的机器视觉方法

摘要

本文介绍了一种利用机器视觉软件在透射电子显微镜（TEM）成像过程中稳定动态现象的实验方案，同时将多路元数据流同步索引至各图像，形成可导航的时间线。我们展示了该平台如何实现电子剂量在实验全过程中的自动校准与映射。

摘要

透射电子显微镜（TEM）使研究人员能够在最基本的原子尺度上研究材料。复杂的实验通常会产生数千张图像，并涉及大量参数，需要耗时且复杂的分析过程。AXON 同步系统是一种机器视觉同步（MVS）软件解决方案，旨在解决 TEM 研究中固有的痛点问题。该软件安装于显微镜后，可在实验过程中持续同步显微镜、探测器以及原位（in situ）系统所产生的图像与元数据。这种连接性使得机器视觉算法得以应用，通过结合空间、电子束和数字校正方法，对视场内感兴趣区域进行居中与追踪，并实现即时的图像稳定。除了此类稳定技术所带来的分辨率显著提升外，元数据的同步还支持计算和图像分析算法的应用，以计算图像之间的变量 。这些计算所得的元数据可用于分析数据集中的趋势或识别关键感兴趣区域，从而获得新的科学见解，并为未来更先进的机器视觉能力的发展奠定基础。基于此类计算元数据开发的模块之一是剂量校准与管理系统。剂量模块提供了先进的校准、追踪和管理功能，可针对样品特定区域逐像素地控制电子通量（e^-/Ų·s^-1）和累积剂量（e^-/Ų）。这使得研究人员能够全面了解电子束与样品之间的相互作用。实验分析通过专用分析软件得以简化，用户可轻松可视化、排序、筛选和导出包含图像及相应元数据的数据集。这些工具共同促进了高效的协作与实验分析，推动了数据挖掘，并提升了显微镜使用体验。

引言

透射电子显微镜（TEM）及其功能因相机、探测器、样品台和计算技术的进步而获得了巨大提升。然而，这些进步受到数据流相互脱节、人为操作的局限性以及繁琐的数据分析的制约^1,2。此外，原位（in situ）和工况（operando）实验使透射电镜转变为实时的纳米尺度实验室，能够在气体或液体环境中对样品进行研究，同时施加多种外部刺激^3,4,5。这类复杂工作流程的广泛应用进一步放大了上述局限性，由此导致的数据流在规模和复杂性上的增长已成为日益关注的问题。因此，目前越来越强调利用机器可操作性来发现、访问、互操作和重用数据，这种实践被称为FAIR原则⁶。按照FAIR原则理念发布科研数据已获得全球各国政府机构的积极关注^7,8，而利用机器视觉软件实现FAIR原则是推动其广泛应用的关键一步。

一种机器视觉同步（MVS）软件平台已被开发出来，以应对执行和分析复杂、元数据密集型透射电子显微镜（TEM）实验（特别是 原位 以及原位实验）⁹安装到透射电子显微镜（TEM）后，MVS 软件即可连接、整合并通信于镜筒、探测器及集成系统 原位 系统。这使其能够持续采集图像，并将这些图像与其对应的实验元数据对齐，从而构建一个全面可搜索的数据库，完整记录从实验开始到结束的时间线图1）。这种连接性使得MVS软件能够应用算法，智能追踪并稳定感兴趣区域（ROI），即使样品正在发生形态变化。软件会根据需要对载物台、电子束和数字校正进行调整，以在样品变化过程中保持ROI的稳定 漂移控制 和 对焦辅助 功能。除了利用不同实验系统生成的原始元数据来丰富图像外，该软件还可通过图像分析算法生成新的计算元数据，用于计算图像间的变量，从而能够自动校正样品漂移或焦点变化。

通过 MVS 软件采集的透射电子显微镜图像及其相关元数据，按实验时间线进行组织，可供任何人打开和查看 通过 免费的离线版分析软件 Studio（下文简称分析软件）¹⁰在实验过程中，MVS 软件会同步并记录来自显微镜相机或探测器的三类图像，这些图像显示在图像查看器下方时间轴的顶部：单次采集图像（直接从透射电子显微镜软件获取的单幅图像）、原始图像（来自探测器/相机实时流的未经任何数字漂移校正处理的图像；这些图像可能已进行物理校正） 通过 阶段移动或电子束偏移）并进行漂移校正（来自探测器/相机实时流的图像已通过数字方式校正漂移）。在实验或会话期间采集的数据可进一步细分为更小的数据段，称为采集集（collections），且不会丢失嵌入的元数据。通过分析软件，可将图像、图像序列及元数据直接导出为多种开放格式的图像和电子表格类型，以便使用其他工具和程序进行分析。

MVS 软件所提供的显微镜控制、稳定性和元数据集成框架，还支持额外机器视觉程序或模块的开发，旨在缓解当前透射电子显微镜（TEM）工作流程中的局限性。首个利用该同步平台开发的模块之一，是电子剂量校准以及对样品中电子束照射区域的空间追踪。所有透射电子显微镜图像均源于样品与电子束之间的相互作用。然而，这些相互作用也可能对样品造成不可避免的负面影响，例如辐射分解和位移损伤^11,12，因此必须在施加足够高的电子剂量以获得图像与尽量减少电子束损伤之间进行谨慎权衡^13,14。

