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用于评估结核病疫苗效力的微菌落形成单位检测法

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DOI：

10.3791/65447

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2023年7月28日

 , 
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

本文内容

摘要

菌落形成单位（CFU）的测定是定量细菌（包括需要数周时间才能形成可见菌落的Mycobacterium tuberculosis）的金标准技术。本文介绍一种微型菌落形成单位（micro-CFU）测定方法，该方法提高了时间效率，减少了实验室空间和试剂成本，并可扩展应用于中高通量实验。

摘要

结核病（TB）是全球由传染病原体导致死亡的首要原因，2022年造成160万人死亡，仅在2019至2021年新冠疫情流行期间被COVID-19超越。该疾病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起。牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）减毒株卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一可用的结核病疫苗，也是全球使用时间最长的获批疫苗，至今仍在广泛应用。目前，有12种疫苗正处于临床试验阶段，另有数十种疫苗处于临床前研发中。在临床前研究中评估结核病疫苗有效性的首选方法是菌落形成单位（CFU）计数法。这一方法耗时较长，完成检测需4至6周，需要大量实验室空间和培养箱，试剂成本高，且易受污染。本文介绍一种优化的菌落计数方法——微量化CFU（mCFU），可为分析M.tb疫苗效力结果提供简单而快速的解决方案。mCFU检测所需的试剂用量仅为传统方法的十分之一，培养时间缩短至原来的三分之一，仅需1至2周即可完成，同时减少了实验室空间占用和试剂成本，并显著降低了处理大量M.tb所带来的健康与安全风险。此外，为评估结核病疫苗的效力，样本可能来源于多种途径，包括接种疫苗后感染分枝杆菌的动物组织。我们还描述了一种优化的方法，用于制备单细胞、均一且高质量的分枝杆菌培养物，适用于感染研究。最后，我们建议在结核病疫苗临床前 efficacy 评估研究中普遍采用这些方法，从而最终缩短结核病疫苗的研发周期。

引言

结核病（TB）是全球由单一传染性病原体——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的致死人数最多的疾病，其死亡人数超过任何其他病原体所致疾病。2021年，结核病导致160万人死亡，在2019至2021年新冠大流行期间，其死亡人数仅次于COVID-191。此外，根据世界卫生组织2022年全球结核病报告，新冠大流行导致新发结核病病例数增加。世卫组织还报告称，此期间被诊断出结核病的人数大幅下降，这可能导致未来结核病病例数进一步上升1。

卡介苗（BCG）是一种减毒活疫苗株，来源于致病性分枝杆菌 Mycobacterium bovis，100 多年前首次用作疫苗。这是目前唯一针对结核病的疫苗，也是世界上仍在使用的最古老的获批疫苗2,3目前，有12种疫苗正处于不同阶段的临床试验中4，且有数十种疫苗正处于临床前研发阶段5,6疫苗的临床前评估包括对其安全性和免疫原性的评价7可在多种动物模型中获得，例如斑马鱼、小鼠、豚鼠、兔、牛和非人灵长类动物8,9,10此外，评估疫苗诱导针对保护性反应的能力 M.tb 感染和/或传播，即疫苗效力，需要一个 M.tb 挑战 体内5,11有趣的是，卡介苗接种可诱导产生非特异性效应，从而影响其他细菌和病毒病原体的存活12,13 通过训练免疫的机制14为量化感染动物体内可存活的细菌载量，首选方法是通过菌落形成单位（CFU）测定对细菌菌落进行计数。5,15菌落形成单位（CFU）是一种用于估计在特定培养条件下能够形成菌落的微生物（细菌或真菌）数量的单位。CFU来源于具有活力并能复制的微生物，但难以准确估算每个菌落内活体微生物的绝对数量。一个菌落是由单个还是多个微生物形成的，目前尚不明确。CFU这一单位正反映了这种不确定性，因此同一标本的重复检测之间常可观察到较大的变异性。该检测耗时较长，需要经过专门培训的技术人员在生物安全三级（BSL3）实验室中操作，且需充足的实验空间和培养箱资源，完成整个培养过程通常需要4至6周时间，同时存在污染风险。

