推拿手法减轻膝骨关节炎大鼠的炎症与软骨丢失

摘要

我们提出了一种针对石膏固定诱导的膝骨关节炎大鼠进行推拿操作的实验方案。根据初步研究结果，该方法的疗效可能依赖于减轻炎症反应和减缓软骨损伤。

摘要

临床试验表明，推拿手法对治疗膝骨关节炎（KOA）有效，但仍需进一步研究其作用机制。因此，建立膝骨关节炎动物模型的手法干预方法至关重要。本方案为KOA大鼠的推拿干预提供了标准化操作流程，并初步探讨了推拿治疗KOA的作用机制。本研究在大鼠膝关节周围5个穴位应用按揉手法（一种指按并揉动体表特定部位的推拿手法）。通过手指压力记录对操作的力度和频率进行了标准化，并在方案中详细描述了大鼠在接受操作时的体位。推拿疗效可通过疼痛行为学测试及滑膜和软骨的显微结构观察进行评估。KOA大鼠经推拿后疼痛行为显著改善。推拿组滑膜组织的炎性浸润减轻，肿瘤坏死因子（TNF）-α表达显著降低。与对照组相比，推拿组软骨细胞凋亡更少。本研究为KOA大鼠的推拿操作提供了标准化方案，并初步证明推拿的治疗作用可能与减轻滑膜炎症及延缓软骨细胞凋亡有关。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种退行性疾病，主要表现为关节疼痛。关节软骨的纤维化、裂纹、溃疡和缺失是该疾病的主要病因¹。KOA 患病率较高，可能对患者的日常生活造成严重影响，严重时可导致残疾。在 45 至 84 岁人群中，KOA 的患病率随年龄增长而上升，85 岁及以上人群的患病率为 15%，且以女性为主^2,3。此外，KOA 可能给个人和社会带来沉重的经济负担。一项调查显示，每人每年用于 KOA 的直接医疗费用高达 8,858 ± 5,120 美元⁴。随着社会老龄化加剧，KOA 已成为全球性的健康问题和重大社会问题，同时也是科学研究的热点课题。

基于证据的研究表明，推拿手法在治疗膝骨关节炎（KOA）方面具有显著疗效⁵。推拿手法可缓解KOA患者的疼痛并改善功能障碍，其机制与抗炎作用相关^6,7。学者发现，在兔KOA模型中，推拿手法有效抑制了炎症因子白细胞介素（IL）-β和5-羟色胺的表达，并延缓了关节软骨的退变过程⁸。这提示推拿可促进病变部位的血液循环和新陈代谢，有助于清除IL-1、IL-6及肿瘤坏死因子（TNF）-α等炎症因子，从而缓解KOA的临床症状⁹。此外，通过推拿手法对关节实施被动运动，可促进滑液向关节软骨的渗透与扩散，改善组织营养代谢¹⁰。其他研究还表明，推拿手法能够有效改善KOA患者的生物力学指标¹¹。作用于软组织的手法可改善肢体的应力分布，增强平衡功能^12,13。同时，结合一定的关节调整手法，还可调节下肢力线，纠正异常步态^14,15。

推拿手法治疗膝骨关节炎（KOA）的作用机制仍有待探索，因此有必要开展实验研究。推拿在实验动物中应用的关键在于造模、动物固定和干预方法的标准化¹⁶。造模方法决定了实验动物是否能够表现出疾病的特征；而适当的固定方法则有助于推拿手法的实施，并更真实地反映推拿的疗效。其中，干预方法的标准化是推拿手法研究中最困难的部分。2010年，中国针灸标准基本体系提出了实验动物的穴位定位标准，为动物实验中的针灸和推拿操作提供了可能性¹⁷。然而，推拿手法的标准化仍存在诸多困难。推拿手法种类繁多¹⁸，具体手法的选择主要取决于所治疗的疾病以及操作者所依据的治疗理论。在推拿治疗KOA的研究中，点按法（以拇指或肘部按压特定穴位）、一指禅推法（通过拇指摆动进行的推法）以及按揉法（以手指或手掌按压并揉动体表特定部位）受到更多关注¹⁹。按揉法是应用最广泛的推拿手法之一，通过按压与揉动相结合，带动皮下组织运动²⁰。在穴位上实施按揉法可促进血液循环、缓解疼痛，体现了推拿治疗KOA的治疗作用¹⁹。