尽管许多用户依赖屏幕电流测量来估算电子剂量，但该方法已被证明会显著低估实际的束流电流¹⁵可获得定性剂量值 通过 同一显微镜在相同设置下的荧光屏电流可用于计算剂量，但若使用不同显微镜或不同设置重现这些剂量条件，则具有高度主观性。此外，实验过程中用户对任何成像参数的调整，例如光斑尺寸、光阑、放大倍数或强度，均需重新测量荧光屏电流，以计算实际剂量。使用者必须严格限制特定实验中所采用的成像条件，或仔细测量并记录每次透镜设置的参数，这显著增加了实验的复杂性，并超出了显微镜常规操作的可行性范围^16,17.

剂量软件（本方案中简称剂量软件）是一种剂量校准软件模块，采用专用的校准支架，以实现自动化的束流强度测量。校准支架的尖端集成了法拉第杯，后者是精确校准束流强度的金标准¹⁵。MVS 软件针对每种透镜条件执行一系列束流强度和束斑面积校准，并将这些校准值以像素级精度嵌入图像中。

在本视频文章中，使用典型的纳米材料样品展示了旨在优化透射电子显微镜（TEM）工作流程各个方面的MVS软件操作方案。一种对电子束敏感的沸石纳米颗粒样品¹⁴ 用于演示校准和剂量管理的工作流程。我们执行一个具有代表性的 原位 使用 Au/FeO 的加热实验_x 纳米催化剂^18,19 样品在加热时会发生显著的形态变化。 原位 实验突显了该软件的稳定化算法及其整合多路元数据流的能力，这对于元数据处理而言是一个固有挑战 原位 以及原位研究。尽管本方案中未作描述，但由于其独特的电子剂量敏感性，我们将讨论该软件在液相电镜研究中的代表性应用实例（相关方案此前已在文献中报道）^20,21,22），以及如何应用这些技术来加深对剂量效应在液相电子显微镜实验中影响的理解。最后，我们展示了如何利用离线分析软件简化数据分析流程，以可视化、过滤并将多种图像、视频和数据文件导出为其他可访问的格式。

图1：MVS 与分析软件的用户界面示例。（A）同步软件的图像查看窗口与控制面板。通过点击 Connect 按钮建立透射电子显微镜（TEM）与同步软件之间的连接，从而将显微镜的图像和元数据实时传输至同步软件中。在图像查看窗口中，操作人员可执行多种机器视觉辅助操作，例如 Drift Correct（漂移校正）和 Focus Assist（对焦辅助）。该界面还支持进行 Tag Images（标记图像）和 Review Session（会话回顾）操作，且不会中断正在进行的数据采集。（B）图像分析软件的截图，突出显示了 Image View Port（图像视窗）、Timeline（时间轴）以及 Metadata（元数据）和 Analysis（分析）面板的位置。在实验过程中的任意时刻，均可通过点击 Review Session 按钮访问分析软件，以查看截至当前时间点所采集的所有图像。请点击此处查看该图的高清版本。

方案

方法1：透射电子显微镜在透射电子显微成像（TEM）和扫描透射电子显微成像（STEM）模式下的剂量校准

1. 打开皮安计，并在开始剂量校准前至少预热30分钟。将剂量校准样品台装入透射电子显微镜（TEM），并使用快速连接电缆将校准样品台连接到皮安计。
2. 将显微镜设置为TEM模式，打开镜筒阀门，定位剂量校准样品台上的35 µm基准孔（图2）。启动MVS软件程序，在实验选项中选择剂量（校准自动化） 。
   注意：初始校准完成后，软件会保存基准孔的位置，以便在后续校准中自动定位该位置。
3. 点击连接 图标（图1A），选择显微镜以建立TEM与MVS软件之间的连接。连接成功后，相机/探测器的图像将在软件的图像查看器中显示。
   注意：无需优化同心高度，由于尖端较厚，基准孔边缘可能显得模糊，但这不会影响电流测量结果。
4. 进入剂量选项卡，然后选择剂量校准。选择剂量面积校准流程，按照软件提示操作，并输入所需的用户可配置参数（如光阑和单色器设置）。完成剂量面积校准后，选择剂量电流校准流程，并按照软件提示继续操作。
5. 对实验中可能使用到的每种束斑尺寸、光阑或单色器设置，重复校准过程（步骤1.4）。
6. 当TEM模式的校准过程完成后，通过重复步骤1.4对STEM模式进行电子剂量校准。
   注意：STEM模式无需执行剂量面积校准。
7. 完成所有所需校准后，点击关闭会话，取出剂量校准样品台，并返回MVS软件的起始界面。