本研究中，我们描述了一种优化的菌落计数方法——微小菌落形成单位法（mCFU），并提供了一种简单且快速的结果分析方案15,16,17,18,19,20。mCFU 检测所需的试剂用量仅为传统方法的十分之一，培养时间缩短至原来的三分之一，通常在 1 至 2 周内即可完成，同时减少了实验室空间占用和试剂成本，并显著降低了处理大量结核分枝杆菌（M.tb）所带来的健康与安全风险。我们建议，该方法应被广泛应用于疫苗效力评估的临床前研究中，从而显著缩短抗结核疫苗的研发周期。最后，这种优化的 CFU 计数方法不仅可用于定量结核分枝杆菌（Mycobacteria），还可用于其他细菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）和青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）21。

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方案

注意：此处描述的实验方案适用于卡介苗（BCG），但也可应用于其他分枝杆菌。当缺乏生物安全三级（BSL3）设施时，卡介苗可作为结核病实验的替代细菌22。使用卡介苗的以下操作应在生物安全二级（BSL2）实验室中进行，并遵循针对危害性第二类微生物操作的相应生物安全指南和良好实验室规范。

1. 培养基制备

  1. 根据供应商说明，制备添加了10% (v/v) 油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶（OADC）增补剂的Middlebrook 7H9肉汤，并加入0.05% (v/v) 的tyloxapol进行补充。
    注：Tyloxapol是一种非离子型液态聚合物，曾用作表面活性剂以防止细菌聚集成团16。
  2. 根据供应商说明，制备添加了10% (v/v) OADC增补剂的Middlebrook 7H10固体培养基。
  3. 每平方培养皿（120 mm × 120 mm）分装40 mL培养基。让培养皿干燥以减少琼脂表面的冷凝现象。
    注：此特定尺寸的培养皿对于直接转移96孔板中的至少96个液滴至关重要。培养皿充分干燥将有助于后续接种少量细菌悬液液滴，并防止液滴扩散。
  4. 选用RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium）或DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）制备感染用培养基。无论哪种情况，均需添加10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。切勿向培养基中添加青霉素和链霉素。

2. 样品制备

  1. 从多种来源获取样本。通常，为了通过定量菌落形成单位（CFU）来评估结核病疫苗的有效性，需采集接种疫苗与未接种疫苗动物组织的样本。例如，小鼠的肺和脾11 或猕猴肺、胸腔和外周淋巴结、脾脏、肝脏、皮肤、血液、骨髓及支气管肺泡灌洗液23或者，从 体外 感染了BCG的巨噬细胞/树突状细胞/中性粒细胞培养物18,19,20, 24,25,26.

3. BCG 培养物的制备

注意：在结核病疫苗的体内研究中，目标是提高卡介苗（BCG）的保护效果，因此通常将接种BCG的组别作为对照组。用于人类接种的BCG菌株非常适合在动物模型中进行测试。在此情况下，必须按照供应商的说明27重新配制BCG菌液。然而，也可在实验室内自行制备用于体内研究的BCG培养物11。已有多个研究成功建立了用于体外感染实验的单细胞、均一且高质量的BCG培养方法11, 16, 18,19,20, 26, 28, 29，该方法同样适用于动物攻毒实验。