本方案将详细描述对膝骨关节炎大鼠进行按压和揉捏操作的手法，包括所选穴位、操作强度与频率以及大鼠的体位，以期为今后的研究提供参考。

方案

本研究已通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物伦理委员会的动物伦理审查（YYLAC-2022-166）。

1. 实验动物准备与分组

1. 动物准备
   1. 在室温（18-21 °C）、湿度40%-50%、12 h:12 h昼夜节律条件下，饲养共10只健康的SPF级SD雌性大鼠，体重为200-220 g。进行与疼痛相关的动物实验时，须严格遵守动物伦理指南及相关规定。
2. 动物分组
   1. 将大鼠随机分为推拿组和对照组。造模后，对推拿组大鼠进行按揉手法干预，持续21天。在推拿组接受治疗的同时，将对照组大鼠置于相同的推拿室内，并放入黑色布袋中静置。

2. 动物模型构建

1. 动物麻醉
   1. 使用异氟烷进行气体麻醉。将大鼠放入诱导箱中，诱导浓度为3%。将大鼠放入后轻轻摇晃诱导箱，当大鼠翻转且无能力恢复至俯卧位时，确认麻醉成功。
   2. 将大鼠从诱导箱中取出，并将其鼻部固定于麻醉面罩中。将异氟烷浓度调整为2%以维持麻醉状态。通过夹捏大鼠足爪无反应来确认麻醉深度。麻醉期间为大鼠涂抹眼膏，以防止因眼睑无法闭合而导致角膜干燥。
2. 造模方法²¹​
   1. 使用剃毛机去除大鼠右后肢的毛发。在大鼠右踝关节与髋关节之间放置医用棉垫。用5–6层湿润的石膏绷带均匀固定右膝关节于180°伸展位。从踝关节开始螺旋缠绕石膏绷带，每圈覆盖前一圈的1/3。使用吹风机干燥并硬化石膏。
   2. 待石膏绷带干燥硬化后，在其外部包裹义齿基托材料，以固定石膏并防止被啃咬。
   3. 混合义齿基托材料至具有黏性，并将其黏附于石膏外侧（混合物不应超出绷带边缘，图1）。待混合物硬化后，关闭麻醉机，等待动物自然苏醒。在大鼠苏醒前需密切监护，防止发生麻醉意外。
   4. 将石膏适当固定于大鼠右后肢，过紧会限制血液循环，过松则易脱落。观察肢体末端的血液循环情况。若发现末端肢体肿胀或出现紫绀，应及时剪开部分石膏以恢复血流。若石膏断裂且无法维持下肢伸展状态，应重新制作石膏固定。
   5. 持续固定3周后拆除石膏。使用手术剪剪除外层的义齿基托材料及石膏绷带。用生理盐水冲洗大鼠下肢，并用纱布擦干。若存在局部皮肤损伤，应用碘伏进行消毒。
3. 模型验证²²
   1. 基于X射线的验证
      1. 造模结束后第1天对右膝关节进行X射线检查。取仰卧位，髋关节屈曲30°，膝关节伸展0°，髋关节外展15°，拍摄正位X光片。确保髌骨正对膝关节前方，X射线球管距离膝关节110 mm。
      2. 取右侧卧位，右髋关节屈曲30°，右膝关节伸展0°，拍摄侧位X光片；同时使左下肢髋关节屈曲70°，膝关节屈曲45°，X射线球管距离膝关节110 mm。检测参数设置为：曝光电压50 kV，电流250 mA，曝光剂量32 mAs，曝光时间128 ms。
      3. 与正常大鼠X射线图像比较，观察造模后膝关节X射线是否显示关节间隙变窄，并在关节边缘出现骨赘增生。
   2. 国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分²³
      1. 将大鼠放入安乐死箱中，以每分钟30%–70%笼体体积的速度通入CO₂。当检测到大鼠不动、无呼吸、瞳孔散大时，停止通入CO₂。再观察2分钟以确认死亡。
         ​注：在CO₂安乐死后可进行颈椎脱臼作为二次确认死亡的方法。将大鼠固定于操作台，一手握住其尾部，另一手拇指与食指按压其头部并向下施力。听到断裂声，同时大鼠运动和心跳完全停止时，确认死亡。
      2. 将大鼠仰卧位固定于泡沫板上，用注射针头固定，右后肢呈外展、外旋及屈曲状态。用手术剪提起膝关节周围的皮肤，切开皮肤后继续切开皮下筋膜，暴露膝关节周围肌肉。
      3. 用骨剪剪断股骨和胫骨干，取出右膝关节。轻柔去除关节外多余的软组织，如肌肉和韧带。
      4. 将关节置于4%多聚甲醛中，在4 °C条件下固定24–48小时。随后将关节置于10%甲酸溶液中脱钙3天，直至骨组织可用针轻易刺穿。
      5. 在通风橱中放置并修整脱钙后的组织，转移至脱水机中的脱水盒内。依次加入75%乙醇4小时，90%乙醇2小时，95%乙醇1小时，无水乙醇30分钟，更换新鲜无水乙醇再处理30分钟，酒精苯5–10分钟，二甲苯5–10分钟，更换新鲜二甲苯再处理5–10分钟，石蜡浸蜡1小时，更换新鲜石蜡再浸蜡1小时，最后再更换新鲜石蜡浸蜡1小时，完成脱水及透明浸蜡过程。
      6. 将组织放入包埋机中进行包埋。待石蜡凝固后，将蜡块切成4 µm厚的切片，在温水中展平切片，贴附于载玻片上并烘干。室温保存。
      7. 观察软骨样本，并根据骨关节炎软骨组织病理学分级评估标准进行评分（表1）²³。若造模后大鼠的评分显著高于正常大鼠，则表明造模成功。