2. 方法2：使用MVS和剂量软件确定剂量阈值

1. 将标准透射电子显微镜（TEM）载网上的样品（本示例中使用市售的ZSM-5沸石纳米颗粒）装入标准TEM样品 holder 中，并将 holder 插入 TEM，定位到感兴趣的区域（结晶态沸石纳米颗粒）。
2. 打开 MVS 软件应用程序并选择 其他。
   注意：可在实验参数字段中添加有关样品的附加信息（例如样品编号和描述、操作者姓名以及实验备注）。
3. 重复步骤 1.3 以连接至 MVS 软件，并在 MVS 软件界面中导航至图像元数据标签页，选择以下元数据以叠加在实时显示的图像流上：放大倍数、最大剂量 和 剂量率。用户可根据需要包含其他元数据。显示剂量管理控制界面的 MVS 软件截图见 补充文件 1。
4. 打开 剂量 标签页，选择 剂量管理 和 启用剂量监测，以激活自动电子剂量追踪功能。选择 显示剂量图层 以显示剂量颜色叠加图。
5. 设置高剂量水平和高剂量率的数值，然后点击 保存（本示例中分别使用了 60,000 e^-/Ų 和 500 e^-/Ų·s 的数值）。
6. 导航至 设置 标签页，选择 剂量，并设置 剂量导航图透明度 和 剂量图像叠加透明度 的数值（本示例中分别使用了 0.50 和 0.30）。
7. 在 实时图像查看器 窗口中，通过点击 漂移校正 启用漂移校正功能。
8. 进入 数据视图 标签页，将元数据值 离焦量 和 聚焦商 绘制在 Y 轴上。
   注意：在实验过程中，可从数据视图表中实时绘制任意可用的元数据值。
9. 启用 聚焦辅助 功能，然后选择 校准聚焦 以运行自动聚焦辅助校准程序。待 校准聚焦 程序完成后，关闭 数据视图 标签页。
10. 在 MVS 软件中打开 图像分析 标签页，启用 实时 FFT 和 象限 1 & 2 选项。
11. 使用显微镜的软件控制功能，调节电子束条件，使电子通量约为 500 e^-/Ų·s，并移动至样品的新区域，在 MVS 软件的实时视图中将样品感兴趣区域（ROI）居中。
    注意：进行大范围样品台移动时，漂移控制和聚焦辅助功能将自动关闭，需在选定新的 ROI 后重新启用。
12. 使用 标签 功能在软件中记录剂量条件。高亮 标签 图标并输入所需文本，以在时间轴中标记特定图像序列。该文本将持续标记图像，直至取消选中 标签 图标。
13. 在保持恒定剂量率的同时，持续对同一 ROI 成像，直至 FFT 图谱中对应原子结构的衍射峰消失。
14. 降低放大倍数，打开 剂量管理 标签页，启用 显示剂量图层 以叠加彩色编码的剂量分布图。
    注意：此功能可直观显示样品中被电子束照射区域及其相对剂量暴露情况。在单张图像中用光标高亮这些区域，可显示其各自的剂量值。
15. 通过取消选中 连接 断开连接并结束会话，然后选择 关闭会话。将会话数据保存至外部存储设备，以防止后续实验中 MVS 软件内保存的数据被覆盖（见 补充文件 2）。

3. 方法三：使用分析软件进行元数据与趋势分析及数据导出

1. 启动分析软件（用于查看完全同步数据集的离线软件），从文件库中选择并打开实验会话文件。
   注意：用户也可以通过以下方式访问分析软件 复习环节 实验过程中 MVS 软件中的图标。
2. 通过激活来显示漂移校正后的图像 直流电 标签位于下方 图像观察窗 并选中相应复选框以选择所需的数据叠加项 叠加数据 盒子中的 图像元数据 （在此示例中）标签 显微镜, 日期/时间, 剂量率, 最大剂量，以及 放大倍数 可根据用户需求绘制其他元数据。
3. 检查 时间线 用于 最大剂量 和 剂量率 将这些数值的图形图表添加到时间轴中。通过高亮显示或滚动浏览这些图形图表，以更新视口中的显示图像。通过以下方式访问多种工具 注意事项, 图像分析, 工具箱，以及 数据视图 标签
   1. 通过以下方式访问每幅图像的 FFT 图像分析 标签并点击 实时FFT 在滚动浏览图像时更新FFT。
   2. 利用FFT峰的衰减来确定沸石结构失去结晶性的时点。记录该图像对应的最高剂量值。
4. 使用 过滤 轻松筛选大型数据集，将其过滤为更小且可共享的数据子集，同时保留其相关元数据。打开过滤面板，调整滑块，仅保留剂量率大于或等于约500 e的數據^-/Ų·s 被选中，使用指定名称保存新集合 剂量阈值研究.
   注意：可针对任何关联的元数据类型应用筛选条件。
5. 将图像和元数据从会话中导出为其他文件格式，并添加比例尺和元数据叠加信息。
   1. 在库窗格中高亮显示该合集，然后选择 发表 通过右键单击所选区域. 从 发表 在窗口中，选择所需文件类型的导出选项。
   2. 选择经漂移校正的数据标签页，应用所需元数据的叠加图像以及FFT（根据需要调整FFT叠加图像的位置；文中展示了导出时包含FFT的图像示例） 图3).
6. 使用相同的设置将图像序列导出为视频文件 发布 选项。通过时间轴中高亮显示、使用筛选选项或导出完整数据库文件来选择图像。选择所需的视频格式、帧率和文件保存位置。使用200 kV透射电子显微镜（TEM）获得的沸石降解实验视频已提供于 补充文件 3.
7. 将采集的图像与其元数据分别导出为 CSV 文件，方法是选择 元数据（CSV） 发布时的选项
   ​注意：原始图像和漂移校正后的图像将分别导出为独立的 CSV 文件（补充文件 4 和 补充文件 5).