  1. 在37 °C、200 rpm振荡条件下，将50 mL BCG培养于7H9液体培养基中。根据实验需求调整培养体积。
  2. 连续8–10天，每天取100 µL培养物，加入900 µL PBS，置于1 mL比色皿中混匀。随后使用分光光度计测定细菌的光密度（λ=600 nm处的OD值；OD600），并根据测定值绘制生长曲线。确定培养物的对数中期（即单位时间内OD值稳定倍增的阶段）。
  3. 进行下一轮培养，按照步骤3.1和3.2孵育至对数中/后期。以上一步获得的数据为参考，确保培养物未进入稳定期（即OD值开始趋于稳定），以维持高质量的活性细菌培养状态。
  4. 在对数中/后期收集培养物，以3000 × g离心10分钟，弃去上清液。
  5. 加入10 mL PBS洗涤细菌，以3000 × g离心10分钟，弃去上清液。
  6. 用5 mL感染用培养基重悬细菌，将离心管置于超声波清洗仪中，80 Hz全功率处理15分钟。
  7. 以1000 × g离心10分钟，小心收集上清液，避免接触沉淀物（沉淀富含细菌团块，高质量BCG培养中应去除），弃去沉淀。
  8. 测定上清液的OD值。在此条件下，处于对数生长期、OD600为0.1的培养物相当于1 × 107 CFU/mL。
    注意：各实验室在开展实验前应自行绘制BCG生长曲线，建立分光光度计测得的OD600与CFU之间的线性回归关系。请注意，不同分光光度计的光程长度不同，可能导致同一样品的读数存在差异。
  9. 通过简单计算确定每孔宿主细胞培养物需加入的细菌数量。每个宿主细胞对应的细菌数称为感染复数（Multiplicity of Infection, MOI）。建议采用每个宿主细胞10个细菌的MOI，这是BCG感染实验中最常用的MOI值。

4. 微菌落形成单位实验

注意：在完成一个 在体 或 体外 感染实验完成后，可通过mCFU对细菌进行计数。 体内 研究中，样品必须首先在珠磨机或其他组织匀浆器中进行匀浆处理。对于 体外 感染卡介苗的巨噬细胞/树突状细胞/中性粒细胞培养物，必须使用非离子型去垢剂（例如，0.05% 的非离子、非变性去垢剂溶液）进行裂解。

  1. 使用 96 孔板进行连续稀释：按照 图 1A 中的方案，在无菌 96 孔板中对裂解液进行 10 倍系列稀释。将裂解液分配至 A 行和 E 行。每块板最多可处理 24 个样品和/或重复组。
  2. 向其余各孔中加入 180 µL 的 dH2O，以进行系列稀释。
  3. 使用 12 通道移液器，重悬 A 行中的裂解液，并将 20 µL 转移至 B 行（20 µL 裂解液 + 180 µL dH2O）。充分混匀。依次将此步骤在 B 行至 C 行中逐行重复，直至 D 行完成最终稀释。
    注意：我们通常进行三次稀释（100、101、102、103），因此每组 12 个样品和/或重复组使用板上的 4 行（A–D 或 E–H）。
  4. 微滴涂布：根据 图 1B，使用 0.5–10 µL 多通道移液器（推荐使用细尖吸头）从 96 孔板的每一行中转移 5 µL 至固体培养基方板上。
  5. 在缓慢移液 5 µL 液滴时，使液滴轻微接触琼脂表面。这有助于将液滴从吸头转移至琼脂表面，减少液体滞留在吸头内部的可能性。
  6. 待液滴干燥后，盖上琼脂平板，并在 37 °C 下培养，同时监测细菌生长。可选：将琼脂平板置于密封塑料袋中培养，以防止平板干燥。
  7. 微菌落计数：培养约 6–10 天后，检查肉眼可见的单个菌落（图 2）。
  8. 使用倒置光学显微镜或放大镜的最低倍物镜（4× 或更低）对菌落进行计数。计数应在菌落数量介于 30 至 300 之间的稀释度下进行。也可使用相机拍摄液滴图像，在计算机上手动计数菌落，或使用 ImageJ 等软件实现菌落自动计数。
  9. 为以 CFU/mL 表示细胞数量，使用以下公式：
    细菌浓度公式，CFU/mL = C × 1000/V × 1/Dil；菌落计数方程。
    其中 C = 计数的菌落数，V = 点样体积（µL），Dil = 计数菌落时对应的稀释倍数（100、101、102、103）。例如，若在 102 稀释度下的 5 µL 液滴中计数到 30 个菌落，则：
    细菌浓度计算公式，CFU/mL，教学图解，微生物分析。