表1. 骨关节炎软骨组织病理学分级评估。 分级表示病变侵入软骨的深度。总评分 = 分级 × 分期。正常关节为0分，重度关节炎为24分。请点击此处下载该表格。

图1．大鼠用石膏固定。 大鼠麻醉后，将其右下肢用石膏绷带包裹，固定于过伸位，并在外侧覆盖一层义齿基托材料。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 推拿手法

1. 应用领域
   1. 选择大鼠右侧后肢共5个穴位，包括ST34、ST35、SP10、EX-LE4和BL40（图2）。根据腧穴定位原则确定腧穴位置 ²⁴.
2. 应用时的体位
   1. 将一块黑色布料裁剪成一个9 cm × 15 cm的袋子，一侧开口，并用绳子扎紧开口。在进行推拿操作前，轻轻拉拽大鼠尾巴，使其钻入袋内，并将后肢露出袋外。
   2. 用一只手将大鼠保持在俯卧位，固定其尾巴和后肢，另一只手在特定穴位上进行按压和揉捏操作图3).
3. 推拿手法
   1. 对右后肢的5个穴位依次进行按揉操作，每个穴位2分钟。操作时，术者以拇指指腹按压选定的穴位，做有节律的按揉动作，带动皮肤及皮下组织做环形运动。
   2. 使用手指压力记录（单位：牛顿）以确保操作的强度和频率保持一致。将强度维持在3-5 N之间，频率保持为2 Hz。图4每天进行一次操作，持续21天。

图 2．针灸穴位位置。 SP10 位于大鼠内侧膝关节上方 5 mm 处。ST34 位于大鼠外侧膝关节上方 5 mm 处。EX-LE4 位于大鼠膝韧带内侧。ST35 位于大鼠膝韧带外侧。BL40 位于腘窝横纹中点。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。在大鼠身上应用推拿操作。 将大鼠置于黑色袋中，仅暴露其后肢。操作者用左手握住大鼠尾巴，右手进行推拿操作。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4．手指按压力记录。 一种用于记录手指按压力的大小和频率的装置，可在推拿操作过程中实时反馈力度与频率信息。(A) 压力传感器及传输设备。(B) 手指按压力记录结果。(C) 推拿操作过程中记录到的作用力。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 疼痛行为测试