4. 方法4： 原位 金在氧化铁纳米颗粒上的加热研究

1. 滴铸纳米催化剂（Au/FeO）_x) 悬浮于乙醇中的 原位 加热E芯片，一种微机电（MEM）样品支撑片，并使其自然晾干。将样品安装在 原位 加热样品台，将带有样品的样品台插入透射电子显微镜（TEM），并使用配套电缆将样品台连接至电源。利用TEM的控制装置定位样品的兴趣区域（ROI）。
   注意：本实验使用了与MVS软件完全集成的加热支架，可将温度元数据嵌入图像中。
2. 从 MVS 软件中选择适当的工作流程选项（在本示例中，选择 融合工作流程 使用了某一制造商的加热支架，但也可通过选择其他制造商的加热支架来替代 其他).
3. 按照工作流程提示，加载校准文件并执行设备检查，以确认夹持器与加热E芯片之间的电路连接.
4. 将显微镜连接至MVS软件，如之前步骤2.3-2.10所示（本示例中选择了剂量率、最大剂量、匹配相关性、漂移率和通道A温度的元数据值），并将样本ROI置于视野中央。
5. 打开 Fusion AX 标签并设置及施加温度。
6. 点击 通道A设置 按钮以进入温度控制设置。选择 温度 功能和 手动 控制模式
7. 点击 实验 按钮以访问实验控制。设置 斜率速率 至10 °C/s并 靶标 至 600 °C。单击 应用 开始实验。
   注意：可随时使用 MVS 软件右下角的快速访问按钮暂停或停止实验，无需打开 Fusion AX 表。
8. 当达到设定温度600 °C后，打开 Fusion AX 标签并选择 实验. 改变 斜率速率 至 2 °C 并且 靶标 至 800 °C。点击 应用 开始实验。
   注意：应用加热程序的方法取决于具体的设备和实验条件 原位 所使用的加热系统。上述用于实施温度梯度的步骤适用于本示例中所用的系统。
9. 使用标记功能突出显示实验过程中的任何事件或关注点，如步骤 2.10 所示。继续对样品成像，并根据需要调整温度曲线。完成后，点击 结束会话 并使用分析软件保存数据文件（代表结果部分讨论的数据库文件的部分内容已提供作为示例） 补充文件 6).
10. 打开分析软件以查看会话。在时间轴上绘制温度、模板形变因子、剂量率和累积剂量。根据步骤 3.6 和 3.7 中所述方法导出所需的图像和视频。图像和视频可选择是否叠加剂量分布图进行导出图4).

结果

本研究强调了使用 MVS 软件进行透射电子显微镜（TEM）成像和原位实验数据采集的实用性。in situ 实验的显微镜校准和条件设置通过 TEM 厂商默认的控制界面完成。初始设置完成后，本视频文章中所述的实验流程均通过 MVS 软件执行。除用于对比的沸石数据（使用 200 kV 冷场发射电子枪获得，见图 3D-F 和 Table 1）外，视频方案中所有实验及代表性数据均采用 300 kV 透射电子显微镜完成。所有元数据均由 MVS 软件自动采集，并与其对应的图像对齐。

启动软件并从菜单中选择适当的工作流程后，通过点击图像查看器最左侧工具栏中的连接按钮，建立与显微镜的连接，如图1A所示。当连接按钮处于高亮状态时，显微镜的图像及相关的元数据将自动传输至MVS软件，并显示在图像查看窗格中。这些图像及其相关元数据将按时间顺序保存在一个时间轴中，用户可随时打开、查看和分析该时间轴，而不会中断新数据向时间轴的持续记录（图1B）。用户可随时通过取消激活连接图标来中断数据流传输。

连接激活后，便可访问依赖于 MVS 软件框架的其他工作流程。在本视频方案所示示例中，使用 MVS 软件的其他功能前必须先执行剂量校准。剂量校准是由 MVS 软件控制的自动化过程；该过程使用专用的法拉第杯剂量校准支架，测量特定参数组合下的电子束电流和束斑面积。如图2所示，法拉第杯校准支架连接至外部皮安计，用于精确测量电子束电流。将支架插入显微镜后，需对准基准标记孔的中心，并在软件中输入待校准的电子束条件（束斑尺寸、光阑和放大倍数）。软件将针对每种选定条件的组合执行一系列校准步骤。在校准过程中，支架在集成的法拉第电流收集杯与通孔之间自动移动。皮安计在法拉第杯上测量每种透镜条件组合下的电流值；随后，软件移动样品台，使电子束在通孔中居中，并通过机器视觉算法确定电子束面积。这一系列测量建立了亮度/强度与电子束面积之间关系的特征曲线。由此，软件能够在实验过程中根据亮度/强度设置的变化推算出电子束面积，而无需考虑视场大小。软件利用测得的电子束电流和电子束面积数据，计算累积剂量和剂量率，并生成剂量校准文件。该过程实质上为透射电子显微镜（TEM）及其特定透镜条件定义了一个剂量“指纹”。完成剂量校准后，用户即可正常操作，自由调节放大倍数和亮度，而不会丢失剂量信息或需要手动记录¹⁷。校准完成后，取出剂量校准支架，即可像常规操作一样插入样品。TEM 和 STEM 模式的校准过程通常耗时不到10分钟。