用于裂解液分析的连续稀释法示意图，显示微孔板和移液器。
图1。mCFU实验方案的示意图。（A）在96孔板中对含BCG的裂解液进行10倍系列稀释。（B）方形培养皿中含有固体培养基，并覆盖96个液滴，每个液滴5 µL。使用多通道移液器直接从96孔板中将液滴转移至培养皿。图片由BioRender.com生成。请点击此处查看该图的放大版本。

琼脂平板上细菌菌落的稀释系列；展示连续稀释；微生物学实验。
图 2．卡介苗（BCG）经10天培养后形成的微菌落形成单位。 左侧为一个方形培养皿的照片，其上覆盖有96个液滴，每个液滴体积为5 µL，如图 1B中所示。右侧为3个液滴的单独照片，分别对应原始裂解液（100）及两个稀释度（101、102）。照片使用配备18-55 mm变焦镜头（培养皿）或105 mm微距镜头（液滴）的数码单反相机拍摄。请点击此处查看该图的高清版本。

在 Fiji（ImageJ）中进行微菌落形成单位计数

注意：微滴菌落形成单位（mCFU）法可用于对大量样本进行菌落形成单位（CFU）的定量分析。可记录微滴的图像，以便后续分析，辅助菌落计数。多种摄影设备均可提供满足此目的的足够图像质量，包括数码相机、网络摄像头、配备摄像头的显微镜和放大镜，以及手机。免费的图像分析软件（如 ImageJ）可实现对这些图像的手动或自动菌落计数。为演示两种计数方法，本实验将使用 Fiji，它是 ImageJ 的一个发行版本，集成了多种用于科学图像分析的工具30。Fiji 可从 https://fiji.sc/ 下载。

  1. 人工计数方法
    1. 在 Fiji 中打开包含微菌落形成单位（mCFU）的图像。选择 插件 > 分析 > 细胞计数器（Cell Counter）。
    2. 在细胞计数器菜单中，选择 初始化 ，然后选择一个计数器（例如，类型1）。
    3. 通过单击每一个菌落进行计数。每次点击将在图像上显示标记，并更新计数器（图3）。若需撤销误操作的点击，请选择 删除（Delete）。
    4. 记录计数器上显示的数值。点击 重置（Reset） 按钮以清零计数，并打开新图像以继续计数其他样本。
      注意：有关该插件的更多使用说明，请访问 https://imagej.net/plugins/cell-counter。
  2. 自动计数方法
    1. 在 Fiji 中打开包含 mCFU 的图像。选择 图像 > 类型 > 8位（8-bit），将图像转换为8位灰度图像。
    2. 在工具栏中选择 椭圆（Oval） 工具，在菌落区域周围绘制一个椭圆（图4A）。绘制完成后可对椭圆进行调整。
    3. 选择 编辑 > 清除外部（Clear Outside），以去除椭圆区域外的干扰（图4B）。然后选择 图像 > 调整 > 阈值（Threshold）。
    4. 在阈值窗口中调节滑块，使菌落显示为红色，同时尽量减少背景噪声（图4C）。
    5. 点击 应用（Apply） 并关闭阈值窗口，生成一幅黑白图像（图4D）。
    6. 选择 分析 > 分析颗粒（Analyze Particles）。在分析颗粒窗口中，设定菌落面积范围（1 至无穷大，单位为像素平方）和圆形度（0 至 1，其中 1 表示完美圆形；图4E）。
    7. 在“显示（Show）”下拉菜单中选择 轮廓（Outlines）。勾选 显示结果（Display Results），以在结果窗口中显示每个菌落的详细测量数据。勾选 清除结果（Clear Results） 以清除先前的测量记录。勾选 汇总（Summarize） 以显示测量结果的汇总统计（图4E）。
    8. 点击 确定（OK） 开始分析。新窗口将显示所有被识别并计数的菌落轮廓。结果窗口列出每个菌落的详细信息，汇总结果窗口则显示菌落总数（图4F）。
      ​注意：面积和圆形度的设定参数会因图像分辨率、放大倍数以及菌落的大小和形状而异。建议重复多次调整，直至找到能准确识别所有菌落的最佳参数。有关分析颗粒插件的更多说明，请访问 https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap。