1. 在建模前、建模后以及推拿干预后第1天（D1）、第7天（D7）、第14天（D14）和第21天（D21）检测疼痛行为，包括机械缩足阈值和足底缩足潜伏期测试。
2. 机械缩足阈值（MWT）
   1. 将大鼠置于一个尺寸为20 cm × 10 cm × 20 cm的透明钢化玻璃箱内，箱子放置在高40 cm、由孔径为10 mm × 10 mm金属丝网构成的平台上。保持室温为23 °C ± 2 °C。
   2. 在行为测试阶段，每天至少让大鼠在行为学实验室中适应2小时，以避免因动物在正式测试初期对环境不适应而干扰测试结果。在正式测试开始前，将大鼠提前30分钟放入实验室，以促进其环境适应，减少干扰因素。
   3. 使用电子Von Frey纤维丝测量MWT。将纤维丝刺激大鼠足底中心部位，当大鼠出现抬腿、躲避等明显动作时立即撤去纤维丝，仪器可自动记录此时的最大压力值（N）。
   4. 每次刺激后至少间隔15秒再进行同一只大鼠的下一次刺激。每次刺激持续时间不得超过5秒，以防止大鼠足部对触觉刺激产生敏化。重复测试5次，直至连续三次测量值之间的差异无显著性（在10 N以内）。
   5. 剔除差异较大的数值（最大值和最小值），取剩余三个数值的平均值作为机械缩足阈值。
3. 足底缩足潜伏期（PWL）
   1. 将大鼠置于一个尺寸为20 cm × 10 cm × 20 cm的透明钢化玻璃小隔间内，隔间顶部覆盖带通风孔的透明玻璃盖。保持放置隔间的透明玻璃板温度为28–30 °C。
   2. 每次正式测试前，让大鼠在此环境中至少适应30分钟。若大鼠在隔间内排尿或排便，应及时用吸水纸清理，以免影响后续的光照热传导。
   3. 将聚光灯聚焦于大鼠足底中心部位，按下开始按钮；当大鼠出现缩足或舔足等明显反应时，立即按下停止按钮，并记录此时的时间。聚光灯照射时间不得超过20秒，以避免对大鼠皮肤造成损伤。
   4. 同一只大鼠的下一次照射需至少间隔10分钟，以防止敏化。每只大鼠测量5次。
   5. 剔除差异较大的数值（最大值和最小值），取剩余数值的平均值作为PWL。

5. 样品制备

1. 按照 2.3.2.1 中所述方法对小鼠实施安乐死。
2. 滑膜组织制备
   1. 将大鼠仰卧位固定于泡沫板上，用注射器针头固定，右后肢呈外展及外旋屈曲状态。用手术剪夹起膝关节周围皮肤，剪开皮肤后继续剪开皮下筋膜，暴露大鼠膝关节周围的肌肉。
   2. 以髌韧带为解剖标志，剥离髌韧带上方的肌群。小心切开髌韧带止点（胫骨结节处），从下方轻轻上提韧带时即可观察到滑膜组织。
   3. 使用眼科剪小心剪下滑膜组织，用预冷的生理盐水冲洗去除血液和滑液。用洁净纱布吸干组织表面水分后，将滑膜组织置于4%多聚甲醛中固定至少48小时。
   4. 按照步骤 2.3.2.5–2.3.2.6 进行样本处理。评分操作参照步骤 2.3.2.7 进行。
3. 进行苏木精-伊红染色
   1. 使用二甲苯脱蜡，20分钟；更换新鲜二甲苯再处理20分钟；随后依次用无水乙醇处理5分钟，更换新鲜无水乙醇再处理5分钟，再依次加入体积分数90%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、70%乙醇5分钟，最后用蒸馏水处理5分钟。
   2. 将切片浸入苏木精染色液中染色3–8分钟。取出切片，用蒸馏水冲洗去除多余染液。转入分化液（1%盐酸酒精）约30秒，使切片颜色褪为淡蓝色。再次用蒸馏水冲洗，然后放入伊红染色液中染色1–3分钟。
   3. 用体积分数95%乙醇脱水5分钟，更换新鲜95%乙醇再脱水5分钟，随后用无水乙醇处理5分钟，更换新鲜无水乙醇再处理5分钟。
   4. 加入二甲苯透明5分钟，更换新鲜二甲苯再透明5分钟，最后用中性树胶封片。
4. 软骨组织末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测
   1. 将软骨样本依次在无水乙醇、90%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中脱蜡水化至完全。在PBS中浸泡5分钟。滴加3% H₂O₂，室温孵育10分钟。
   2. 滴加蛋白酶K工作液，37 °C消化10分钟。每张切片加入20 µL标记缓冲液以保持湿润，配制工作液后甩去多余液体。每张切片滴加20 µL工作液，在湿盒中37 °C孵育2小时。
   3. 逐滴加入50 µL封闭液，封闭30分钟。然后逐滴加入50 µL稀释的生物素化抗地高辛抗体（1:100稀释），在湿盒中37 °C孵育2小时。再逐滴加入10 µL SABC抗体稀释液（1:100稀释），在湿盒中37 °C孵育2小时。
   4. 滴加DAB显色液（试剂A、B、C各50 µL加入1000 µL蒸馏水中）10–15分钟。显色完成时呈现棕黄色颗粒状沉淀。
   5. 用苏木精复染3秒。经梯度乙醇脱水和透明处理后，室温干燥，小心用中性树胶封片，注意避免产生气泡或胶液溢出。
5. IL-1β 和 TNF-α 的免疫组织化学分析
   1. 常规使用二甲苯脱蜡，并经梯度酒精水化。用3% H₂O₂灭活组织切片中的内源性过氧化物酶。将切片架放入95 °C的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，在高于95 °C的水浴中孵育超过20分钟。取出孵育盒，室温静置至少20分钟。
   2. 加入5%正常山羊血清与PBS混合液，37 °C孵育10分钟，甩去多余液体。逐滴加入150 µL一抗，37 °C静置1小时，随后4 °C过夜孵育。次日于37 °C复温45分钟。
   3. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。在切片组织上覆盖3% BSA，37 °C封闭30分钟。逐滴加入150 µL二抗，室温孵育1小时。再次用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后逐滴加入150 pL DAB显色液。在显微镜下观察染色程度，直至样本肉眼可见呈棕黄色为止。
   4. 立即用PBS冲洗10分钟。复染苏木精，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
6. 统计学分析
   1. 免疫组织化学染色阳性表达的切片中，目标蛋白呈黄色或棕黄色。使用Image J软件对各组免疫组化切片的阳性表达强度进行评分，并采用平均光密度（AOD）作为评价指标，计算公式为积分光密度（IOD）除以面积。
   2. 使用统计分析软件进行数据分析。若数据符合正态分布，采用t检验；若不符合正态分布，则采用卡方检验和非参数检验。重复测量数据采用广义估计方程进行分析。