在标定剂量条件后，采用高剂量率条件对一种 commercially purchased 的沸石纳米颗粒（ZSM-5）样品进行成像，以确定样品因损伤过重而无法提供结构信息的阈值（累积）剂量。将 ZSM-5 纳米颗粒分散于乙醇中，并滴加到常规铜制透射电镜（TEM）载网上。在 300 kV 的 TEM 模式下，使用 3 号束斑尺寸和 100 µm 聚光镜光阑对视野中的纳米颗粒进行连续成像。在高剂量率条件下，MVS 软件读取的剂量率为 519 e^-/Ų·s。持续对视野中的纳米颗粒进行成像，直至快速傅里叶变换（FFT）图谱中的衍射峰消失，表明晶体结构已发生降解，如图 3A-C 和补充文件 3所示。在 TEM 图像上叠加了标注信息（可在实验过程中实时添加，或在后续分析软件中添加），以显示日期和时间、剂量率、最大（累积）剂量以及放大倍数。实验过程中剂量率保持恒定，累积剂量（最大剂量）随时间增加而上升。连续成像 42 秒后，FFT 衍射峰开始消失（图 3B）。在成像 1 分 20 秒、累积剂量约为 60,000 e^-/Ų 时，FFT 衍射峰已完全消失（图 3C）。

为了证明该校准方法能够生成可量化的剂量测量结果，并可应用于在不同设置下运行的其他显微镜，我们使用一台200 kV冷场发射电子枪（FEG）透射电子显微镜（TEM）和束斑尺寸为1的条件，重复了相同的校准流程与沸石降解实验。该显微镜采用方法1中所述的相同程序进行校准，并按照方法2中描述的相同实验步骤，在新的束斑尺寸和光阑设置下进行实验。通过调整电子束参数，使两次实验之间的施加剂量率差异可忽略不计（499 e^-/Ų·s 与 519 e^-/Ų·s）。如图3D-F所示，并在表1中总结，经过1分50秒的连续成像和累计剂量达到58,230 e^-/Ų后，FFT衍射斑点完全消失，该结果与首次实验获得的数值一致。

MVS 软件可带来益处的一个示例 原位 通过加热实验展示了该实验的结果。一个典型的纳米催化剂样品，Au/FeO_x （按照已发表的方法合成）¹⁹），被选为示例系统，因为它在高温下会发生动态的形态和结构变化。这种由温度引起的移动性使得在温度变化过程中，由于样品自身的运动以及样品支撑体的热膨胀，难以将感兴趣区域（ROI）保持在视野中心¹⁸。随着 漂移校正 和 对焦辅助 在启用相关功能后，样品在800 °C下成像约30秒。在较高温度下，Au/FeO中的金纳米颗粒_x 沿氧化铁载体表面迁移并烧结形成更大的颗粒，如图所示 图4 以及以视频形式在 补充文件 7. 图5 显示一系列透射电子显微镜（TEM）快照（图 5A-F金/氧化铁（Au/FeO）中多孔区域的_x 纳米催化剂，在不同时间点记录（图 5G）期间 原位 加热实验。软件自动计算了感兴趣区域（ROI）的坐标漂移值。图中以图形方式展示了该序列图像在实验过程中的坐标漂移值与温度变化。 图 5G正如预期，随着温度梯度的升高，样品的协同漂移逐渐增加，漂移速率从约9 nm/min上升至约62 nm/min；当温度保持恒定时，漂移速率开始减缓并趋于平稳。尽管存在较高的漂移速率以及样品形貌的变化，在升温过程中仍可轻松获得高分辨率图像，揭示出多孔区域内部的动态变化，如图所示。 补充文件 8。参见 补充文件 9 有关下载说明和计算机配置要求。

图 2：电子剂量校准与追踪。（A）使用专用样品台进行剂量校准，该样品台在样品平面处设有电流收集器，用于测量束流强度。（B）探针设计特征示意图：左侧为法拉第杯；中间为基准孔；右侧为通孔（C）。在软件中可通过彩色编码图直观显示施加的电子剂量，以表示图像中不同区域的剂量暴露情况。请点击此处查看该图的高清版本。