使用 ImageJ 软件进行细胞计数分析；显微镜图像显示细胞计数器界面。
图 3。使用 Fiji 软件中的细胞计数器插件手动计数 mCFU 的方法。 蓝色圆点表示用户已点击的菌落。右侧菜单显示当前已计数的菌落数量（计数结果为 41）。请点击此处查看该图的放大版本。

颗粒分析工作流程、图像处理步骤、阈值设定、区域选择、数据提取、示意图。
图 4．使用 Fiji 软件自动计数 mCFU 的方法。（A, B）使用椭圆选区工具选择包含菌落的兴趣区域，并通过“清除外部”命令去除外部区域。（C, D）利用阈值工具生成菌落的黑白图像。（E, F）使用“分析颗粒”工具对菌落数量进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

此处所述的mCFU实验方法可将单个培养皿中获取的信息量提升至原来的至少96倍。 图5 展示了两种药物递送方法在沙奎那韦（SQV）再利用中的比较31,32 作为一种宿主导向药物用于治疗结核病。在此实验中，使用了四种不同的菌株 结核分枝杆菌 用于感染原代人巨噬细胞。 M. tuberculosis H37Rv 实验室菌株及三株由葡萄牙国家卫生研究院 Ricardo Jorge 博士研究所（INSA）从活动性结核病患者中分离的临床菌株：一株药物敏感菌株（INSA 编号 33427）、一株多重耐药（MDR）菌株（INSA 编号 34192）和一株广泛耐药（XDR）菌株（INSA 编号 163761）。每种菌株感染后进一步分为八种不同的处理条件，将三种不同浓度的游离药物或脂质体载药与相应的未处理对照组进行比较。最终，每种条件在感染后四个不同时间点进行分析。为定量细胞内细菌生长，每个时间点提取的裂解液总量为 32 份，随后对每份裂解液进行...

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讨论

结核病是一个日益重要的公共卫生问题，尤其在中低收入国家。在新冠大流行期间，结核病诊断和治疗的医疗环境受到干扰，对新发病例的发生率产生了负面影响1。此外，耐多药和广泛耐药的 M.tb 菌株以及 M.tb 与 HIV 的共感染问题亟需解决，以控制这一流行病1,34。目前已有多种旨在替代或改进卡介苗（BCG）的新疫苗处于临床试验阶段，未来几年可能有新的疫苗上市35。针对结核病的新疫苗候选物的开发依赖于使用多种动物模型开展的临床前研究。在动物模型中评估疫苗效力需要对感染器官中的细菌负荷进行定量，以证明疫苗的保护效果5,36。目前已有直接和间接方法用于定量感染小鼠和非人灵长类动物体内的细菌负荷。直接方法包括组织学切片制备以及使用荧光染料金胺-O和齐-尼染色法对细菌进行染色

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披露

DP 和 PJGB 宣称，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本工作获得了中国天主教大学医学院内部资金的支持。́葡萄牙科学基金会（Fundação para a Ciência e a Tecnologia，FCT）资助项目编号为 UIDP/04279/2020、UIDB/04279/2020 和 EXPL/SAU-INF/0742/2021 的外部资金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔板VWR734-2781
DSLR 15-55 mm 镜头NikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR 相机NikonD3400
DSLR 微距镜头SigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
胎牛血清Gibco10270106
Fiji 软件https://fiji.sc/Fiji 是一款由多个实验室、机构和个人支持的开源软件，包含所有必需的插件。
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
多通道移液器 (0.5 - 10 µl)GilsonFA10013
多通道移液器 (20 - 200 µl)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG 美国典型培养物保藏中心ATCC35734菌株 TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC 增补剂BD211886
磷酸盐缓冲液 (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 培养基Gibco21875091
丙酮酸钠Gibco11360-070
紫外分光光度计 UV-6300PCVWR634-6041
方形培养皿 120 x 120 mmCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
超声波清洗仪 Elma P 30 HVWR142-0051

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