结果

疼痛行为测试
机械痛阈（MWT）结果显示，造模后右后肢的机械痛阈显著低于造模前（p<0.05）。与对照组相比，推拿干预后大鼠的机械痛阈显著升高（p<0.05；图5 和 表2）。

图5．机械缩足阈值测试结果（

讨论

本研究提供了对膝骨关节炎大鼠进行推拿操作的实验方案。通过疼痛行为学检测和组织形态学分析发现，对该类膝骨关节炎大鼠实施一系列推拿操作可减轻滑膜炎症和软骨细胞凋亡，可为在膝骨关节炎动物模型上开展推拿干预提供参考。

在实验方案中有几个关键步骤。首先，选择合适的诱导膝骨关节炎（KOA）模型的方法至关重要。诱导KOA模型的方法有多种，包括关节腔注射²⁵、关节内手术^26,27、关节制动法^28,29等。由于侵入性方法诱导的KOA模型会在关节周围留下伤口，可能干扰推拿手法的效果，因此我们选择了非侵入性的关节固定方法。关节固定法可分为过伸位固定和过屈位固定。Shang等人比较了这两种固定方式的效果，发现两者在软骨细胞凋亡方面的差异较小²³。然而，他们的实验对象是兔子，体型较...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Supelco	PHR1070	用于制备标本
ALMEMO 测量装置	ahlborn	2450-1	用于机械缩足阈值测试
抗地高辛抗体	Sigma-Aldrich	SAB4200669	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
抗IL-1β抗体	abcam	ab283818	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
DAB底物试剂盒	Solarbio	DA1010	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
义齿基托材料	上海新世纪	20000356	用于模型制作
伊红	bioswamp	PAB180016	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
指压力记录仪	苏州长欣光电科技	CX1003w	用于推拿操作
甲酸溶液	Sigma-Aldrich	695076	用于脱钙
H2O2	Sigma-Aldrich	386790-M	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
苏木精	bioswamp	PAB180015	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
异氟烷	上海玉研科学仪器有限公司	S10010533	用于气体麻醉
中性树脂	bioswamp	PAB180017	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
多聚甲醛固定液	Sigma-Aldrich	100496	用于组织学
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
足底测试仪	IITC Life Science	/	用于爪退缩潜伏期测试
石膏绷带	WANDE	20150023	用于模型制作
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	124568	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
肿瘤坏死因子α单克隆抗体	Proteintech	60291-1-Ig	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
TUNEL	Servicebio	GDP1042	用于HE染色、免疫组化或TUNEL
石蜡	Sigma-Aldrich	327204	用于制备标本
二甲苯	上海国药集团	100092	用于制备标本