图 3：电子束剂量诱导的沸石（ZSM-5）纳米颗粒降解。 （A–C）在 1 分 20 秒的时间内拍摄的快照，显示使用 300 kV 场发射电子枪（FEG）并在 519 e^-/Ų·s 的实测剂量率下获得的降解数据；沸石在 1 分 20 秒内发生降解。（D–E）在 1 分 50 秒的时间内拍摄的快照，显示使用 200 kV 冷场发射电子枪透射电子显微镜（TEM）并在 499 e^-/Ų·s 的电子束剂量率下获得的降解数据；插图显示快速傅里叶变换（FFT）衍射斑点随时间逐渐消失。比例尺为 60 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：AXON同步性技术应用机器视觉算法，用于追踪并稳定动态演化的样品。 实验过程中生成的元数据可沿时间轴绘制，使用户在浏览实验期间生成的图像序列时，能够快速将图像与其对应的元数据配对。（A-H） 一种纳米催化剂样品（Au/FeO_x）在800 °C下持续28秒的图像序列，其中（A-D）为叠加剂量图，（E-H）为未叠加剂量图。叠加图中的红色区域表示累积剂量较高的区域，黄色区域表示剂量较低的区域。高亮单个像素可显示该像素的累积剂量值。（E-H）图中的白色箭头指示实验过程中发生合并的两个颗粒，橙色箭头指示一个移动的金颗粒的轨迹。（I） 分析软件为A-H所示图像序列生成的实验时间轴。时间轴顶部的橙色圆点表示原始（未经数字校正）图像，蓝色圆点表示经过漂移校正的图像。橙色竖条表示与A-H各图对应的时间轴位置。比例尺为40 nm。请点击此处查看此图的放大版本。

图5Au/FeOx 纳米催化剂中多孔区域在不同时间点的透射电子显微镜快照。 MVS 软件即使在高漂移速率期间（例如在温度斜升过程中）也能通过应用载物台调整、电子束偏移和数字校正来稳定并居中样本，如机器视觉算法所示。A-F) Au/FeOx 纳米催化剂内部多孔区域的透射电子显微镜图像，记录于不同 (G) 时间点进行检测 原位 加热实验。在实验过程中，MVS 软件会自动计算并记录 ROI 的漂移速率。如图（G），随着温度曲线的变化（蓝线），漂移速率（橙线）随温度升高而增加，随温度保持恒定而降低。 请点击此处查看此图的放大版本。

显微镜类型	300 kV 场发射透射电子显微镜	200 kV 冷场发射透射电子显微镜
光斑尺寸/聚光镜2光阑	3/100 µm	1/100 µm
剂量率	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
通过快速傅里叶变换测量的结构损失 （累积剂量）	60,270 e-/A2	58,230 e-/A2

表1：不同显微镜获得的沸石降解结果的汇总比较。

补充文件1：打开剂量管理选项卡时的MVS软件界面截图。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：束流诱导沸石降解实验的 MVS 软件数据库文件。 该查看/分析软件可免费下载。下载说明及计算机配置要求详见补充文件 9。请点击此处下载此文件。

补充文件3：电子束诱导沸石降解的视频。 请点击此处下载该文件。

补充文件 4：CSV 文件 1（沸石降解：原始数据 [仅机械校正]） 请点击此处下载该文件。

补充文件 5：CSV 文件（沸石降解：漂移校正后 [机械 + 数字校正]） 请点击此处下载该文件。

补充文件 6：MVS 软件数据库文件 纳米催化剂 原位 加热实验 请点击此处下载此文件。

补充文件 7：800 °C 下纳米催化剂的视频，含剂量叠加图。 请点击此处下载该文件。

补充文件 8：纳米催化剂在温度 ramp 过程中伴随协调漂移值的视频。 请点击此处下载该文件。

补充文件9：免费分析软件下载说明。 请点击此处下载该文件。

讨论

透射电子显微镜（TEM）实验结果的解读通常依赖于多个相互关联的实验参数，例如显微镜设置、成像条件，以及在原位或工况条件下 原位 实验、环境变化或刺激^1,23准确分析大型透射电子显微镜（TEM）数据集需要操作人员投入大量精力，以在实验记录本或其他外部文档中准确记录每幅图像对应的各项条件和设置，尤其是在这些参数可能持续变化的情况下。随着TEM数据集在规模和复杂性上的不断增加，人工记录变得难以管理，关键信息可能被遗漏或记录错误。本文所述的MVS软件可整合实验过程中来自显微镜、探测器/相机以及其他系统（如 原位 样品架）并将其与相应的图像对齐。

除了元数据整合之外，该软件还应用机器视觉算法，通过结合空间、电子束和数字校正，利用其Drift Correct（漂移校正）和Focus Assist（对焦辅助）功能，实现对视野的追踪与稳定。当启用Drift Correct功能时，系统会使用导入MVS软件的第一幅图像生成一幅基于互相关算法的“模板”图像。随后，该模板会与实时传入的图像进行比对，以计算样品漂移或移动的方向和幅度。基于这些信息，MVS软件会自动施加必要的校正，通过调节以下至少一个参数，使图像特征保持在相同位置：样品台位置、电子束或图像偏移，以及数字图像校正。 Focus Assist功能则利用多种算法组合，为每幅图像分配一个称为“对焦评分”（focus score）的对焦值，并通过比较这些评分，确定需要施加的离焦校正方向和幅度，以保持样品始终处于焦点范围内。在STEM成像模式下，MVS软件通过一种专有的归一化方差算法来最大化对比度，从而分配对焦评分。在TEM模式下，则通过计算FFT中的径向强度总和来确定对焦评分。 当MVS软件无法准确计算图像的正确对焦评分时，其优化对焦的能力将受到限制。这种情况通常发生在显微镜未正确对中，或在标定过程中样品严重失焦，导致软件无法准确计算初始对焦评分值。对于具有清晰晶格条纹的样品，MVS软件在计算对焦评分时也可能遇到困难，因为FFT中的晶格条纹可能“压倒”对焦评分算法；因此，当样品偏离焦点时，对焦评分可能无法准确反映对焦状态的变化。相反，在低倍率下工作，或样品的FFT信号较弱时，同样难以获得可靠的对焦评分。 为缓解这些问题，MVS软件内置了多种可选的附加算法，用户可在默认设置不适用于特定样品时，选择其他算法来计算对焦评分。这些算法需根据具体实验情况进行逐一测试和应用，以确定最适合的方案。

通过使用模板形变因子来考虑样品结构随时间发生形态学变化的情况。该滤波器可由操作者调节，使配准算法能够考虑随时间推移发生的形态学变化。此外，软件会持续监测实时图像、显微镜设置以及相机或探测器设置，当样品结构发生变化，或操作者对显微镜、相机或探测器参数进行调整后，软件将自动触发模板更新。如图所示 图4, 图5, 补充文件 7，以及 补充文件 8MVS 软件可提供高效且即时的稳定效果，实现对动态移动或变化样品的高分辨率成像。尽管该软件能够控制极高的漂移或样品移动速率，例如在施加升温斜坡时所产生的那种情况 原位 实验中，如果样品移动或漂移过快，软件可控制的最大台面校正或电子束偏移存在一定的限制。该限制取决于图像更新速率、视场大小和漂移速率。对于特定的视场大小和图像更新速率，存在一个可校正的最大漂移速率；若物理运动无法跟上该速率，则校正过程可能终止或变得不稳定。根据生成的配准模板，当特征如 漂移校正 应用后，可生成额外的计算元数据。例如， 匹配相关性 是一组模板之间变化程度的数值记录，用于识别实验时间线中样本发生变化的时点。较高的匹配相关值对应于形态发生改变的样本，而较低的匹配相关值则对应于结构相对稳定的样本。匹配相关性在 原位 研究中，因为它可以图形化绘制，使用户能够快速定位系列图像中对应样品显著变化的图像。然而，需要注意的是，如果在采集过程中移动载物台或改变放大倍数，高匹配相关值也可能反映成像条件的变化，而非样品本身的变化。 漂移校正 功能保持活性。

本文介绍的校准流程采用一种独特的校准样品台和半自动化的校准程序，可在多种透镜条件下以最少的操作人员干预实现对电子束的精确校准。剂量校准程序通过安装在透射电子显微镜（TEM）上的MVS软件进行访问。MVS软件会自动读取相关的显微镜设置，并将所有测量数据保存下来，作为后续实验的参考。在某些TEM设备上，无法自动读取光阑或单色器的设置，此时操作人员必须在校准及使用过程中手动将这些参数输入MVS软件。软件内置提示功能，可根据程序提示帮助操作人员及时更新这些手动输入的设置。设计中采用内置电流收集器的样品台，而非依赖显微镜镜筒其他位置集成的电流收集装置，是经过深思熟虑的选择。这种设计可使电流收集器与样品处于同一平面，从而消除因电子束偏转或不同束流位置处光阑对电子吸收差异所导致的电流测量误差。MVS软件按照自动化流程，针对任意透镜条件组合测量电子束的电流和束斑面积。随后，软件可将这些实测的校准数据与相机或荧光屏的电流相关联，并在外推实验过程中放大倍数等参数变化对电子束面积的影响。生成的校准文件可立即投入使用，且当软件在未来会话中检测到相同设置时，会自动保存以供重复使用。尽管校准文件的有效期因不同显微镜而异，但作者发现，在数月内使用同一校准文件未观察到电流值出现显著变化。软件还内置了监控电子枪发射特性的程序，有助于维持校准的有效性，尤其适用于冷场发射电子枪（cold FEG emission guns）。

在不同显微镜系统之间进行定量剂量条件比较时，MVS 软件的关键功能包括剂量测量的归一化以及对样品电子束曝光的自动跟踪。在使用不同显微镜进行的相同实验中，ZSM-5 沸石样品因剂量引起的降解，在两种实验设置下均表现出完全的 FFT 斑点消失，对应的累积电子剂量或阈值电子剂量最大约为 60,000 e^-/Ų（当剂量速率为 ~500 e^-/Ų·s 时）。这些对比结果表明，该剂量软件能够实现可重复且定量的剂量测量。各实验中观察到完全 FFT 斑点消失时累积剂量的微小差异，可能是由于两台显微镜所采用的加速电压不同所致：较低的加速电压通常导致更多的辐射损伤路径，而较高的加速电压则通常引起更多的位移损伤²⁴。文献中关于 ZSM-5 纳米颗粒的临界剂量报道值范围为 9,000–14,000 e^-/Ų，其依据是首个 FFT 斑点的消失，而非所有 FFT 斑点的完全消失^25,26。在我们的结果中，首个 FFT 斑点消失对应的累积剂量约为 25,000 e^-/Ų。以往研究依赖于使用磷光屏测得的电流值，而已有充分文献证明，与法拉第杯相比，该方法会低估电子束电流测量值¹⁵。根据所选用的 FFT 峰值来追踪剂量，所确定的临界剂量可能相差两倍甚至更多。这表明较高空间频率的结构首先发生降解，且测量时所采用的晶带轴不同可能导致不同的数值结果（我们的研究聚焦于整个沸石晶体的 FFT 斑点，而非特定的结构特征）^25,26。这些技术方法和电流校准方式的差异，解释了我们实验结果与先前文献报道值之间的差别。

尽管电子剂量的相互作用是许多透射电子显微镜实验中的一个重要因素， 原位 液相电镜研究尤其容易受到这些效应的影响。电子束对液体的辐射分解会引发一系列化学活性物质的产生，这些物质可能与样品发生相互作用，从而增加分析的复杂性。在液相电镜实验中，所使用的剂量率或注量以及累积剂量均会影响因液体辐射分解而产生的自由基物种的浓度。^27,28因此，在整个实验过程中收集和记录累积剂量及剂量率的元数据，可实现图像与样品剂量历史之间的直接关联，是更准确地阐明和控制电子束在这些实验中影响的方法。尽管本方案未涉及，但在液相电镜中剂量管理功能应用的一个示例见于 图6.

图6：电子束诱导金纳米颗粒在生长过程中的变化 原位 液相电子显微镜实验 (A低倍STEM图像显示了颗粒生长的整体情况，并叠加了该区域累积剂量分布图。叠加图中红色区域表示累积剂量较高的区域，黄色区域表示累积剂量较低的区域。使用光标高亮单个像素或利用内置绘图工具在某一区域绘制方框，可显示该像素或区域的累积剂量。比例尺为2 µm。B,C橙色方框（b，c）所示区域的更高倍数STEM图像 A. 区域b暴露于较高的累积剂量（10.811 e^-/Ų) 所含颗粒大于区域 c 中的颗粒，因为区域 c 暴露于较低的累积剂量（0.032 e）^-/Ų). 请点击此处查看此图的放大版本。

增强的剂量率和累积剂量元数据简化了对剂量依赖性纳米材料生长与降解路径的分析。图6展示了在液相电子显微镜实验中，电子束诱导水中氯金酸（HAuCl₃）离子溶液还原的过程。从图6A中的彩色剂量图叠加可以看出，累积电子剂量显著影响所生成纳米颗粒的尺寸和形貌^29,30,31,32。低倍STEM概览图显示了暴露于高（红色）和低（黄色）累积剂量的区域。高剂量区域的颗粒尺寸大于低累积剂量区域的颗粒。由于剂量元数据已直接以像素级精度嵌入每幅图像中，液相电子显微镜实验中电子剂量的复杂效应现在可以以前所未有的方式进行系统性分析。

在本方案中，我们展示了MVS软件能够以逐像素为基础，为校准、监测和追踪电子剂量以及传递到样品的总剂量提供一套全面的解决方案。这一能力为成像对电子剂量敏感的样品以及理解电子束相互作用开辟了新的范式。对于液相透射电镜（liquid-EM）实验而言，这一点尤为令人振奋，因为它将有助于更有效地探究电子剂量所起的作用，并提高实验的可重复性。我们希望这一新框架能够实现对剂量率和累积剂量信息的精确采集，促进将此类数据与科研社区共享，从而更准确地解读透射电镜（TEM）结果，并通过支持FAIR原则的数据报告与分析，推动科学合作与数据共享。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ARM200F CFEG	JEOL		透射电子显微镜 (200 kV)
AXON DOSE 校准支架	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	用于赛默飞世尔科技透射电子显微镜的剂量校准与管理硬件套件
AXON DOSE 软件：  版本 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	剂量校准与管理软件
AXON Studio 软件：版本 10.6.5.3	Protochips, Inc.	无部件编号。 可在  success.protochips.com 下载	用于 AXON 数据集的离线分析软件。  AXON Studio 软件的免费副本可在以下网址下载：  success.protochips.com
AXON Synchronicity 核心模块	Protochips, Inc.	AXON-CORE	同步软件的硬件组件
AXON Synchronicity 软件：  版本 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	同步软件
Fusion 原位加热 E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	带碳膜的样品支撑 E-chip。  与原位加热系统配合使用
Fusion Select 原位加热系统	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	用于赛默飞世尔科技透射电子显微镜的原位 MEMS 加热系统。
三氯化金（以金计 50%）水合物 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	用于制备 Au/FeOx 纳米催化剂。  合成方法参照 C. Sze 等人发表于《Materials Letters》36 (1–4), 11–16 (1998) 的共沉淀法
三氧化二铁 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	用于制备 Au/FeOx 纳米催化剂。  合成方法参照 C. Sze 等人发表于《Materials Letters》36 (1–4), 11–16 (1998) 的共沉淀法
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Scientific		透射电子显微镜 (300 kV)
分子筛 ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	纳米催化剂样品：  80 SiO2/Al2O3 摩尔比